Die Autoren bedanken sich bei Miriam Ester für Mückenbrut danken. Diese Arbeit wurde durch in-house Finanzierung aus dem Forschungszentrum Borstel unterstützt und trat Förderung durch die Leibniz-Zentrum Infektion.

Sicherheitsmaßnahmen und Ethikerklärung Die vorgestellten Studien hier Arbeit einzubeziehen mit dem menschlichen Erreger Mtb und der Nagetier-Malaria-Parasiten Plasmodium berghei (P. berghei). Experimente mit Mtb (Stamm H37Rv) und P. berghei müssen unter den entsprechenden Bedingungen der biologischen Sicherheit durchgeführt werden. Biosicherheitsstufe (BSL) 2 Labors sind für Nager Malaria-Parasiten wie P. erforderlich berghei und BSL 3 für Mtb und damit für alle Koinfektion Studien hierin beschrieben. HINWEIS: Mäuse, die mit Mtb nicht infiziert, die Infektion auf andere Mäuse in unmittelbarer Nähe zu verbreiten (eigene Beobachtung). Verteilt auf den Experimentator kann daher nicht ausgeschlossen werden, aber entsprechende Schutzkleidung muss in der BSL 3 Labor jederzeit getragen werden. Nach unseren Regeln, Experimentatoren tragen chirurgische Peelings, Haarnetze, Einweg-Atemschutzmasken und zwei Paar Handschuhe, von denen der äußere verworfen wird jederzeit eineeff aus dem Schrank herausgezogen. Neue werden auf, bevor sie in den Schrank wieder setzen. Zwei Container, eines mit 2% Buraton (HINWEIS: genehmigt, um andere Mtb inaktivieren Desinfektionsmittel können in der zugelassenen Konzentration verwendet werden) für flüssige und infektiösen Abfällen und eine für Oberflächenkontamination, sind vor dem Experiment vorbereitet und in den Schrank gelegt. Darüber hinaus werden Kunststoffbeutel für feste Abfälle noninfectious verwendet werden. Nach deutschen Regeln, die alle Arbeiten, die den Umgang und die Verarbeitung von Mtb Kulturen oder Gewebe von infizierten Mäusen abgeleitet Mtb muss in einem Klasse-2-Biosicherheitswerkbank in einem BSL3 Labor durchgeführt werden. Beim Umgang mit Mycobakterien, müssen Maßnahmen ergriffen werden, um die Erzeugung von Aerosolen zu vermeiden. Weibliche C57BL / 6 Mäuse (Charles River) zwischen 6-8 Wochen gealtert wurden für alle Experimente verwendet Koinfektion und unter bestimmten Bedingungen in Barriere BSL 3 Anlagen gehalten. Tierpflege und Experimente waren pein Übereinstimmung mit den Protokollen von der Ethikkommission für Tierversuche des Ministeriums für Landwirtschaft, Umwelt und ländliche Räume des Landes Schleswig-Holstein genehmigt rformed Zur Gewinnung von Malaria-Mücke Stufen wurden NMRI-Mäuse von Charles River Laboratory, Sulzfeld, Deutschland gekauft und unter spezifischen Pathogen-freien Bedingungen innerhalb der Universität Heidelberg Tiereinrichtung (IBF) gehalten. Alle Tierversuche wurden entsprechend den europäischen Vorschriften durchgeführt und von den staatlichen Behörden des Landes Baden-Württemberg (Regierungspräsidium Karlsruhe) zugelassen. 1. Aerosol-Infektion von Mäusen mit Mtb mit einem Glas-Col Aerosolkammer Der beste Weg, um die Aerosol-Infektion von Versuchstieren mit Mtb Standardisierung ist es, Mykobakterien aus gefrorenen Beständen mit bekannten CFU-Titer zu verwenden. Um Stammkulturen vorzubereiten, Kultur Mtb in Middlebrook 7H9-Bouillon mit OADC (Oleic ergänztSäure, Albumin, Dextrose, Catalase) Anreicherungsmedium und 0,05% Tween 80, eine Kohlenstoffquelle für Mykobakterien und messen, um bakterielle Verklumpung in der gleichen Zeit zu vermeiden. Kulturen sollte eine OD ≤ 1 haben zum Zeitpunkt der Ernte. Bei höheren OD, bakterielle Verklumpung Steigerungen und Rentabilität sinkt. Shop 1 ml Aliquots bei -80 ° C Bestimmung der Zahl der lebensfähigen koloniebildenden Einheiten (CFU) in gefrorenem Bestände durch Plattieren eine Reihe von 10-fachen Verdünnungen von drei unabhängigen Fläschchen auf 7H11-Agarplatten mit 0,5% Glycerin, 1 g / l Asparagin supplementiert, und OADC und aufzuzählen Kolonien nach 4 Wochen Inkubation bei 37 ° C. Führen Aerosol-Infektion, wie nachstehend beschrieben. <ol><li> Tauwetter Mtb Aktien von bekannten CFU-Titer und vorsichtig mischen die Suspension fünf Mal, um Bakterienklumpen zu zerstreuen mit einer 1-ml-Spritze mit einer 27 G-Nadel ausgestattet. Vermeiden Sie die Produktion von Aerosolen. </li><li> Abhängig von der gewünschten Infektionsdosis, übertragen Sie die erforderliche Volumen des Aktien Mykobakterien inEin 50 ml-Röhrchen mit sterilem PBS. Das Endvolumen beträgt 6 ml. Hinweis: Durch Variieren der Anzahl der Mikroorganismen in dieser Suspension der Anteil der tragenden Bakterien Aerosoltröpfchen variiert. Wir streben in der Regel einer Aufnahme von 100 lebensfähigen Bazillen pro Lunge (Niedrigdosis-Infektion). Nach unserer Erfahrung erfordert dies etwa 1-2 x 10 6 MTB / ml in einem Gesamtvolumen von 6 ml davon 5,5 ml vernebelt werden (siehe unten). Es wird empfohlen, eine Reihe von Versuchsaerosol Herausforderungen mit verschiedenen Konzentrationen von Bakterien zu tun, um die idealen Bedingungen für Ihre Infektion zu finden. Während Hochdosis-Infektionen mit bis zu 5.000 Mykobakterien kann getan werden, um die Geschwindigkeit des Infektionsprozesses, so wenig wie 5 Bakterien verwendet, um Mäuse zu infizieren erfolgreich durch Aerosol werden. Die Infektionsrate ist in der Regel 100%. </li><li> Entfernen einer ausreichenden Menge (über Endvolumen erforderlich hergestellt) für die Beschichtung um das Inokulum Titer zu bestimmen, haben wir normalerweise entfernen 500 ul technischer Triplikaten plattieren. </li><li> Zeigen Tiere inein Fächergitterkorb (eine Maus pro Korb) innerhalb der kreisförmigen Aerosolkammer und schließen Sie den Deckel der Aerosolkammer. HINWEIS: Andere Modelle sind mit einem tortenförmigen Korb von fünf Einzelfächer, die jeweils 20 Mäusen zusammenzubringen ausgestattet. </li><li> Befestigen Sie den Venturi-Vernebler Einheit zu den drei Edelstahl-Kugelgelenke. </li><li> Entfernen der mykobakteriellen Suspension aus dem 50-ml-Röhrchen mit einer 10-ml-Spritze mit einer 18 G Nadel stumpf angebracht und tragen die Spritze in der Aerosolkammer in eine geschlossene Transportbox. </li><li> Entfernen Sie den Schraubverschluss des Zerstäubers Einheit und sorgfältig spritzen die Mykobakterien Suspension in den Vernebler. Vermeiden Sie die Entstehung von Aerosolen. Entsorgen Sie die Spritze in einen Behälter für scharfe Gegenstände, die 2% Buraton. Verschließen Sie den Vernebler mit dem Schraubverschluss. </li><li> Schalten Sie den Hauptnetzschalter und der UV-Lampe. Die Anzeige auf der Steuertafel zeigt &quot;Glas-Col Apparat Co&quot;. </li><li> Drehen Sie den Programmschalter auf. Das Display wirdShow &quot;ist der Zerstäuber bereit?&quot; &quot;Ist der Korb eingelegt?&quot; Drücken Sie die Eingabetaste, wenn Sie fertig. &quot; Drücken Sie die Eingabetaste. </li><li> Das Display zeigt &quot;Enter rmen Zeit 900&quot;, das bedeutet, die Vorheizzeit für die Verbrennungsanlage (die die Abluft dekontaminiert) beträgt 900 Sekunden. Drücken Sie die Eingabetaste. </li><li> Das Display zeigt &quot;Enter Vernebelungszeit 1800&quot;, das heißt, die Zeit, Vernebeln 1.800 Sek. als Standard eingestellt ist. Um die Vernebelungszeit zu verlängern, geben Sie &quot;2400&quot;, und drücken Sie die Eingabetaste. HINWEIS: Während der Vernebelungszyklus, Druckluft zerstäubt die Aufhängung, wodurch kleine Aerosoltröpfchen Mykobakterien enthalten. Mit dem Hauptluftstrom, werden diese Tröpfchen (etwa 2-5 um Grße) in die Aerosolkammer durchgeführt. </li><li> Das Display zeigt &quot;Enter CD-Zeit 1800&quot;, das bedeutet, dass der Zerfall Zyklus dauert 1,800 Sekunden. Auf &quot;2400&quot;, und drücken Sie die Eingabetaste. HINWEIS: Während dieses Zyklus, Die Wolke, die gebaut wurde up in der Aerosolkammer während der Vernebelungszyklus kann zerfallen. Die kleinen Tröpfchen werden durch die Versuchstiere eingeatmet. </li><li> Das Display zeigt &quot;Enter Dezember Zeit 900&quot;, das bedeutet, dass das UV-Licht Dekontaminationszyklus 900 Sekunden dauern. Drücken Sie die Eingabetaste. Die Maschine startet Radfahren durch Vorwärmen, Vernebeln, Cloud-Zerfall und UV-Dekontamination. ACHTUNG: Die Vakuum-Durchflussmesser sollte anzeigen, 60 Kubikmeter / h (zu überprüfen, wenn Vorheizzyklus beginnt; anzupassen Unterdrucksteuerventil, wenn nötig) und die Druckluft-Durchflussmesser 10 Kubikmeter / h (zu überprüfen, wenn Vernebelungszyklus beginnt, entsprechend anzupassen Luftsteuerventil ). </li><li> Wenn der Zyklus abgeschlossen ist, wird das Tastenfeld zeigen &quot;Process Complete - entfernen Specimen&quot;. Schalten Sie das Programm, UV-und Hauptstromschalter. </li><li> Prüfen Sie, ob die Mykobakterien Suspension wurde komplett vernebelt worden, und wenn nicht, notieren Sie die verbleibende Volumen durch vorsichtiges Entfernen der Suspension mit einer entsprechenden Spritze mit eingebauteine 18 G stumpfen Nadel. Das Restvolumen ist nicht mehr als 1 ml betragen. </li><li> Nehmen Sie den Zerstäuber aus den Fugen und legen Sie sie in einer Pfanne mit 2% Buraton für mindestens 2 Stunden, ist in der Regel Desinfektions O / N. getan Anschließend übertragen Sie den Zerstäuber zu einem frischen Pfanne und gründlich mit Wasser abspülen. Lassen Vernebler an der Luft trocknen. </li><li> Öffnen Sie die Aerosolkammer und Rück Tiere in ihre Käfige. Tasche die Körbe in Autoklaven Taschen und Autoklaven. Wischen Sie die Oberflächen der Innenseite der Aerosolkammer mit 2% Buraton. HINWEIS: Aus Sicherheitsgründen sollte ein Gebläsefiltergerät während dieser Prozedur getragen werden. </li><li> Mit den verbleibenden 500 ul der Mykobakterien-Suspension (siehe Schritt 1.3) Platte 10-fach Verdünnungen eines technischen dreifacher Ausfertigung (3 x 100 ul) auf 7H11-Agar-Platten. </li></ol> 2. Stellen Sie sicher, Aufnahme von Wunsch CFU in Lunge Einen Tag nach der Aerosol-Infektion von Versuchstieren festzustellen, die bakterielle loAnzeige in den Lungen der Kontrolltiere bezeichnet, um die Aufnahme des gewünschten CFU zu überprüfen. HINWEIS: Wir bezeichnen in der Regel eine zusätzliche Gruppe von 3-5 Mäusen für Tag 1 CFU Bestimmung. Um den Verlauf der Mtb-Infektion im Laufe der Zeit zu überwachen, kann der Mykobakterien Gewebebelastung durch Plattierung serielle Verdünnungen der ganzen Organhomogenaten für CFU Bestimmung untersucht werden. Die Lunge ist der primäre Ort für Krankheitsmanifestation bei Tuberkulose jedoch Milz, der Leber und der Lymphknoten in der Regel entsprechend ausgewertet. Die Verdünnungen plattiert werden, hängt von der erwarteten mykobakteriellen Belastung in den Organen, die von der anfänglichen Inokulum (niedrige Dosis gegen hohe Dosis), die Erhöhung der Gewebe sowie auf das Organ und dem Zeitpunkt zu erhalten, um verschiedene bakterielle Belastungen hängen analysiert werden. Bei niedriger Dosierung Infektionen, die bakterielle Belastung von Mtb H37Rv in der Lunge der Regel erreicht ein Plateau zwischen Tag 25-30. <ol><li> Zeigen eingeschläfert Tiere (Euthanasie: CO 2-Erstickung oderTerminal Anästhesie) auf saugfähigem Papier auf einem Seziertisch Bord in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank und desinfizieren Mäuse mit 70% Ethanol. HINWEIS: 70% Alkohol ist nur für Oberflächenkontamination und wird nicht Mtb töten. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Mitte des Bauches und Einfahren der Maus Haut über dem Kopf. </li><li> Öffnen Sie den Bauch und den Brustkorb mit chirurgischer Schere und entfernen Sie die Brustwand, so dass die Lunge zugänglich sind. </li><li> Entfernen Sie die Lungen und übertragen in einen 15-ml-Tube mit Homogenisationspuffer (steriles Wasser / 1% v / v Tween 80/1% w / v Albumin). </li><li> Verwendung der Kolben einer 5 ml Spritze Stamm Lunge durch 100-um-Sieben in eine kleine Petrischale. </li><li> Flush Sieben mehrmals mit einer 1 ml-Pipette mit einer Barriere ausgestattet Spitze und verteilen Sie die Lungenhomogenat unter 8-Agar-Platten (ca. 250 ul / Platte;. Sicherzustellen, dass sie eine gut getrocknete Oberfläche haben). </li><li> Sorgfältig mit Einweg Treuer, die in 2% verworfen Platte der ProbenBuraton. </li><li> Lassen Agar-Platten im Schrank, um zu trocknen. Verschließen Sie jede einzelne Platte mit Parafilm, in Alufolie wickeln und Inkubation aufrecht bei 37 ° C für mindestens 4 Wochen. </li></ol> 3. Bau von Escape-Beweis Moskitokäfige Nager Plasmodium-Stämme sind nicht schädlich für den Menschen. Da jedoch Mtb-infizierten Mäusen sind die Empfänger des Parasiten und die Arbeit wird unter BSL 3 Bedingungen erfolgen, sind Maßnahmen erforderlich, um die Mücken aus ihren Käfigen entkommen zu verhindern. Abhängig von der geplanten Infektion Regime, autoklavierbar und wiederverwendbare Metallrahmen Käfigen oder selbstgemachte Einwegkäfige verwendet werden. Letztere sind zu empfehlen, wenn von Biss Infektion von Versuchstieren erforderlich ist, um durch eine definierte Anzahl von Mücken pro Maus durchgeführt werden. Wenn selbstgemachte Käfige benötigt werden, vorzubereiten Käfige genauen Spezifikationen wie die Gesundheit der Mücken und die Sicherheit des Labor hängt von ihrer sound Bau (Abbildung 2). <ol><li> Nehmen Sie einen Karton, wie eine halbe Portion Eis Karton oder Papier, Kaffeetasse (Abbildung 2). </li><li> Schneiden Sie eine kleine Öffnung in die Seite des Kartons und decken mit einer Doppelschicht aus Latex mit einem Schlitz in jedem Stück geschnitten, um einen sicheren Eingang für die Moskitos zu schaffen. HINWEIS: Die Öffnung hat eine Gesamtgröße von 2 cm x 2 cm, ist der Schlauch (Saugvorrichtung), die wir nutzen, um in zu bringen und / oder Take-out Mücken eine modifizierte 15 ml Falcon-Röhrchen mit einer Vakuumpumpe angeschlossen und dient somit als eine Saugvorrichtung mit einem Durchmesser von 1,5 cm. </li><li> Kleben Sie ein Stück Filterpapier auf der Innenseite Boden des Kartons zu tanken tropft. </li><li> Verschließen Sie Eisbecher mit Netz (Doppelschicht aus Nylon-Mesh-Größe 1 mm x 1 mm) und zu beheben, um den Karton mit Klebeband und Gummiband. </li><li> Für Infektionsversuche, bei denen definierte Anzahl von Mücken pro Maus erforderlich sind, bereiten Käfige mit 10-15 infizierten Mücken, enthält jede von denen idealerweise einen avschnittlich 10.000 Wildtyp-Speicheldrüse P. berghei Sporozoiten. </li><li> Idealerweise verhungern Mücken für 24 Stunden vor der Durchführung der Blutmahlzeit. </li></ol> 4. Malaria-Infektion von Mäusen durch Mückenstich Das Nagetier Malaria-Parasiten hier verwendet, ist P. berghei jedoch andere Nager Plasmodium-Stamm von Interesse verwendet werden. Um Infektions Mücken erhalten für Sporozoiten-Übertragung der gesamte Lebenszyklus des Parasiten ist in beiden Wirbeltierwirt (Maus) und der Mücke erhalten. Parasite Wartung wird in einem Insektarium durchgeführt. Für natürliche Übertragungsversuche, sollte die minimale Anzahl von Sporozoiten pro Speicheldrüse nicht weniger als 10.000 sein. Für detaillierte Protokolle über Parasiten Wartung verweisen wir auf Methoden in der Malaria-Forschung von Moll et al. 2013. <ol><li> Betäuben naiven Mäusen oder Tieren 40 Tage preinfected mit MTB mit Ketamin (100 mg / kg)und Xylazin (7 mg / kg)-Lösung durch intraperitoneale Injektion (200 &amp;mgr; l / Maus). HINWEIS: Die Zeit zwischen Mtb und Plasmodium-Infektion kann in Abhängigkeit von der zugrunde liegenden Fragestellung angepasst werden. Ebenso kann die Reihenfolge der Erreger Herausforderungen umgekehrt werden kann, dh Mäuse, um Infektionsmückenstich vor Mtb-Infektion ausgesetzt werden. </li><li> Zeigen betäubt Mäuse auf die Verrechnung der Moskitokäfige (eine Maus pro Käfig für Moskito definiert Moskito Maus-Verhältnis) und damit die Mücken durch die Membran für 10-15 min zu ernähren. HINWEIS: Die Anwesenheit von Blut in den Moskito Mut bedeutet, Fütterung und somit Sporozoiten-Übertragung. </li><li> Übertragen Mäuse wieder in ihre Käfige und überwachen ständig, bis sie aus der Narkose aufwachen. HINWEIS: Platz Mäuse auf Papiertuch und nicht auf Einstreu (Erstickungsgefahr) und warm halten (Ort eng zusammen und decken Körper mit Papiertuch). </li><li> Töte die Moskitos durch Besprühen mit 70% Ethanol oder andere Desinfektionsmittel durch die nettoten des Käfigs. Autoklav Käfige und verwerfen, wenn Einweg diejenigen eingesetzt wurden. </li></ol> 5. Überwachung Parasitämie <ol><li> Puncture Schwanzvenen ganz am Ende mit einer Nadel und sammeln ein Tropfen Blut an jedem Ende der Rutsche. </li><li> Verwenden Sie eine andere Folie, um einen Tropfen Blut mehr als die Hälfte der Länge des Objektträgers zu ziehen. Flip über dem Spreizer, um die andere Kante zum zweiten Abstrich zu verwenden. Die Objektträger an der Luft trocknen. </li><li> Giemsa-Färbung <ol><li> Legen Sie Folien in der Folienhalter und fixieren die Blutausstriche durch kurzes Eintauchen in absolutem Methanol. HINWEIS: Da die Verwendung von Glaswaren sollten mindestens in der BSL 3 gehalten wir Polypropylen Küvetten für alle Lösungen werden. </li><li> Tauchen Sie die Abstriche in Giemsa (1:10 in VE-Wasser). Nach 10 Minuten tauchen die Folien in die und aus der Färbung Küvetten mit VE-Wasser ein paar Mal gefüllt zu spülen die überschüssige Fleck. </li><li> Schließlich Luft trocknen Folien in einer senkrechten Position. </li></ol></li><li> ALTERNATIVE FLECK: Wright &amp; #180; s Fleck <ol><li> Auflösen Wright-Färbung bei einer Konzentration von 1 mg / ml in Methanol. </li><li> Filter durch Faltenfilter vor der Verwendung. </li><li> Tauchen Sie die Blutausstriche in Farblösung und Inkubation für 4 min (HINWEIS: Methanol-Fixierung von Abstrichen ist nicht notwendig, da die Farblösung Methanol basiert). </li><li> Durch Spülen Dias waschen in VE-Wasser, wie oben beschrieben und lassen gleitet an der Luft trocknen. </li><li> Sobald Giemsa / Wright-Färbung abgeschlossen ist, übertragen Sie leicht alle in eine Buraton haltigen Verfügung Topf verwendeten Reagenzien. </li></ol></li><li> Blutausstrich-Analyse <ol><li> Analysieren gefärbten Blutausstrichen durch Lichtmikroskopie bei einer 100-fachen Vergrößerung mit Ölimmersion. </li><li> Graf nicht infizierten und infizierten Erythrozyten in einem Bereich des Blutabstrich, wo Erythrozyten werden in einer Monoschicht angeordnet. </li><li> Um eine gut definierte Parasitämie zu erreichen, zählen mindestens 10 verschiedene Sichtfelder Anzeige eines Erythrozyten-Monoschicht. </li><li> Calculaß die relative Parasitämie (in%) durch Dividieren der Anzahl der parasitierten Erythrozyten durch die Anzahl der Erythrozyten und mit 100 multipliziert. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir beschrieben, wie Mäuse können produktiv mit Mtb und P. infiziert werden berghei über ihre natürlichen Infektionswege. Wir gelten bestehenden Infektion Protokolle, experimentelle Tuberkulose oder Malaria 13 12 studieren und vor kurzem verabschiedete sie Koinfektion zwischen Mtb und Plasmodium im Mausmodell ein zu studieren. Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Infektion ist die Übertragung von Krankheitserregern beiden an den gewünschten Zahlen. Mykobakterielle Aktien sollte nicht älter als 2 Jahre sein, weil sie im Laufe der Zeit verlieren die Lebensfähigkeit und die ursprünglich ermittelten Titer der Aktien wird wahrscheinlich nicht mehr genau. Als Ergebnis würde Infektion Dosen viel niedriger als erwartet. Daher sollte CFU Titer von Stammkulturen alle paar Monate bestimmt werden. Ebenso wichtig ist die standardisierte Anbau und die Erzeugung von Mtb-Aktien in den ersten Platz. Kulturbedingungen, wie z. B.mittel, Nahrungsergänzungsmittel, Zeit und Volumen sollte, um in der Lage, Daten aus Experimenten mit verschiedenen Aktien von Mtb vergleichen zu können standardisiert werden. Mykobakterien sind in der Regel während der Kultur verklumpen, daher ist es wichtig, den Kulturbedingungen halten standardisiert Ernte Bakterien in der gleichen Wachstumsphase und resuspendieren häufig während Aliquotieren. Sonst kann es eine große Variation in CFU-Titer und Infektions Ergebnis. Die Erzeugung des homogen infizierten Moskito Chargen ist ein weiterer kritischer Schritt. Da verschiedene Mücken auf jeder einzelnen Maus zuzuführen, ist es wichtig, daß alle für eine Infektionsexperiment verwendet Moskitos aus derselben Charge stammen, und dass nur diejenigen Chargen, in denen mehr als 90% der infizierten Moskitos verwendet werden. Das aktuelle Modell kann verwendet werden, um Immunreaktionen und Immunmodulation in einem Wirt Koinfektion durch Vergleich mit den Immunreaktionen in einzelnen infizierten Wirten zu sezieren werden. Wir können va geltenschiedenen etablierten Methoden wie Histologie, Immunhistochemie, Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellpopulationen oder PCR und ELISA zur Zytokin-und Chemokin-Erkennung, um die Gewebe oder Körperflüssigkeiten von Interesse. Es sollte beachtet werden, dass solche Mausmodelle weisen bestimmte Einschränkungen auf. Während die Mehrheit der Menschen mit Mtb infiziert entwickeln eine latente Infektion ohne Anzeichen klinischer Symptome entwickeln Mäuse eine chronische Erkrankung mit progressiven Lungenpathologie. Dennoch sind C57BL / 6 Mäusen relativ resistent gegen Mtb-Infektion und entwickeln sich nicht wie in der klassischen Granulome menschliche Tuberkulose-Patienten beobachtet. Als Ergebnis immunpathologische Reaktionen in der Maus nicht spiegeln weder latent noch aktive menschliche Tuberkulose-Krankheit entsprechend. Trotz der Diskrepanz zwischen latenten und chronischen Krankheiten bei Mensch und Maus haben Mäuse ausgiebig zu identifizieren und zu untersuchen Wirtsfaktoren, die Mtb-Infektion zu kontrollieren und sind wertvolle und unverzichtbare Werkzeuge zu untersuchen,Immunantwort bei Infektionskrankheiten. Wichtig ist, dass die Anfälligkeit für Mtb-Infektion variiert beträchtlich zwischen den üblicherweise verwendeten Inzuchtmausstämmen und anfälliger Stämme wie DBA oder C3H in Co-und Single-Infektionsstudien enthalten sein. Darüber hinaus, abgesehen von den hierin beschriebenen Erregerspezies, irgendwelche anderen Mycobacterium-Spezies von Interesse (zB klinische Isolate) verwendet werden. Ebenso, während keine einzige Malaria-Modell repliziert alle Aspekte der menschlichen Krankheit verschiedene Mausmodelle nicht ähneln die verschiedenen Aspekte der natürlich erworbenen menschlichen Malaria-Infektion. Zum Beispiel P. berghei ANKA und P. yoelii YM/17XL sind weitgehend untersucht Modelle der menschlichen (P. falciparum-induziert) schwerer Malaria, mit P. berghei ANKA ist als hervorragendes Modell für menschliche Gehirn Malari s 14,15 angesehen. P. berghei NK65 ist ein hervorragendes Modell für hyperparasitaemia und akuten Malaria-Anämie, und hat vor kurzemals ein experimentelles Modell für die Malaria-assoziierten akutem Atemnotsyndrom (ARDS MA-16) beschrieben. Mit dem beschriebenen Modell-Koinfektion, die wir vor kurzem zeigen konnte, dass die gleichzeitige P. berghei NK65 Infektion verschlimmert chronischen Tuberkulose ein. Neben der Verwendung von verschiedenen Nagetieren Malaria-Parasiten, kann die Reihenfolge und der Zeitpunkt der Infektion Ereignisse in Abhängigkeit von der zugrunde liegenden Fragestellung angepasst werden. In dem Gebiet, kann die gleichzeitige Plasmodium-Infektionen bei der MTB-Infektion vorliegt oder nachträglich erworben sein. In beiden Szenarien können die Immunantwort auf Mtb und Plasmodium unterschiedlich betroffen sein. Daher können Mäuse mit Plasmodium-Sporozoiten entweder vor oder nach Mtb-Infektion infiziert werden. Darüber hinaus können Mäuse zu verschiedenen Zeiten herausgefordert werden verfassen Mtb-Infektion, um die Auswirkungen des Plasmodium-induzierten Immunantwort auf akute gegen chronische bewertenTuberkulose. Wichtig ist, bei der Auswahl eines Malaria-Parasiten für die Untersuchung Malaria-Tuberkulose-Koinfektion, sollte man sich bewusst sein, dass einige Nager Plasmodium-Stämme verursachen akute Krankheit in bestimmten Mausstämmen und erliegen Infektion innerhalb weniger Tage oder Wochen, während Mtb verursacht chronische und lang anhaltende Infektionen bei immunkompetenten Mäusen. Daher ist das Timing der Koinfektion, um eine vorzeitige Tod der Versuchstiere vermieden entscheidend. Die Modulation der Wirtsimmunität durch gleichzeitige Infektion mit mehreren Erregerspezies bleibt kaum verstanden. Unsere experimentellen Koinfektion Modell bietet ein leistungsstarkes Werkzeug, um Mycobacterium untersuchen - Plasmodium Interaktion mit dem Immunsystem eines Host-Koinfektion und wird zu unserem Verständnis, wie Koinfektionen können Pathogenese, Krankheitsverlauf, Impfungen, Immundiagnostik und Therapie beeinflussen beitragen.

Bevölkerungs selten nur ein Pathogen ausgesetzt. Besonders in Regionen mit hoher Inzidenz von Infektionen wie Afrika südlich der Sahara, Co-Infektionen stellen eine erstklassige, aber sehr unterschätzte Problem der öffentlichen Gesundheit. Tuberkulose und Malaria sind die häufigsten bakteriellen und parasitären Infektionen beim Menschen bzw. und weiter auf die Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei der verarmten Bevölkerung in den Tropen zu sein. Trotz der großen geografischen Überschneidungen zwischen Tuberkulose und Malaria und der großen Anzahl von Personen in Gefahr Koinfektion wird sehr wenig über die Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen und oft entgegenImmunRegulaToren und Effektoren gleichzeitig gegen Malaria-Parasiten und Tuberkelbazillen in coinfected Einzelpersonen ausgelöst bekannt. Nagetier-Modelle von Mischinfektionen ermöglichen Charakterisierung Differenzimmunreaktionen gegen verschiedene Krankheitserreger in einem Wirt, damit Licht auf die gegenseitige Einflussflusst Modulation Pathologie und klinische Ergebnisse der einzelnen Krankheit, die auch helfen, neue Empfehlungen für die Therapie und Prävention identifizieren. Wir haben ein experimentelles Mausmodell, das es uns ermöglicht, die Auswirkungen durch die gleichzeitige Infektion mit Mycobacterium tuberculosis (Mtb) verursacht und Nagetier Plasmodium-Arten innerhalb der gleichen Host 1 zu untersuchen etabliert. Wichtig ist, die natürlicherweise erworbene Infektionen beim Menschen möglichst genau nachzubilden, unser Modell implementiert die natürlichen Infektionswege von beiden Erregern eingesetzt. Tuberkulose ist eine Tröpfcheninfektion, die somit offenbart in erster Linie in der Lunge. Der Erreger wird Mtb von Menschen mit aktiver Erkrankung über die Aerosol-Weg übertragen, wenn sie infektiöse Aerosol-Tröpfchen beim Husten oder Niesen zu vertreiben. So ist Aerosol-Infektion die Methode der Wahl, um die natürliche Infektion zu imitieren. Erzeugung von Schwebeteilchen Mtb enthalten, können durch die Verwendung erreicht werden,einer Inhalationsbelichtungssystem. Diese Ganzkörperexposition auszusetzen Kammer ermöglicht Versuchstieren zu Mtb-haltigen infektiösen Aerosol-Tröpfchen (Abbildung 1), die in die Alveolen der Lunge, wo Infektion eingeleitet 2 eingeatmet werden. Malaria auf der anderen Seite ist eine Vektor-übertragene Krankheit, die durch Protozoen, apicomplexan Parasiten Plasmodium, die natürlich durch den Stich der Anopheles-Mücke eine weibliche übertragen wird. Während der Blutmahlzeit, sind infektiöse Sporozoiten unter dem Host Haut abgelagert und anschließend erreichen die Leber über die Blutbahn. Innerhalb Hepatozyten entwickeln sie sich rasch vermehren und in Leberstadium Schizonten. Schließlich reifen Schizonten Bruch und lassen Tausende von pathogenen ersten Generation Merozoiten in den Blutstrom, wo sie eine progressive Zyklus der roten Zellinvasion, Replikation, rote Zellbruch und Reinvasion 3 einzuleiten. Der Lebenszyklus von Plasmodium Continues wie einige Merozoiten entwickeln sich zu den sexuellen Parasitenstadien, die männlichen und weiblichen Gametozyten, die durch Mücken während der Blutmahlzeiten eingenommen werden kann. In der Mücke entwickeln Plasmodium Sporozoiten in Oozysten mit Wohnsitz in der Mückendarm und schließlich in die Speicheldrüsen zur Weiterleitung in ein anderes Wirts 3,4 migrieren. Während in experimentellen Tiermodellen die Lieferung von Mtb über die Aerosol-und damit wichtigste Route ist sehr verbreitet, viele experimentelle Nagetier Plasmodium Infektionsstudien einschließlich Studien über Malaria-Tuberkulose-Koinfektion 5-7 wurden durch Infektion von Mäusen mit Parasiten befallenen Erythrozyten, wodurch geführt um Blut-Stufen-Malaria-Infektion unter Ausschluss der klinisch-silent Leberstadium-Phase. Die Leber ist jedoch eine obligatorische Etappe Schritt während der Infektion und relevant für Anti-Plasmodien Immunität 11.08. Wir halten es daher wichtig, die Leber enthalten phase der Malaria-Übertragung und Wartung in Studien sowohl Malaria und Malaria-Tuberkulose-Koinfektion auf. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass natürlich übertragen Sporozoiten sind ansteckender als diejenigen, die über 12 Nadel-Infektionen, die uns aufgefordert, die Malaria-Infektion durch Mücken anstelle der Injektion von isolierten Speicheldrüse abgeleitet Sporozoiten etablieren Biss übertragen. Der einzige Weg, um infektiöse Mücken für natürliche Übertragung von Malaria-Parasiten zu erhalten, ist der gesamte Lebenszyklus des Parasiten sowohl in der Wirbeltierwirt (hier Maus) und der Mücke zu erhalten. So ist der Zugang zu einem Insektarium für Parasiten Wartung, um natürlichen Übertragung durch Biss führen unvermeidlich. Unsere hier beschriebenen Protokoll wurde entwickelt, um zu untersuchen, wie Plasmodium Sporozoiten Koinfektion mit Auswirkungen auf die chronische Tuberkulose ein. Um dies zu tun, werden die Mäuse infiziert Aerosol mit M. Tuberkulose und 40 Tage später, als M. Tuberkulose-Infektion der chronischen Phase erreicht hat, Mäuse, um Malaria-Infektions Mücken ausgesetzt. Das Ergebnis der beiden Malaria und Tuberkulose in den coinfected Tiere können durch die Überwachung des Blut Parasitämie und bakterielle Belastung im Gewebe, jeweils gefolgt werden. In unserem Protokoll, werden wir im Detail, wie Mäuse mit beiden Erregern infizieren, über ihre natürlichen Infektionsweg und wie man erfolgreiche Übertragung von Krankheitserregern bestätigen zu beschreiben. In unseren Händen, ist die allgemein erreicht Infektionsrate für beide experimentellen Infektionen 100%. Diese Protokolle können angewendet werden, um beide Infektionen getrennt oder, wie wir, zu modellieren und zu studieren Koinfektion zwischen zwei der schwierigsten menschlichen Infektionskrankheiten zu studieren. Dieses Modell ist auch auf andere Mycobacterium und Nagetier Plasmodium-Arten über die in diesem Protokoll beschriebenen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="650">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Buraton</td>
			<td style="width:124px;">Sch&#252;lke</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;">active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Middlebrook 7H9&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M0178</td>
			<td style="width:191px;">For Mtb broth cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Middlebrook 7H11&#160;</td>
			<td style="width:124px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">283810</td>
			<td style="width:191px;">Agar medium for Mtb culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Middlebrook OADC enrichment medium</td>
			<td style="width:124px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">212240</td>
			<td style="width:191px;">Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Staining Dish</td>
			<td style="width:124px;">Science Services</td>
			<td style="width:119px;">E62542-12</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">24-Slide Holder w/Handle</td>
			<td style="width:124px;">Science Services</td>
			<td style="width:119px;">E62543-06</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution</td>
			<td style="width:124px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">109204</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wright&#180;s stain</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">W0625</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inhalation Exposure System</td>
			<td style="width:124px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nebulizer-Venturi</td>
			<td style="width:124px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ice cream cups</td>
			<td style="width:124px;">H&#228;agen-Dazs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;">Used as mosquito cages</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metal-frame mosquito cages</td>
			<td style="width:124px;">BioQuip Products</td>
			<td style="width:119px;">1450A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an experimental model to study tuberculosis-malaria coinfection upon natural transmission of mycobacterium tuberculosis and plasmodium berghei

Koinfektionen natürlich aufgrund der geografischen Überschneidungen von verschiedenen Arten von pathogenen Organismen vorkommen. Concurrent-Infektionen wahrscheinlich modulieren die Immunantwort auf jeweiligen einzelnen Erreger und kann dadurch Pathogenese und Krankheitsverlauf beeinflussen. Koinfektion Patienten können auch unterschiedlich reagieren auf anti-infektiöse Interventionen. Koinfektion von Tuberkulose durch Mykobakterien und dem Malaria-Parasiten Plasmodium, die beide coendemic sind in vielen Teilen Afrikas südlich der Sahara, verursacht hat, nicht im Detail untersucht. Um die Herausforderung, aber wissenschaftlich und klinisch sehr relevante Frage, wie Malaria-Tuberkulose-Koinfektion modulieren Wirtsimmunität und der Verlauf der jeweiligen Krankheit, ein experimentelles Mausmodell, dass wir die ausgelöste Immunantwort auf Krankheitserreger sowohl in der Host-Koinfektion sezieren ermöglicht haben wir nähern . Zu beachten ist, um die meisten genau Mimik natürlich erworbenen Infektionen beim Menschen führen wir experimentelleInfektionen von Mäusen mit beiden Krankheitserregern durch ihre natürlichen Infektionswege, dh Aerosol-und Mückenstich auf.

Infektion von Mäusen mit MTB und P. berghei über den natürlichen Weg, dh Aerosol-und Mückenstich bzw. Ergebnisse in konsistente und reproduzierbare Infektion aller Tiere (Tabelle 1) ein. Wir können erfolgreiche Infektion und den Verlauf der beiden Malaria und Tuberkulose durch die Bestimmung der anfänglichen Auftretens (Präpatenz) und Anzahl der Parasiten im Blut (P. berghei Parasitämie) und die Last der Mtb in verschiedenen Organen bzw. zu überwachen. Ein Beispiel für die erfolgreiche Übertragung von Malaria-Parasiten infektiösen Mückenstich ist in Tabelle 1 und Fig. 3 gezeigt. Fütterung von 10 Sporozoiten-infizierten Mücken auf jeder Maus führte zu einer 100%-Infektionsrate als durch die Anwesenheit von Blutstadium-Parasiten 4-5 Tage später (Tabelle 1 und Abbildung 3A) bestätigt. Wichtig ist, finden wir ähnliche Parasitenzahlen im Blut von einzelnen Mäusen des gleichen experimentellen group, was darauf hinweist, dass die Sporozoiten-Übertragung durch Mückenstich führt zu einer konsistenten und reproduzierbaren Infektion. Durch den Vergleich der Präpatenz in naiven Kontrollmäusen mit der in Mtb-Koinfektion Tieren, können wir sehen, dass Präpatenz leicht bei Mäusen, die mit Mtb (Tabelle 1, Abbildung 3B) preinfected worden war verzögert ein. Wie wir bereits berichtet 1, können wir den Einfluss von Mtb Koinfektion auf den Verlauf der Malaria durch tägliche Überwachung Parasitämie im Giemsa-gefärbten Blutausstrichen bestimmen, wie in Fig. 3B gezeigt. Infektion von Mäusen mit Mtb durch die Verwendung eines Inhalationssystems führt erfolgreiche Abscheidung von Bakterien in den Lungen, die mit relativ geringen Schwankungen zwischen den einzelnen Mäusen (Fig. 4A). Wir können Mykobakterien Lasten in die Lunge und andere Organe von Interesse im Laufe der Zeit durch CFU Bestimmung zu folgen. Ein Beispiel für die mycobakterielle Last in LungenMtb-infizierten C57BL / 6 Mäusen in Abwesenheit oder Anwesenheit von P. berghei wird in 4B gezeigt. Tabelle 1. Präpatenz nach Sporozoiten-Übertragung durch Mückenstich. Alle Mäuse nach Natur Übertragung von P. entwickelten Blut-Stufen-Infektionen berghei Sporozoiten durch Mückenstich. 1 PLoS ONE, 7 (10), e48110 mit Genehmigung angepasst. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Experimentelle Mausgruppe (C57BL / 6) </td><td> Fordern Sie von 10 Infektionsmückenstiche </td><td> Anzahl der Blutstufigen positiven Tiere / Anzahl der Tiere pro Gruppe </td><td> Mittlere Präpatenz [d] </td></tr><tr><td> naiv </td><td> P. berghei </td><td> 7/7 </td><td> 4,4 </td></tr><tr><td> Mtb infiziert </td><td> P. berghei </td><td> 7/7 </td><td> 5,5 </t<html> d&gt; </tr></tbody></table><img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Insgesamt Schema der Versuchsdurchführung. C57BL / 6 Mäuse sind Mtb-haltigen Aerosoltröpfchen in einer Glas-Col Aerosolkammer ausgesetzt. Einen Tag nach Infektion des wird die Aufnahme von Mtb von CFU-Analyse der Lunge nachgewiesen. 40 Tage nach der MTB Challenge (bei ​​Tuberkulose chronisch geworden in infizierten Mäuse) werden die Tiere ausgesetzt P. berghei infizierten Mücken. Um zu bestätigen, erfolgreiche Sporozoiten-Übertragung und den Kurs der Plasmodium-Infektion folgen, wird Parasitämie täglich in Giemsa-gefärbten Blutausstrichen ab 3 Tage nach dem Mückenstich überwacht. / Files/ftp_upload/50829/50829fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50829/50829fig2.jpg &quot;/&gt; 2. Skizze einer Mücke Käfig. Infektions Mücken sind in einem Karton, wie eine halbe Portion Eis Karton enthalten sind. Eine kleine Öffnung in der Seite der Schachtel geschnitten und mit einer Doppelschicht aus Latex mit einem Schlitz in jedem Stück geschnitten, um einen sicheren Eingang für die Moskitos schaffen bedeckt. Ein Stück Filterpapier ist auf der Innenseite Boden des Kartons zu tanken tropft aufgezeichnet. Eiscremebecher mit Geflecht (Nylon-Netz), das an dem Karton durch ein Band und elastisches Band befestigt wird geschlossen. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3.jpg" /> 3. Blut Parasitämie. A) Beispiel für ein Wright `s Bunt Blutausstrich zeigt parasitierten Erythrozyten (Maßstabsbalken, 20 &amp; #181;. M) B) Parasitämie in Mäuseblut wurde durch die Analyse von Tages Giemsa-gefärbten Blutausstrichen überwacht. Koinfiziert Mäuse eine verringerte Parasitämie im Vergleich zu Plasmodium einzigen infizierten Mäusen (n = 10); Ergebnisse sind dargestellt als Mittelwerte ± SD, *** p &lt;0,001. 1 PLoS ONE, 7 (10), e48110 Nachdruck mit freundlicher Genehmigung. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4.jpg" /> 4. Nachweis von Mtb in der Lunge. C57BL / 6 Mäuse wurden mit 100 CFU Aerosol MTB herausgefordert bzw. 40 Tage später Koinfektion mit P. berghei durch Mückenstich. A) Einen Tag nach der Aerosol-Infektion die Aufnahme des gewünschten Anzahl von Mtb wurde durch Ausplattieren ganze Lungenhomogenaten für CFU Bestimmung verifiziert. B) Bakterienl Belastungen bei der Koinfektion wurden Lungen Lysaten von 3 Mäusen über KBE-Analyse (Mtb d40/d0) bestimmt. 12 Tage nach Koinfektion wurden Lungen Lysate für CFU-Analyse, um die Auswirkungen von Plasmodium-Koinfektion auf Mtb Steuer bestimmen plattiert. Beachten Sie, dass Mtb Zahlen in der Lunge erhöhte sich im Co-Infektion mit P. berghei NK65. X-Achsenbeschriftung: Zeit nach Mtb -infection/time nach Koinfektion. 1 PLoS ONE, 7 (10), e48110 mit Genehmigung angepasst.

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An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberkulose und Malaria sind zwei der häufigsten Infektionen bei Menschen und die Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei der verarmten Bevölkerung in den Tropen. Wir gründeten eine experimentelle Modellsystem, um Ergebnisse der Malaria-Tuberkulose-Koinfektion bei Mäusen nach der Infektion mit beiden Erregern über ihre natürlichen Infektionsweg zu studieren.

Eine experimentelle Modell zum Studium Tuberkulose-Koinfektion auf Natur Malaria Übertragung von Mycobacterium tuberculosis Und Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

an-experimental-model-to-study-tuberculosis-malaria-coinfection-upon

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

19.7K Aufrufe.  University Hospital Heidelberg.  Tuberkulose und Malaria sind zwei der häufigsten Infektionen bei Menschen und die Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei der verarmten Bevölkerung in den Tropen. Wir gründeten eine experimentelle Modellsystem, um Ergebnisse der Malaria-Tuberkulose-Koinfektion bei Mäusen nach der Infektion mit beiden Erregern über ihre natürlichen Infektionsweg zu studieren. 

Serie: An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Probenvorbereitung von<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extrakte für Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Wachstum von Mycobacterium tuberculosis Biofilme

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Infektion Modell zum Studium<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; HIV-1-Wechselwirkungen in primären menschlichen Monozyten abgeleitete Immunzellen

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infizierte Mäuse

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Der Nachweis eines multiresistenten<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Verstärkung Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

A Novel Microdissection Ansatz zur Wiederherstellung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Spezifische Transkripte aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Lung Granulome

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Ein 3D-humanem Lungengewebe Modell für funktionelle Studien auf<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infektions

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Mycobacterium Tuberculosis in Mäusen mit Reporter Enzym Fluoreszenz Imaging

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...