Die MRC-LMB-Kristallisation-Anlage wird freundlicherweise unterstützt vom Medical Research Council (UK). Mitgliedern des LMB für ihre Unterstützung danken wir: Olga Perisic (PNAC), Tony Warne, Fusinita Van Den HNO und Pat Edwards (strukturelle Studien), Steve Scotcher und die anderen Mitglieder der mechanischen Werkstatt, Neil Grant und Jo Westmoreland (Sehhilfen), Paul Hart und Tom Pratt (es). Wir möchten auch für Steve Elliot (Tecan, UK), Mitchell Stuart und Heather Ringrose (Hamilton Robotics, UK), Paul Thaw, Robert Lewis und Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, Schweiz), George Stephens und Donald Ogg (Alphabiotech, danke! (UK), Neil Williams (Markem Imaje, UK) und Graham Harris (The Cleveland Agency) für technische Hilfe.

(1) die zwei vollautomatische Systeme (erste Sichtung)
<ol><li>
System 1: Vorbereitung der 72 96-Well-Kristallisation Platten gefüllt mit screening-Kits (LMB-Platten)
	<ol>
<li>Sicherzustellen Sie vor der Durchführung des Verfahrens, dass das System Roboter initialisiert werden und ihre controlling-Software geöffnet. Schalten Sie den Kühler des Trägers Rohr-Kühlung ca. 30 Minuten bevor das Hauptprogramm gestartet wird.</li>
		<li>Legen Sie eine Testplatte auf dem motorisierten SBS-Träger der Platte Sealer. Führen Sie die Platte Versiegelung und überprüfen Sie, dass der Film richtig angewendet wird. Wiederholen Sie diesen Test noch zweimal, um sicherzustellen, dass die Platte Sealer bereit ist.</li>
		<li>Fügen Sie 20 L deionisiertes Wasser in den wichtigsten Behälter des flüssigen Handlers. Trennen Sie die Kupplung-Einsätze aus dem kleinen Behälter (20 % Ethanol Spüllösung) und schließen Sie die Einsätze an den Hauptcontainer.</li>
		<li>Geben Sie den entsprechenden Benutzernamen (Tabelle 1) auf dem Inkjet-Drucker-Touchscreen. Dann öffnen und Schließen der Karussell-Tür, um die Karussell-Drehung auslösen. Öffnen Sie die Tür, wenn der erste Stapel sich darbietet.</li>
		<li>Vollständig zu laden, den ersten Stapel mit 22 Kristallisation Platten, jeweils mit Spalte 1 nach unten heraus. Geladen Sie vollständig die nächsten zwei Stapel auf die gleiche Weise.</li>
		<li>Die restlichen 6 Platten in den höchsten Positionen im vierten Stapel zu laden. Schließen Sie dann die Karussell-Tür.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass der Kühler 14 ° C Anzeige. Kehren Sie sanft und immer wieder die ausgewählten Screening-Kits für 1 Minute. Öffnen Sie die Frontplatte des flüssigen Handlers.</li>
		<li>Öffnen Sie die Rohre und legen Sie sie in der Kühlung Träger nach der 96-Well-Standardlayout (A1, A2 usw.). Setzen Sie durch das platzieren jedes Rohr im Träger ihre Deckel auf einem Tablett in der gleichen 96-Well-Layout.</li>
		<li>Cross-Check das Rohr positioniert und sicherzustellen, dass alle Rohre Niveau sind und ließ sich in den Träger. Schließen Sie dann die Frontplatte.</li>
		<li>Wählen Sie im Fenster 'Startup' der liquid Handler-Software "Run Instandhaltung" und öffnen Sie das Spülprogramm. Führen Sie das Programm, das 20 % Ethanol aus dem System zu spülen und die Außenseiten der Flüssigkeit-Abgabe Tipps zu waschen.</li>
		<li>Wenn Spülung abgeschlossen ist, klicken Sie auf 'Abbrechen', um zum "Startup" zurückzukehren. Wählen Sie "Ausführen ein bestehenden Prozesses" und klicken Sie auf "Start Ihrer Auswahl". Öffnen Sie das Programm "MRC Kit Dosieren". Füllen Sie in "18", "Instanzen" in der Konfiguration Bildschirm und führen Sie das Programm.</li>
		<li>Überwachen Sie das System, wie die ersten vier Platten beschriftet, gefüllt und versiegelt sind.</li>
		<li>Sobald alle 72 Platten vorbereitet und wieder in das Karussell gelegt wurden, wechseln Sie die Kupplung Einsätze aus den Hauptcontainer in den kleinen Behälter. Führen Sie das Programm "Start up Flush" (siehe Schritt 1.1.10).</li>
		<li>Schalten Sie den Kühler und entsorgen Sie die leere screening Kit Rohre. Entfernen Sie vorsichtig die 72 vorbereiteten Platten aus dem Karussell. Entsorgen Sie nicht korrekt ausgefüllt oder schlecht abgedichtet Platten. Speichern Sie die Ready-to-Use-Platten bei 10 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
System 2: Einrichten von Kristallisation Tröpfchen (100 nL Protein + 100 nL Zustand) aus einer einzigen Probe in 20 LMB-Platten
	<ol>
<li>Zunächst sicherstellen Sie, dass das System Roboter sind auf Nanoliter-Dispenser mit seiner offenen Software initialisiert wird und der liquid Handler-Methode-Manager geöffnet wird. Schalten Sie die Reaktionscup Kühlung Träger etwa 15 Minuten, bevor das Hauptprogramm gestartet wird.</li>
		<li>Legen Sie eine Testplatte auf dem motorisierten SBS-Träger der Platte Sealer. Laufen Sie die Platte Sealer und überprüfen Sie, ob die Platte richtig abgedichtet ist. Testen Sie die Platte Sealer dreimal.</li>
		<li>Führen Sie dann Nanoliter Dispenser 100 nL Tropfen der Probelösung in einer Testplatte legen. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, dass die Tröpfchen korrekt eingestellt sind. Schließen Sie die Nanoliter-Dispenser-Software und entfernen Sie den Filmstreifen-Halter Block aus dem Deck.</li>
		<li>Legen Sie als nächstes in die speziell angefertigte Kennzeichenhalter ( Vertreter Ergebnissesehen: Kristallisation Geräte entwickelt, bei der LMB) der LMB-Platte mit der höchsten relativen Menge an flüchtigen Reagenzien in seinen Bedingungen (Tabelle 1). Entfernen Sie die Klebefolie von der Platte.</li>
		<li>Öffnen Sie die Frontplatte liquid Handler und platzieren Sie die unversiegelte Platte auf dem Deck, auf der Rückseite der erste Schiebe Carrier (Träger rutschen kann herausgezogen werden zur Erleichterung des Zugangs).</li>
		<li>Die Platte mit einem SBS-Aluminium-Deckel abdecken. Den Deckel in Richtung der hinteren linken Ecke des Trägers durch sanften Druck auf die gegenüberliegende Ecke des Deckels zu begleichen.</li>
		<li>Entsiegeln, laden in den verschiebbaren Trägern und decken die restlichen 19 Tafeln auf die gleiche Weise, am wenigsten flüchtige Bedingungen arbeiten. Sobald die Reaktionscup Kühlung Träger bei 4 ° C, ist wie durch ein grünes Licht, entfernen Sie seine Abdeckung.</li>
		<li>Schneiden Sie den Deckel von einem Reaktionscup mit (mindestens) 440 µL Protein Probe (Tabelle 2). Sicherstellen Sie, dass die Probe kein Schaum über den Meniskus, wie dies mit der flüssigen Detection System stören. Legen Sie das Rohr in Position 1 des Trägers Reaktionscup Kühlung.</li>
		<li>Legen Sie eine PCR-Platte auf der liquid Handler Deck vor der Platte verschieben Adapter Träger. Schließen Sie dann die Frontplatte.</li>
		<li>Nach dem Laden des Decks, sicherzustellen Sie, dass Nanoliter Dispenser Deck des Filmstreifen-Halter Blocks klar ist und die Träger auf der Rückseite der 50 µL-Tipp-Stacks von SBS Aluminiumdeckel klar sind.</li>
		<li>Wählen Sie in der liquid Handler "Methode" Verwaltungsoberfläche "Setup Platten". Die Initialisierung der beiden Systeme zu überwachen und die geführten Parameter ausfüllen. Befolgen Sie die Richtlinien der Methode Management Schnittstelle (Eingabeaufforderungen, Figuren und ein Tipp-Management-System bei der Vorbereitung helfen).</li>
		<li>Vergewissern Sie sich, dass alle erforderlichen Komponenten sind bereit, und starten Sie dann den Vorgang.</li>
		<li>Überwachung des Systems wie Nanoliter Dispenser die Tropfen in der ersten Platte setzt und Platte Sealer danach die Platte versiegelt.</li>
		<li>Sobald alle 20 Platten mit Kristallisation Tröpfchen vorbereitet und automatisch an die gleitenden Träger zurückgegeben wurden, öffnen Sie die Frontplatte und entfernen Sie vorsichtig die Platten. Überprüfen Sie, dass die Platten richtig abgedichtet sind, vor dem Speichern zur Kristallisation.</li>
		<li>Reinigen Sie die SBS-Deckel mit einer 20 % Ethanol-Lösung vor dem Stapeln sie auf der linken Seite des liquid Handler für die Lagerung. Entsorgen Sie die PCR-Platte und die Reaktionscup.</li>
		<li>Schalten Sie die Reaktionscup Kühlung Träger und wischen Sie die Kondensation. Lassen Sie ein Papiertuch auf der kühleren Oberfläche Kondenswasser aufzunehmen. Dann bringen Sie die Träger-Abdeckung und schließen Sie die Frontplatte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Optimierung der Bedingungen
<ol><li>
Spritze-basierte liquid Handler: Herstellung von zwei linearen Gradienten der Konzentrationen in den Stauseen der Kristallisation Platte (4-Ecken-Methode).
	<ol>
<li>Zunächst sicherstellen Sie, dass der liquidere Handler eingeschaltet ist und mit seiner offenen Software initialisiert.</li>
		<li>Auf der "GRADIENT" Registerkarte: Öffnen Sie das gewünschte Programm, wählen Sie die Kristallisation Plattenart und das Endvolumen in den Stauseen (Tabelle 3). Die erweiterte Einstellung für 'max Schuss Vol' von 6.000 auf 3.000 gesenkt werden sollte, bei der Verwendung von Lösungen mit [Isopropanol] > 10 % V/V und [MPD] > 20 % V / v
</li>
		<li>Vorbereiten der Spritzen. Einen Kolben in jeder Spritze (Spitzen enden nach unten) und schieben Sie die Rückseite der Spritzen in die dafür vorgesehenen Nuten unter dem Roboterkopf. Drehen Sie eine Spritze im Uhrzeigersinn, um es in Stellung blockiert (das Programm startet nur mit allen erforderlichen Spritzen richtig angeschlossen).</li>
		<li>Bereiten Sie die Tröge. Entfernen Sie der Edelstahl-Rahmen, und fügen Sie die Tröge. Die 4 Positionen auf der linken Seite entsprechen den 4 Ecken A, B, C, D. Umstellung auf "SET UP" Registerkarte "die zeigt die Volumen der erforderlichen Lösungen in jede Spritze (auf Tabelle 3, 0,5 mL Totvolumen auf die Volumes angezeigt, hinzugefügt wurde). Gießen Sie die Eck-Lösungen in ihre jeweiligen Tröge und setzen Sie den Rahmen wieder auf das Deck (der Rahmen hält in Position mit 2 kleinen Magneten befindet sich an der Vorderseite des Decks). Eine alternative Möglichkeit, fahren mit diesem Schritt soll die Lösungen in die Tröge gießen, wenn sie bereits auf dem Deck platziert werden.
</li>
		<li>Platzieren Sie die Kristallisation Platte auf dem motorisierten SBS-Träger.</li>
		<li>Klicken Sie auf "ANZUSAUGEN" und warten Sie diesen Schritt abgeschlossen sein (wenn Kolben auf ihrem Weg nach oben gestoppt).</li>
		<li>Wechseln Sie zur Registerkarte "Ausführen" und führen Sie Programm.</li>
		<li>Nach Abschluss des Programms, gehen Sie zurück zu der Registerkarte "SET UP" und klicken Sie auf "Entfernen": das System löscht die Spritzen aus übrig gebliebenen Lösungen, und dann hebt die Kolben ganz oben. "Bereinigen" statt "REMOVE" verlangt werden, so bleibt der Kolben in der unteren Position bereit, weitere Lösungen mit der gleichen Spritzen Aspirieren.
</li>
		<li>Entfernen Sie die Spritzen durch Drehen sie gegen den Uhrzeigersinn.</li>
		<li>Spritzen und Tröge in den entsprechenden Behälter entsorgen (oder abspülen mit entionisiertem Wasser und dann 20 % V/V Ethanol Lösung zur Wiederverwendung).</li>
		<li>Die Dichtplatte und platzieren Sie es auf die Mikrotestplatte Mixer für 3 min bei 1.000 u/min oder 10 min, beim Mischen von hoch viskoser Lösungen. Die Platte ist bereit für die Einrichtung von Kristallisation Tröpfchen auf dem Nanoliter-Spender.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Additiv screening Protokoll Nr. 1 (Einrichtung von Kristallisation Tröpfchen in einer 96-Well-Kristallisation Platte vorausgefüllt mit Additiven Bildschirm)
	<ol>
<li>Zuerst bereiten Sie die Bedingung mit anfängliche Konzentrationen von Reagenzien stieg um 10 % (mind. Bd. 15 mL bei der Übertragung von der Bedingung aus einem Container auf dem Additiven Bildschirm mit dem liquid Handler).</li>
		<li>Sicherstellen Sie, dass der liquidere Handler betriebsbereit ist. Öffnen Sie das Programm "Bildschirm hinzufügen, Zusatzstoffe" für eine einzelne Platte (geben Sie Volumen in Stauseen: "72 µL"). Fordert, Figuren und eine Tipp-Management-System (12 x 1.000 µL Tipps erforderlich) Hilfe sicherstellen, dass der Roboter ist bereit, nach der Auswahl arbeiten.
</li>
		<li>Abrufen der additiven-Bildschirms aus dem Inkubator-20 ° C und seine Aluminium-Dichtung sofort (Nutzung der Kennzeichenhalter) entfernen, dann legen Sie die Platte auf dem Deck des flüssigen Handlers. Das Programm arbeitet nach einem Hochformat (die Platte wird mit der A1-Ecke befindet sich vorne links des Trägers platziert). Auch stellen Sie auch den Behälter gefüllt mit der Bedingung. Führen Sie das Programm.</li>
		<li>Die Stauseen der Platte ausgefüllt haben, legen Sie es auf den Mikrotestplatte Shaker und führen Sie das Programm. Spülen Sie den Behälter Zustand mit entionisiertem Wasser und 20 % Ethanol zur Wiederverwendung.</li>
		<li>
Richten Sie die Tropfen auf dem Nanoliter-Spender. Erstens entsiegeln der Kristallisation Platte (Nutzung der Kennzeichenhalter). Dann legen Sie die Platte und das 8-Brunnen-Protein in der ersten Position des Filmstreifen-Halter Blocks zu Streifen. Registerkarte "Setup" auf der controlling-Software zeigt die tatsächlichen Positionen der einzelnen Komponenten auf dem Deck. Laden Sie jeweils auch auf den Strip mit Protein Probe entsprechend die Tropfengröße erforderlich (Tabelle 4). Führen Sie das Programm, Tröpfchen vorzubereiten.
</li>
		<li>Nach Abschluss des Programms, entfernen Sie die Platte aus dem Deck und verschließen Sie diese sofort (verwenden Sie die Platte Versiegelung, 3-Zoll breites Klebeband). Verwerfen Sie den Streifen in den geeigneten Lagerplatz.</li>
		<li>Größe, Form, zu bewerten und Zentrierung der Tropfen unter dem Mikroskop vor der Einlagerung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Additiv screening Protokoll Nr. 2 (Kristallisation Tröpfchen in einer 96-Well-Kristallisation-Platte mit einem wiederverwendbaren Additiv Bildschirm einrichten)
	<ol>
<li>Zuerst bereiten die additive Bildschirm: entsprechende gefrorenen 96-Well Kultur Zellplatte, bei 40 min. bei Raumtemperatur auftauen lassen. Dann Zentrifugieren Sie Additiv Bildschirms auf 1.000 x g für 2 min.</li>
		<li>Bereiten Sie die Bedingung (min. Vol. 15 mL bei der Übertragung von der Bedingung aus einem Container auf dem Additiven Bildschirm mit dem liquid Handler).</li>
		<li>Füllen Sie die Stauseen einer Kristallisation der 96-Well-Platte mit der Bedingung. Gehen Sie auf der Flüssigkeit-Handler genauso wie Protokoll 1, 2.2.2 Schritt, aber geben Sie "80 µL" für die Lautstärke in den Wasserbecken.</li>
		<li>Richten Sie die Tropfen auf dem Nanoliter-Spender mit 3 Komponenten auf dem Deck (die Platte mit dem Additiv Bildschirm, zusammen mit der Kristallisation Platte und den 8-Brunnen Protein-Streifen in der ersten Position des Filmstreifen-Halter Blocks, Tabelle 4).</li>
		<li>Die Zelle Kultur Dichtplatte mit dem Bildschirm mit einem Alu-Blech und legen Sie sie wieder in den Inkubator-20 ° C.</li>
		<li>Größe, Form, zu bewerten und Zentrierung der Tropfen unter dem Mikroskop vor der Einlagerung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Wir erklären hiermit ein widersprüchliche kommerzielles Interesse, da LifeArc die folgenden Elemente vertreibt: 96 - und 48-Brunnen MRC-Platten, MRC hängenden Tropfen Dichtung, MORPHEUS, Pi, ANGSTROM und LMB Kristallisation Bildschirme.

1 - Vorbereitung und Verwendung von Einstiegsbilder gespeichert in Platten
Screening-Kits sollten gemischt werden, bevor in Platten verzichtet wird, weil leichte Niederschläge oder Phase Trennung in einigen Röhren während der Lagerung auftritt. Wenn ein Bildschirm aus zwei Kits (2 x 48 Röhren) besteht, die erste Röhre des zweiten Kit in Lage E1 der der kühlenden Träger steht. Wenn ein Bildschirm von 4 Kits (4 x 24 Röhren) besteht, die erste Röhre des zweiten Kit befindet sich im Ort C1, die erste Röhre des dritten Kit befindet sich im Ort E1 und die erste Röhre des vierten Kit befindet sich im Ort G1. Beim Einsetzen der Röhren in ihrem Kühlsystem Träger, sind Deckel auf einem Tablett nach dem standard 96-Well-Querformat-Layout platziert. Da gut Zahlen auf die Deckel von den Herstellern angegeben sind, ist dadurch die Gegenprüfung wenn alle Röhren in der richtigen Reihenfolge platziert wurden. Dies hilft auch, um die richtigen Deckel auf die Rohre zu ersetzen, wenn eine geringere Anzahl von Platten zu füllen.
Wir speichern die vorgefüllten Platten bei 10 ° C, einen Kompromiss zu vermeiden, Einfrieren und Lagerung bei 4 ° C, die Verschlechterung der Bedingungen und Probleme mit Abdichtung führen kann. Platten sind lagerfähig bis zu mehreren Monaten mit normalerweise keine spürbaren Kondensation auf der Innenseite der Dichtung. Dies gilt weniger für LMB05, LMB06, LMB09 und LMB10 Platten wie diese Bedingungen mit relativ hohen Konzentrationen der flüchtigen Reagenzien (Tabelle 1) enthalten. Kleine Menge von Kondenswasser an der Innenseite der Dichtung reduziert Abdichtung Effizienz und Kreuzkontaminationen zwischen Brunnen und Entsiegelung die Platten verursachen kann. Um Hilfe bei der Kondensation während der ersten Abkühlung zu verhindern, können Platten zuerst aus dem Karussell in einer isolierten Picknick Kühler übertragen werden, die über Nacht in einen Kühlraum von 4 ° C gespeichert ist. Die sehr langsame Abkühlung minimiert die Entwicklung des Temperaturgradienten innerhalb der versiegelten Brunnen und somit reduziert Kondenswasser insgesamt15. Sobald die Platten im Inkubator 10 ° C gelagert sind, wird darüber hinaus ein eigene benutzerdefinierter SBS Polystyrol Deckel auf die Platte am oberen Rand jeder Stapel (nicht dargestellt) gelegt.
Die Gesamtheit unserer Pre-filled Platten kann als eine große Einstiegsbild gegen eine neuartige, wasserlöslich, Protein-Probe verwendet werden. Alternativ können weniger Platten ausgewählt werden, um spezifische Anforderungen zu erfüllen. Z. B. LMB15 und LMB19 sind Bildschirme formuliert speziell für Membran-Protein Proben26,27, oder LMB20 ist ein Bildschirm mit Heavy-Atome zur Erleichterung der experimentellen Ausstieg von Beugung Daten28 formuliert (siehe auch : <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">Formulierung der MORPHEUS Protein Kristallisation Bildschirme</a>).
2. Einrichten der Kristallisation Tröpfchen
Bei der Verwendung des Systems 2 sollten screening-Kits mit erheblichen Mengen von flüchtigen Reagenzien zuerst verarbeitet werden. Dies vermeidet Kondensatbildung auf der SBS-Deckel, die Deckel Handling und Platte Abdichtung beeinträchtigen könnten. Ein SBS-Deckel hat ein bisschen Abstand wenn oben auf einen Teller, weshalb sie ursprünglich ausgerichtet werden müssen (siehe Protokoll, Schritt 1.2.6). Das Protein Totvolumina in den Vertiefungen der PCR Platte sind relativ großzügig (0,8 µL, siehe Legende der Tabelle 2). Beachten Sie, dass ebenso großzügige Totvolumina beschäftigt sind, bei den Nanoliter Spender individuell mit Protein in 8-Well Streifen (Tabelle 4). Kleinere Totvolumina arbeiten kann, aber einige Proben an die Tipps halten, Kalibrierung eines Roboters kann etwas ungenau geworden, der Raum wärmer als üblich, etc.sein kann. Alle führen zum Beispiel Verluste von der großzügigen Totvolumina abgedeckt um den Ansatz zu konsolidieren.
Jüngste Entwicklungen konnte weitere Miniaturisierung von Experimenten und damit das Volumen der Probe erforderlich für screening-Kristallisation Bedingungen deutlich reduziert werden durch die Integration der entsprechenden Technologie29,30 . Allerdings benötigen einige Aspekte der weiteren Miniaturisierung reiflicher Überlegung, wie die Verdunstung der Tröpfchen31 und die Manipulation der Mikrokristalle32.
Zentrifugation der Platte (2.000 u/min, 1 min) konnte schließlich als routinemäßige letzter Schritt integriert werden, beim Einrichten von Kristallisation Tröpfchen (in sphärische oberen-Brunnen). Eine einheitlichere Größe und Form von Tröpfchen durch Zentrifugation können Reproduzierbarkeit Fragen33,34verringern. Sicherlich werden zentrierte Tropfen erleichtern die spätere Bewertung der Experimente unter Verwendung eines Mikroskops, da die erforderliche Brennweite über die gesamte Platte ähnlich sein werden.
3. Vorteile der 4-Ecken-Methode
Der wichtigste Vorteil des 4-Ecken-Methode ist seine Einfachheit, die Fehler minimiert und ermöglicht einfache automatisierte Protokolle. Beispielsweise werden die 4 Eck-Lösungen immer auf dem Deck eines flüssigen Handlers nach das gleiche Layout platziert werden. Alle Programme basieren auch auf festen Verhältnisse zwischen den Lösungen (Abbildung 3). Manuelle Erstellung von 4 Ecklösungen ist bevorzugt, automatische Behandlung von Lösungen bei hohen Konzentrationen die hochviskosen sein kann. Relativ schnell und präzise Absaugung/Abgabe ist dann auf die meisten Arten von liquid Handler mit Mindestanforderungen zur Optimierung der flüssigen Klassen möglich. Jedoch möglicherweise einige Eck-Lösungen noch zu zäh für einen Roboter mit einer Flüssigkeit-System, effizient zu arbeiten. Deshalb entschieden wir uns für einen flüssigen Handler mit positive Verschiebung (Abb. 3 b).
Zusätzlich zu den 2 linearen Gradienten der Konzentrationen kann eine dritte Komponente (d. h., eine Reihe von Puffern/Zusätze) in einer konstanten Konzentration auf bequeme Weise getestet werden. Hierzu wird zunächst eine relativ große Datenmenge einen Kernsatz von Ecklösungen in einer entsprechend höheren Konzentration, ausgenommen die Komponente variiert werden, vorbereitet. Dann Stammlösungen einschließlich dieser Komponente wird hinzugefügt, um die Endkonzentrationen anzupassen. Z. B. sind 50 mL eines Satzes von 4 Ecklösungen bei 10 % höheren Konzentrationen als ursprünglich bereit. Dieser Kernsatz wird in 5 kleinere Teilmengen von 4 aufgeteilt. Schließlich wird jede Teilmenge 10 % im Volumen von verschiedenen Puffer-pH-Lösungen hinzugefügt.
(4) Formate und Arten von Additiven Bildschirme
Die Bildschirme werden normalerweise bei-20 ° C (Abbildung 4) gespeichert, da sie nicht regelmäßig verwendet werden und enthalten flüchtige/instabile Verbindungen. Die Verwendung eines gefrorenen Additiv Screen gespeichert in einem tiefen Brunnen Block (1 mL in Brunnen) muss frühzeitig geplant werden, weil es dauert 12-24 Stunden für die additive Lösungen vollständig bei Raumtemperatur auftauen. Auch eine Vielzahl von Nutzern teilen demselben Additiven Bildschirm verursachen Probleme mit Cross-Kontamination. Zu guter Letzt macht die Höhe der Tiefbrunnen Blöcke sie ungeeignet für die meisten Nanoliter-Dispenser. Als günstige Lösung für diese Probleme zu umgehen sollte der Bildschirm aus dem Tiefbrunnen Block auf flache Teller (Abbildung 4) übertragen werden.
In der Vergangenheit wurden additive Bildschirme umfasst eine Vielzahl von einzelnen Reagenzien (mit einzelnen Konzentrationen) sehr beliebt35,36. Jedoch haben andere Arten von Additiven Bildschirmen entwickelt worden, die Mischungen von Zusatzstoffen37 oder eine reduzierte Anzahl von einzelnen Zusatzstoffe finden Sie unter verschiedenen Konzentrationen38zu integrieren. Schließlich ist ein ergänzender Ansatz zur Untersuchung der Wirkung von Zusatzstoffen auf die Proben vor der Kristallisation39,40.
5. weitere Überlegungen
Gute Praxis: Die meisten Bildschirme schädliche oder sogar giftige Substanzen enthalten und daher muss ausreichenden Personenschutz eingesetzt werden, während die Protokolle. Ebenso kann bewegliche Teile der Roboter zu Verletzungen führen, vor allem wenn Sie versuchen, manuell einzugreifen, während ein Programm ausgeführt wird (obwohl die meisten der Roboter Not-Halt-Taste/System verfügen). Aufgrund der technischen Komplexität beteiligt, regelmäßige Überprüfung der Roboter, Bildschirme und Programme mit zuvor gekennzeichnet Prüfmuster für anhaltend hohe Reproduzierbarkeit von Bedeutung sind.
Durchsatz: Als Anhaltspunkt werden zwischen 4.000 bis 8.000 LMB Platten jährlich mit dem System 1 (und später Beschäftigte von Benutzern für ersten Screening) produziert. Es ist nicht an Lager angepasst eine große Menge von Pre-filled Platten bei 10 ° C wird der erwartete Umsatz nach 4-5 Monate, einige Bedingungen viel niedriger, als startet zu verschlechtern und zu verdampfen. Verschiedene Ansätze zur Automatisierungsprotokolle sind für kleine bis mittelgroße Labors41umgesetzt worden.
Speichern und Bewertung von Experimenten: Nach der Vorbereitung der Tröpfchen, sind Platten auf vibrationsarmen Regale in einem Raum bei 4 oder 18 ° C mit streng kontrollierter Temperatur (+/-0,5 ° C maximale Abweichung) gespeichert. Experimente sind mit kaltem Licht Quelle Mikroskope beurteilt. Verschiedene automatisierte bildgebende Systeme sind kommerziell verfügbar, jedoch sollte man sorgfältig alle Aspekte zu berücksichtigen: die Geschwindigkeit erforderlich, um eine Platte Scannen ausreichen für hohen Durchsatz? Werden andere Objekte als Kristalle mit Autofokus stören? Wird die resultierende Qualität der Bilder vor Ort sehr kleine Kristalle (vor allem um den Rand der Tröpfchen) ausreichen? 42 , 43 , 44
Vergleich der Kristallisation Bedingungen: Nach sorgfältigen Untersuchungen über die Natur der ursprünglich erhaltenen Kristalle kann man Trends und Gemeinsamkeiten über Bedingungen mit der <a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">LMB Bildschirm Datenbank</a> oder die C6 <a href="http://c6.csiro.au/">Webtool</a>45analysieren.

Röntgen-Kristallographie wird ausgiebig um unser Verständnis der Mechanismen der biologischen und Krankheit auf atomarer Ebene weiter und rationale Ansätze zur Drug Discovery1anschließend gerne angewendet. Für diese, gereinigt und konzentriert (2-50 mg/mL) makromolekularen Proben von Proteinen, DNA, RNA, andere Liganden und ihre komplexe sind erprobt für ihre Neigung, Form dreidimensionalen Gitter durch Kristallisation2,3 bestellt ,4. Wenn hochwertige Kristalle, die Röntgenstrahlen beugen gewonnen werden, kann die Kristallstruktur in der Nähe von atomarer Auflösung5,6gelöst. Entscheidend ist, die Voraussetzungen für eine neue Probe kristallisieren können nicht vorhergesagt werden und die Ausbeute an qualitativ hochwertige Kristalle beträgt in der Regel sehr gering. Eine Ursache ist, dass viele Proben von Interesse herausfordernde biochemische Eigenschaften, die sie auf der entsprechenden Zeitskala für Kristallisation (in der Regel ein paar Tage) instabil machen. Zu guter Letzt wird der Prozess durch den Zeitaufwand, Proben und Muster Varianten produzieren und optimieren Sie ihre Reinigung und Kristallisation7,8verschärft.
Eine Kristallisation Bedingung ist eine Lösung mit einem Fällungsmittel, die Sample-Löslichkeit verringert, und Bedingungen oft auch Puffer und Zusatzstoffe enthalten. Hunderte von solchen Reagenzien sind gut geeignet, um die Parameter der Kristallisation Experimente zu ändern, da sie geringe Neigung zu stören Probe Integrität (z.B. Protein oder Nukleinsäure-Entfaltung) haben. Während Millionen von Kombinationen der Kristallisation Reagenzien testen nicht machbar ist, ist Testen von mehreren bis vielen Screening-Kits - formuliert mit verschiedenen Strategien9,10 - mit miniaturisierten Irrungen und automatisierten Protokolle möglich. In dieser Perspektive ist die am meisten zugänglich Technik wahrscheinlich Dampf Diffusion mit 100-200 nL Tröpfchen sitzt auf einem kleinen gut über ein Becken mit der Kristallisation Zustand (25-250 µL), umgesetzt in spezialisierten Kristallisation Platten11 , 12. Protein Probe und Zustand werden häufig kombiniert, im Verhältnis 1:1 für ein Gesamtvolumen von 200 nL beim Einrichten der Tröpfchen in den oberen-Brunnen. Roboter-Nanoliter Protein Kristallisation kann implementiert werden, mit alternativen Techniken und Platten wie die unter Öl Batch13 und Lipid-kubische Phase14 (die jüngste ist ein speziell auf Trans-Membranproteine, die angewendet wird sehr schlecht in Wasser löslich).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">Der Kristallisation Anlage am MRC-LMB</a> wurde in den frühen 2000er Jahren begonnen und eine frühe Übersicht über unsere automatisierten Protokolle wurde in 200515. Eine historische Einführung in die Protein-Kristallisation wurde vorgestellt und auch ein Überblick über die Vorteile der Roboter Nanoliter nähern (dann einen neuartigen Ansatz zur routinemäßigen Experimente). Seit makromolekularen Kristallisation ist im Wesentlichen ein stochastischer Prozess mit sehr wenig oder gar keine nützliche Vorabinformationen, beschäftigt eine breite Vielzahl von (geeigneten) Anfangsbedingungen erhöhen die Ausbeute an Qualität Beugung Kristalle16. Außerdem ist ein oft übersehener Vorteil von einem anfänglichen Großbild, die Notwendigkeit der Optimierung von Proben und Kristallen in vielen Fällen deutlich zu reduzieren. Natürlich kann man müssen noch mit Optimierung von einigen Anfangsbedingungen später fortfahren. In der Regel die Konzentration von Reagenzien und der pH-Wert werden dann systematisch untersucht. Weitere Reagenzien können auch in die optimierte Bedingung(en), weitere Parameter der Kristallisation ändern eingeführt werden. Sicherlich, man sollte versuchen Kristallisation mit einer Probe frisch zubereitet, daher die entsprechenden Protokolle müssen jederzeit unkompliziert und verfügbar.
Hier zwei vollautomatische Systeme bei MRC-LMB (Anlagen 1 und 2) und die entsprechenden Protokolle sind ausführlich beschrieben. Die Hauptanwendung der beiden Systeme ist initial screening durch Dampf-Diffusion in Drop Kristallisation Platten sitzen. System 1 integriert ein liquid Handler, eine automatisierte Karussell auf Lager Platten, Tintenstrahldrucker für die Platte Beschriftung und einer Haftplatte Sealer. Auf dem System 1 sind 72 96-Well-Platten gefüllt mit im Handel erhältlichen Screening-Kits (80 µL Zustand ins Reservoir aus einem Start Volumen von 10 mL im Reagenzglas), beschriftet und versiegelt. Die Platten werden dann in einem Inkubator 10 ° C gespeichert wo sie Benutzern zur Verfügung jederzeit (als Einstiegsbilder "LMB Platten" genannt) sind.
System 2 integriert ein liquid Handler, ein Nanoliter-Dispenser und einer Haftplatte Sealer. Auf dem System 2, sitzen Tröpfchen (100-1.000 nL) für Dampf Diffusion Experimente entstehen durch die Kombination von Bedingungen und die Probe in den oberen Vertiefungen der 20 48 oder 96-Well-Platten vorausgefüllt mit Bedingungen. Dies bedeutet, dass 1.920 ersten Screening Bedingungen erprobt sind, bei der Verwendung von 20 LMB Platten auf das System 2.
Roboter sind auch einzeln für die Optimierung der gewählten Bedingungen benutzt, und die entsprechenden halbautomatischen Protokolle werden ebenfalls beschrieben. Die 4-Ecken-Methode17 wird routinemäßig eingesetzt, um Optimierung Bildschirme produzieren. Das entsprechende Protokoll erfordert zunächst die manuelle Vorbereitung der 4 Lösungen ("A, B, C und D"). Zwei lineare Verläufe von Konzentrationen (für zwei wichtigsten Kristallisation Agents) werden direkt in den Stauseen der Kristallisation Platte dann automatisch generiert. Dafür verzichtet ein Spritze-basierte liquider Handler die 4 Eck-Lösungen bei unterschiedlichen Verhältnissen.
Um eine Bedingung weiter zu optimieren, kann eine additive Bildschirme einsetzen, die möglicherweise die Eigenschaften des resultierenden Kristalle18verbessern. Zwei Ansätze gibt es für additive Screening: ein Protokoll, beginnend mit Zusatzstoffe verzichtet in den Stauseen der Kristallisation Platten vor dem Einrichten der Tröpfchen (Protokoll 1) und ein anderes Protokoll, wo die additive Bildschirm entfällt, direkt auf die Tröpfchen (Protokoll Nr. 2).
Andere nützlichen Entwicklungen, die bei der MRC-LMB, automatisierte makromolekularen Kristallisation zu erleichtern eingeleitet wurden, werden ebenfalls vorgestellt. Im wesentlichen minimiert Kristallisation Platten und damit verbundenen Geräte wie z. B. einen stapelbaren Gesellschaft der biomolekularen Screening (SBS) Deckel, die Verdampfung von Bedingungen, wenn das System 2 mit.
Aus Platzgründen wird davon ausgegangen, dass Benutzer mit den Grundfunktionen und Wartung von Nanoliter-Dispenser, dem Inkjet-Drucker und Haftplatte Sealer vertraut sind. Sofern nicht anders angegeben, sind die Platten auf dem Deck der Roboter positioniert, dass die gut A1 ("A1-Ecke") ist auf der Rückseite links ein Plattenträger.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Robots&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freedom EVO&amp;reg;</td><td>Tecan</td><td>n/a</td><td>Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microlab&amp;reg; STAR&amp;trade;</td><td>Hamilton</td><td>n/a</td><td>Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE&amp;trade; technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.</td></tr><tr><td>Mosquito&amp;reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dragonfly&amp;reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Adhesive plate sealer</td><td>Brandel</td><td>n/a</td><td>Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).</td></tr><tr><td>Inkjet printer 9232</td><td>Markem-Imaje</td><td>n/a</td><td>Integrated to System 1. Touchscreen interface.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Crystallization screens&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystal Screen&amp;trade; 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td></tr><tr><td>Crystal Screen 2&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td></tr><tr><td>Wizard&amp;trade; Classic 1</td><td>Rigaku</td><td>1009530</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td></tr><tr><td>Wizard&amp;trade; Classic 2</td><td>Rigaku</td><td>1009531</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td></tr><tr><td>Grid Screen&amp;trade; Ammonium Sulfate</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-211</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&amp;trade; PEG/LiCl</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-217</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td></tr><tr><td>Quick Screen&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-221</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&amp;trade; Sodium Chloride</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-219</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&amp;trade; PEG 6000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-213</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td></tr><tr><td>Grid Screen&amp;trade; MPD</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-215</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td></tr><tr><td>MemFac&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-114</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td></tr><tr><td>PEG/Ion&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-126</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td></tr><tr><td>Natrix&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-116</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td></tr><tr><td>Crystal Screen Lite&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-128</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td></tr><tr><td>Custom Lite screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td></tr><tr><td>Wizard&amp;trade; Cryo 1</td><td>Rigaku</td><td>1009536</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td></tr><tr><td>Wizard&amp;trade; Cryo 2</td><td>Rigaku</td><td>1009537</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td></tr><tr><td>JBS1</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-101L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td></tr><tr><td>JBS2</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-102L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td></tr><tr><td>JBS3</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-103L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td></tr><tr><td>JBS4</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-104L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td></tr><tr><td>JBS5</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-105L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td></tr><tr><td>JBS6</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-106L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td></tr><tr><td>JBS7</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-107L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td></tr><tr><td>JBS8</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-108L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td></tr><tr><td>JBS9</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-109L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td></tr><tr><td>JBS10</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-110L</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 1 pH 4.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 1 pH 5.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 1 pH 6.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 1 pH 7.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 1 pH 8.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 2 pH 4.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 2 pH 5.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 2 pH 6.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 2 pH 7.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 2 pH 8.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td></tr><tr><td>Index&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13</td></tr><tr><td>SaltRX&amp;trade; 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-107</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td></tr><tr><td>SaltRX&amp;trade; 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-109</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td></tr><tr><td>MemStar&amp;trade;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-21</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td></tr><tr><td>MemSys&amp;trade;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-25</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td></tr><tr><td>JCSG-plus&amp;trade; Suite</td><td>Qiagen</td><td>130720</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16</td></tr><tr><td>MORPHEUS&amp;reg; screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-46</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17</td></tr><tr><td>Pi minimal screen</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-127</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18</td></tr><tr><td>Pi-PEG screen</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-128</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19</td></tr><tr><td>MORPHEUS&amp;reg; II screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-91</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20</td></tr><tr><td>LMB crystallization screen&amp;trade;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-98</td><td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additive screens&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT additive screen</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-138</td><td>Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td></tr><tr><td>MORPHEUS&amp;reg; additive screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93-500</td><td>Frozen in 96-well deepwell block (500 &amp;micro;L per well).</td></tr><tr><td>ANGSTROM additive screen&amp;trade;&amp;nbsp;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100</td><td>Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td></tr><tr><td>MORPHEUS&amp;reg; additive screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93</td><td>Frozen in 96-well cell culture Costar&amp;reg; plate with V-shaped wells (100 &amp;micro;L per well).</td></tr><tr><td>ANGSTROM additive screen&amp;trade;&amp;nbsp;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100-FX</td><td>Frozen in 96-well cell culture Costar&amp;reg; plate with V-shaped well (100 &amp;micro;L per well).</td></tr><tr><td>HIPPOCRATES additive screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a</td><td>48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS&amp;reg; III).</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well MRC 2-drop plate</td><td>Swissci</td><td>MRC 96T-UVP</td><td>Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80&amp;nbsp; &amp;micro;L. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible.</td></tr><tr><td>48-well MRC 1-drop plate&amp;nbsp; (&#039;MAXI plate&#039;)</td><td>Swissci</td><td>MMX01-UVP&amp;nbsp;</td><td>Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200&amp;nbsp; &amp;micro;L. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 &amp;micro;L. UV transmissible.</td></tr><tr><td>MRC hanging drop seal</td><td>Swissci</td><td>n/a</td><td>Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible.</td></tr><tr><td>Adhesive sealing tape</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-50</td><td>3-inch wide Duck&amp;reg; HD Clear&amp;trade; for sealer and manual sealing.</td></tr><tr><td>Adhesive aluminium sheet</td><td>Beckman Coulter</td><td>538619</td><td>Used to reseal additive screens.</td></tr><tr><td>Ink cartridge</td><td>Markem-Imaje</td><td>9651</td><td>System 1 (inkjet printer).</td></tr><tr><td>Solvent cartridge</td><td>Markem-Imaje</td><td>8652</td><td>System 1 (inkjet printer).</td></tr><tr><td>50 &amp;micro;L tips&amp;nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>235947</td><td>System 2 (STAR&amp;trade; liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE&amp;trade; tips in disposable stacks.</td></tr><tr><td>Reagent container</td><td>Hamilton</td><td>194052</td><td>Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PCR plate</td><td>Thermo Scientific&amp;trade;</td><td>AB-2150</td><td>System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito&amp;reg;). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells.</td></tr><tr><td>microsyringes</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03020</td><td>Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito&amp;reg; nanoliter dispenser (9mm spacing).</td></tr><tr><td>strip-holder block</td><td>TTP Labtech</td><td>3019-05013</td><td>SSB device for the Mosquito&amp;reg; strips, aka &#039;4-way Reagent Holder&#039;.</td></tr><tr><td>2 &amp;micro;L 8-well strip</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03110</td><td>Contains protein on the deck of the Mosquito&amp;reg;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 &amp;micro;L.</td></tr><tr><td>5 &amp;micro;L 8-well strip</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03100</td><td>Contains protein on the deck of the Mosquito&amp;reg;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 &amp;micro;L.</td></tr><tr><td>5 mL syringes</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07100</td><td>Syringe body and piston for the Dragonfly&amp;reg; liquid handler. Pack of 100.</td></tr><tr><td>Troughs/Reservoirs</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07103</td><td>Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly&amp;reg;. Pack of 50.</td></tr><tr><td>Orbital microplate shaker</td><td>CamLab Limited</td><td>n/a</td><td>Variomag&amp;reg; for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm).</td></tr><tr><td>Microplate mixer</td><td>TTP Labtech</td><td>3121-01015</td><td>MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins.</td></tr></tbody></table>

automated protocols for macromolecular crystallization at the mrc laboratory of molecular biology

Wenn hochwertige Kristalle, die Röntgenstrahlen beugen gewonnen werden, kann die Kristallstruktur in der Nähe von atomarer Auflösung gelöst. Die Voraussetzungen für die Proteine, DNA, RNA und ihre komplexe kristallisieren lassen sich jedoch nicht vorhersagen. Beschäftigt eine breite Vielzahl von Bedingungen, ist eine Möglichkeit, die Ausbeute an Qualität Beugung Kristalle zu erhöhen. Zwei voll automatisierte Systeme haben bei der MRC Labor für Molekularbiologie (Cambridge, England, MRC-LMB), die Kristallisation Abschirmung gegen 1.920 Anfangsbedingungen zu erleichtern durch Dampf-Diffusion in Nanoliter Tröpfchen entwickelt. Halbautomatische Protokolle wurden auch entwickelt, um die Bedingungen zu optimieren, durch Änderung der Konzentrationen von Reagenzien, pH-Wert, oder durch die Einführung von Zusatzstoffen, die potenziell Eigenschaften der daraus resultierenden Kristalle verbessern. Die entsprechenden Protokolle werden ausführlich beschrieben und kurz besprochen. Zusammengenommen können sie bequem und hocheffiziente makromolekularen Kristallisation in einer Mehrbenutzer-Einrichtung, wobei der Benutzer Kontrolle über die wichtigsten Parameter ihrer Experimente.

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Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Automatisierte Systeme und Protokolle für die routinemäßige Vorbereitung einer großen Anzahl von Bildschirmen und Nanoliter Kristallisation Tröpfchen für Dampf-Diffusion-Experimente sind beschrieben und diskutiert.

Automatische Protokolle für makromolekulare Kristallisation am MRC Laboratory of Molecular Biology

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

automated-protocols-for-macromolecular-crystallization-at-mrc

Research

JoVE Journal

Biochemistry

16.3K Aufrufe.  Medical Research Council. Automatisierte Systeme und Protokolle für die routinemäßige Vorbereitung einer großen Anzahl von Bildschirmen und Nanoliter Kristallisation Tröpfchen für Dampf-Diffusion-Experimente sind beschrieben und diskutiert.

Serie: Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to precisely maneuver the nucleation and crystal growth towards desired sizes of protein crystals. The controlled crystallization is based on sample investigation with in situ Dynamic Light Scattering (DLS) while all visual changes in the droplet are monitored online with the help of a microscope coupled to a CCD camera, thus enabling a full investigation of the protein droplet during all stages of crystallization. The use of in situ DLS measurements throughout the entire experiment allows a precise identification of the highly supersaturated protein solution transitioning to a new phase &#8211; the formation of crystal nuclei. By identifying the protein nucleation stage, the crystallization can be optimized from large protein crystals to the production of protein microcrystals. The experimental protocol shows an interactive crystallization approach based on precise automated steps such as precipitant addition, water evaporation for inducing high supersaturation, and sample dilution for slowing induced homogeneous nucleation or reversing phase transitions.

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Here we present a protocol for controlled production of protein microcrystals. The process uses an automated device allowing controlled manipulation of several crystallization parameters. The protein crystallization is carried-out by controlled and automated addition of crystallization solutions while monitoring and investigating the radius distribution of particles in the crystallization droplet.

Wachsende Proteinkristallen mit unterschiedlichen Abmessungen mit automatisierten Kristallisation gepaart mit In Situ dynamische Lichtstreuung

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Forschung

Biochemie

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other important cellular biology questions. The technologies available to genetically manipulate Dictyostelium cells are well-developed. Transfections can be performed using different selectable markers and marker re-cycling, including homologous recombination and insertional mutagenesis. This is supported by a well-annotated genome. However, these approaches are optimized for axenic cell lines growing in liquid cultures and are difficult to apply to non-axenic wild-type cells, which feed only on bacteria. The mutations that are present in axenic strains disturb Ras signaling, causing excessive macropinocytosis required for feeding, and impair cell migration, which confounds the interpretation of signal transduction and chemotaxis experiments in those strains. Earlier attempts to genetically manipulate non-axenic cells have lacked efficiency and required complex experimental procedures. We have developed a simple transfection protocol that, for the first time, overcomes these limitations. Those series of large improvements to Dictyostelium molecular genetics allow wild-type cells to be manipulated as easily as standard laboratory strains. In addition to the advantages for studying uncorrupted signaling and motility processes, mutants that disrupt macropinocytosis-based growth can now be readily isolated. Furthermore, the entire transfection workflow is greatly accelerated, with recombinant cells that can be generated in days rather than weeks. Another advantage is that molecular genetics can further be performed with freshly isolated wild-type Dictyostelium samples from the environment. This can help to extend the scope of approaches used in these research areas.

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is a popular model organism to study complex cellular processes such as cell migration, endocytosis, and development. The utility of the organism is dependent on the feasibility of genetic manipulation. Here, we present methods to transfect Dictyostelium discoideum cells that overcome existing limitations of culturing cells in liquid media.

Gentechnische Veränderung von Dictyostelium Discoideum Zellen basierend auf Auswahl und das Wachstum von Bakterien

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Genetik

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial purification of biologically important RNA/protein complexes. However, this strategy suffers from one major disadvantage that limits its broader utilization: the biotin/streptavidin interaction can be broken only under denaturing conditions that also disrupt the integrity of the eluted complexes, hence precluding their subsequent functional analysis and/or further purification by other methods. In addition, the eluted samples are frequently contaminated with the background proteins that nonspecifically associate with streptavidin beads, complicating the analysis of the purified complexes by silver staining and mass spectrometry. To overcome these limitations, we developed a variant of the biotin/streptavidin strategy in which biotin is attached to an RNA substrate via a photo-cleavable linker and the complexes immobilized on streptavidin beads are selectively eluted to solution in a native form by long wave UV, leaving the background proteins on the beads. Shorter RNA binding substrates can be synthesized chemically with biotin and the photo-cleavable linker covalently attached to the 5&#39; end of the RNA, whereas longer RNA substrates can be provided with the two groups by a complementary oligonucleotide. These two variants of the UV-elution method were tested for purification of the U7 snRNP-dependent processing complexes that cleave histone pre-mRNAs at the 3&#39; end and they both proved to compare favorably to other previously developed purification methods. The UV-eluted samples contained readily detectable amounts of the U7 snRNP that was free of major protein contaminants and suitable for direct analysis by mass spectrometry and functional assays. The described method can be readily adapted for purification of other RNA binding complexes and used in conjunction with single- and double-stranded DNA binding sites to purify DNA-specific proteins and macromolecular complexes.

RNA/protein complexes purified using botin-streptavidin strategy are eluted to solution under denaturing conditions in a form unsuitable for further purification and functional analysis. Here, we describe a modification of this strategy that utilizes a photo-cleavable linker in RNA and a gentle UV-elution step, yielding native and fully functional RNA/protein complexes.

Einzelschritt-Reinigung der makromolekularen komplexe mit RNA an Biotin und ein Foto-spaltbaren Linker befestigt

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

A Behavioral Assay for Investigating the Role of Spatial Memory During Instinctive Defense in Mice

Evolution has selected a repertoire of defensive behaviors that are essential for survival across all animal species. These behaviors are often stereotyped actions elicited in response to innately aversive sensory stimuli, but their success requires enough flexibility for adapting to different spatial environments, which can change rapidly. Here, we describe a behavioral assay to evaluate the influence of learned spatial knowledge on defensive behaviors in mice. We have adapted the widely used Barnes maze spatial memory assay to investigate how mice navigate to a shelter during escape responses to innately aversive sensory stimuli in a novel environment, and how they adapt to acute changes in the environment. This new assay is an ethological paradigm that does not require training and exploits the natural exploration patterns and navigation strategies in mice. We propose that the set of protocols described here are a powerful means of studying goal-directed behaviors and stimulus-triggered navigation, which should be of interest to both the fields of instinctive behaviors and spatial memory.

This protocol describes a behavioral assay, based on the Barnes maze test, to study how instinctive defensive actions are modified by the knowledge of spatial environment.

Ein Verhaltens-Assay für die Untersuchung der Rolle des räumlichen Gedächtnisses während der instinktiven Verteidigung bei Mäusen

Evolution has selected a repertoire of defensive behaviors that are essential for survival across all animal species. These behaviors are often ...

Verhalten

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

Charakterisierung auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen eines neuen Kinase-Proteins

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice of detergent is critical, because it affects both the stability and monodispersity of the complex. We recently determined the crystal structure of an active state of bovine rhodopsin coupled to an engineered G protein, mini-Go, at 3.1 &#197; resolution. Here, we detail the procedure for optimizing the preparation of the rhodopsin&#8211;mini-Go complex. Dark-state rhodopsin was prepared in classical and neopentyl glycol (NPG) detergents, followed by complex formation with mini-Go under light exposure. The stability of the rhodopsin was assessed by ultraviolet-visible (UV-VIS) spectroscopy, which monitors the reconstitution into rhodopsin of the light-sensitive ligand, 9-cis retinal. Automated size-exclusion chromatography (SEC) was used to characterize the monodispersity of rhodopsin and the rhodopsin&#8211;mini-Go complex. SDS-polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE) confirmed the formation of the complex by identifying a 1:1 molar ratio between rhodopsin and mini-Go after staining the gel with Coomassie blue. After cross-validating all this analytical data, we eliminated unsuitable detergents and continued with the best candidate detergent for large-scale preparation and crystallization. An additional problem arose from the heterogeneity of N-glycosylation. Heterologously-expressed rhodopsin was observed on SDS-PAGE to have two different N-glycosylated populations, which would probably have hindered crystallogenesis. Therefore, different deglycosylation enzymes were tested, and endoglycosidase F1 (EndoF1) produced rhodopsin with a single species of N-glycosylation. With this strategic pipeline for characterizing protein quality, preparation of the rhodopsin&#8211;mini-Go complex was optimized to deliver the crystal structure. This was only the third crystal structure of a GPCR&#8211;G protein signaling complex. This approach can also be generalized for other membrane proteins and their complexes to facilitate sample preparation and structure determination.

This report describes screening of different detergents for preparing the visual GPCR, rhodopsin, and its complex with mini-Go. Biochemical methods characterizing the quality of the complex at different stages during purification are demonstrated. This protocol can be generalized to other membrane protein complexes for their future structural studies.

Strategisches Screening und Charakterisierung des Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex für eine erfolgreiche Kristallisation

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Biologie

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In circadian rhythms research, for example, clock gene fusions with firefly luciferase give rise to robust rhythms in cellular bioluminescence that persist over many days. Technical limitations associated with photomultiplier tubes (PMT) or conventional microscopy-based methods for bioluminescence quantification have typically demanded that cells and tissues be maintained under quite non-physiological conditions during recording, with a trade-off between sensitivity and throughput. Here, we report a refinement of prior methods that allows long-term bioluminescence imaging with high sensitivity and throughput which supports a broad range of culture conditions, including variable gas and humidity control, and that accepts many different tissue culture plates and dishes. This automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) also allows the observation of spatial variations in luciferase expression across a cell monolayer or tissue, which cannot readily be observed by traditional methods. We highlight how the ALLIGATOR provides vastly increased flexibility for the detection of luciferase activity when compared with existing methods.

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Genetically encoded luciferase is a popular non-invasive reporter of gene expression. Use of an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) enables longitudinal recording from bioluminescent cells under a wide range of conditions. Here we show how ALLIGATOR may be used in the context of circadian rhythms research.

Flexible Messung der Biolumineszenz Reporter mit einer automatisierten längs Luciferase Imaging-Gas - und Temperatur-optimierte Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

Untersuchung der ATG9A-Lokalisation in Zellen

Imaging ATG9A, a Multi-Spanning Membrane Protein

Autophagy is a highly conserved pathway that the cell uses to maintain homeostasis, degrade damaged organelles, combat invading pathogens, and survive pathological conditions. A set of proteins, called ATG proteins, comprise the core autophagy machinery and work together in a defined hierarchy. Studies in recent years have improved our knowledge of the autophagy pathway. Most recently, it has been proposed that ATG9A vesicles are at the heart of autophagy, as they control the rapid de novo synthesis of an organelle called the phagophore. The study of ATG9A has proven challenging, since ATG9A is a transmembrane protein, and it is present in different membrane compartments. As such, understanding its trafficking is an important element for understanding autophagy. Here, detailed methods are presented that can be used to study ATG9A and, in particular, its localization using immunofluorescence techniques, which can be assessed and quantified. The pitfalls of transient overexpression are also addressed. The correct characterization of ATG9A function and the standardization of techniques to analyze its trafficking are crucial to further characterize the events governing autophagy initiation.

Autor im Rampenlicht: Bildgebung von ATG9A, einem multi-übergreifenden Membranprotein  

This protocol describes various methods that can help in the study of ATG9A biology, including immunofluorescence followed by image analysis, transient overexpression considerations, and investigating the ATG9A glycosylation status using western blot.

Bildgebung von ATG9A, einem mehrspannigen Membranprotein

Autophagy is a highly conserved pathway that the cell uses to maintain homeostasis, degrade damaged organelles, combat invading pathogens, and survive ...