Die Signaltransduktion ist eines der wichtigsten Themen der biologischen und pharmazeutischen Forschung. Es erfordert Membranproteine, um Signale an ihr intrazelluläres Signalpartnerprotein zu übertragen. Dieses Protokoll ist für die Durchführung eines systematischen Waschmittelscreenings zur Vorbereitung eines Signalisierungskomplexes mit dem Ziel der Strukturbestimmung konzipiert.
Dieses Protokoll verwendet allgemein verfügbare Techniken in einem etablierten Biologielabor und wird leicht von den Anfängern auf dem Gebiet durchgeführt. Wir haben diese Methoden zusammengeführt, um den kritischsten Parameter bei der Herstellung des Membranproteinkomplexes zu finden. Zunächst 30 Gramm HEK293 GNT I-mangelhaftes Zellpellet auf Raumtemperatur auftauen und auf ein Becherglas übertragen.
Fügen Sie 120 Milliliter PBS-Puffer mit Protease-Inhibitor-Cocktail und homogen mit einem Dounce Homogenisator oder einem elektrischen Homogenisator bei 13.000 RPM für 30 Sekunden hinzu. Stellen Sie das Volumen mit pbS-Puffer auf 150 Milliliter ein. Fügen Sie den homogenisierten Zellen vorsichtig 10% DDM hinzu, um eine Letzte Konzentration von 1,25%Stir auf Eis für eine Stunde zu geben.
Nach der Löslichkeit zentrifugieren Sie die Zelle bei vier Grad Celsius und 150.000 Mal G für 45 Minuten, um die unlöslichen Trümmer zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand in eine 500-Milliliter-Flasche und fügen Sie 10 Milliliter des 50%1D4 Immun-Affinitätagaroseharzes hinzu. Mischen Sie das lösliche Zelllysat und Harz vier Stunden oder über Nacht bei vier Grad Celsius, um eine Proteinbindung zu ermöglichen.
Das Lysatharzgemisch in eine offene Säule laden, um das Harz zu sammeln. Waschen Sie das Harz mit 10 Säulenvolumina des Waschpuffers A, um den Proteinschadstoff zu entfernen. Schließen Sie das Ventil und setzen Sie das Harz mit zwei Säulenvolumen puffer A.Next, unter dim Rotlicht zustand, fügen Sie 9-cis Retinal zu dem resuspendierten Harz zu einer endgültigen Konzentration von 50 Mikromolar.
Bei vier Grad Celsius für vier bis 16 Stunden im Dunkeln für Die Netzhautbindung sanft mischen. Öffnen Sie anschließend den Wert, und entfernen Sie den Puffer aus der Spalte. Waschharz mit 20 Spaltenvolumina des Puffers A, gefolgt von 15 Spaltenvolumina des Puffers B, um ungebundene Netzhaut zu entfernen.
Setzen Sie das Harz in zwei Säulenvolumen von Puffer B aus und teilen Sie die Harzsuspension gleichmäßig auf 10 10 Milliliter-Entsorgungssäulen auf. Entfernen Sie den Puffer aus den 10 Spalten, und setzen Sie das Harz dann jeweils in einem Milliliter Puffer C für den Waschmittelwechsel wieder auf. Eine Stunde auf Eis bebrüten.
Wiederholen Sie die Wäsche und die Inkubation in Puffer C noch einmal. Entfernen Sie den Puffer aus den Spalten, und setzen Sie das Harz dann in 0,8 Milliliter Elutionspuffer für jede Spalte wieder auf. Zwei Stunden lang sanft mischen.
Sammeln Sie die Elution aus jeder Spalte in ein Rohr. Setzen Sie das Harz in 0,7 MilliliterElutionspuffer für jede Spalte wieder auf. Sanft für eine Stunde mischen.
Sammeln Sie die Elution aus jeder Spalte in die gleichen Rohre. Laden Sie das ausgedunstete Protein im Dunkeln in die Quarzküvette. Messen Sie das Spektrum der Proteinprobe.
Beleuchten Sie das Protein zwei Minuten lang direkt in der Küvette mit einem Lichtdurchgang von 495 Nanometer lang. Messen Sie das Spektrum der beleuchteten Probe. Führen Sie die gleiche Messung für alle Proteinproben durch, die in den anderen neun Reinigungsmitteln gereinigt werden.
Sowohl dunkle als auch beleuchtete Zustände. Bei normalem Licht bereiten Sie für jeden Waschmittelzustand 100 Mikroliter Rhodopsin zu 0,7 Milligramm pro Milliliter vor. Unter dim rotem Licht, bereiten 100 Mikroliter Mischung aus Rhodopsin bei 0,7 Milligramm pro Milliliter und Mini-GO bei 0,2 Milligramm pro Milliliter.
Ergänzen Sie die Mischung mit einem Millimolaren Magnesiumchlorid. Beleuchten Sie die Mischung mit Licht aus einem 495 Nanometer langen Passfilter und inkubieren Sie 30 Minuten lang. Übertragen Sie die Proben auf die Auto-Sampler-Fläschchen und legen Sie sie in das Probenfach.
Programmieren Sie eine Methodendatei, um sequenzielle SEC-Läufe für jede Probe zu automatisieren, wobei der Auto-Sampler 77 Mikroliter der Probe in die Spalte lädt und der Reiniger 25 Milliliter SEC-Puffer pro Ausführung entgeht. Erfassen Sie die Absorption mit 280 Nanometern und 380 Nanometern. Sammeln Sie die Spitzenfraktionen von Rhodopsin und Rhodopsin-Mini-GO-Komplex bei der Retentionsmenge um 12,9 Milliliter.
Analysieren Sie die linken Rhodopsin-Proben und die Spitzenfraktionen des Rhodopsin-Mini-GO-Komplexes auf vier bis 12% SDS-Denaturierunggradientengelen mit Coomassie-Blaufärbung. Bereiten Sie eine 200 Mikroliter Mischung aus Rhodopsin bei einem Milligramm pro Milliliter und PNGase F bei 0,01 Milligramm pro Milliliter vor. Gut mischen und über Nacht auf Eis bebrüten.
Bereiten Sie eine 200 Mikroliter Mischung aus Rhodopsin bei einem Milligramm pro Milliliter und Endo F1-13 bei 0,01 Milligramm pro Milliliter vor. Gut mischen und über Nacht auf Eis bebrüten. Analysieren Sie das Verdauungsergebnis durch SDS-Page und Coomassie blue staining.
In dieser Studie lieferte der kleinräumige Reinigungsaufbau genügend Protein für weitere Analysen. Ultraviolett sichtbare Spektren von Rhodopsin zeigen den dunklen Zustand 9-cis Retinal gebundenrhodopsin in blauen Kurven. Nach der Beleuchtung wird 9-cis Retinal deproteiniert und isomerisiert in alle trans-Retinal.
Die Verhältnisse von Absorbern bei 280 Nanometern über Absorbern von 488 Nanometern und Absorbern bei 280 Nanometern über Absorbern bei 380 Nanometern zeigen die Stabilität von Rhodopsin, das in jedem Waschmittel gereinigt wird. Hier werden Größenausschlusschromatographieprofile von Rhodopsin- und Rhodopsin-Mini-GO-Komplex gezeigt, der in 10 verschiedenen Waschmitteln gereinigt wird. Das Profil der Standard-Markerproteine wird zusammen mit der DDM-Probe als Overlay dargestellt.
Die Interpretation der Spitzenprofile wird für DMNG mit dem idealen Szenario für DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5 und OGNG dargestellt. Das vergrößerte Profil der OGNG-Probe zeigt sowohl Rhodopsin- als auch Rhodopsin-Mini-GO-Komplex, der um das gleiche Retentionsvolumen entwichen ist. Hier wird die SDS-Seitenanalyse von Rhodopsin- und SEC-gereinigten Proben des Rhodopsin-Mini-GO-Komplexes gezeigt.
Diese Abbildung zeigt die SDS-Seitenanalyse der Rhodopsin-Deglycosylierung mit Endo F1 und PNGase F Enzymen. Es ist wichtig, das Waschmittelscreening systematisch durchzuführen, damit die Wirkung jedes einzelnen Waschmittels ohne Mehrdeutigkeit klar verglichen werden kann. Für Proteine unterschiedlicher Menge kann auch der thermische Schichttest verwendet werden, um die Auswirkungen von Reinigungsmitteln auf die Proteinstabilität zu untersuchen.
Dank dieser Methode sind wir in der Lage, einen stabilen Proteinkomplex vorzubereiten und schließlich die in der Geomontage verlorene Kristallstruktur zu lösen. Es lieferte wichtige Einblicke in die GpCR-G-Proteininteraktionsspezifität.
