Wir danken Xufeng Wu für den Zugang zum STORM-Mikroskop. Diese Forschung wurde durch das Intramurale Forschungsprogramm des National Cancer Institute (NCI) Centre for Cancer Research und des National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) unterstützt.

Achtung: Bitte konsultieren Sie vor dem Gebrauch alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS). Mehrere der in diesem Protokoll verwendeten Chemikalien sind toxisch und krebserregend. Bitte wenden Sie bei der Durchführung des Protokolls alle geeigneten Sicherheitshinweise an, einschließlich des Einsatzes von Ingenieurkontrollen (Dunstabzugshaube, Handschuhfach) und persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Laborkittel, Volllängenhose, Zeltschuhe). 1. Multiplexed Imaging von aktivierten T-Zellen <ol><li> Direkt konjugierte Antikörper mit Alexa-647 (A647) -Farbstoff unter Verwendung des Alexa 647 Antikörper-Markierungskits. Befolgen Sie das Etikettierungsprotokoll des Herstellers. HINWEIS: Die Dialyse der Antikörperlösung in 1x PBS wird vor diesem Schritt empfohlen, um die Antikörper-Markierungseffizienz zu erhöhen. </li><li> Spin markierte Antikörper für 5 min bei 20.800 rcf und sammeln Überstand, um aggregierte Antikörper zu entfernen. </li><li> Vorbereitung von fluoreszierenden nanondiamantbeschichteten Deckgläschen <olAufrechtzuerhalten <li> 4-Well-Deckglaskammern (siehe Reagenz / Materialliste) mit 250 μl 0,01% Poly-L-Lysin (PLL) für 15 min, aspirieren und bei 65 ° C für 30 min trocknen. (Kein Spülen vor dem Trocknen). </li><li> Vorbereitung einer Verdünnung von 100 nm FNDs in 1x PBS. Testen Sie verschiedene Verdünnungen, um sicherzustellen, dass genügend FNDs sichtbar sind, jedes Sichtfeld in Schritt 1.2.7 (wir verwenden eine 1: 200 Verdünnung von FNDs, die vom Hersteller bereitgestellt werden). </li><li> Vortex die verdünnten FNDs für 1 min. </li><li> Sonde den FND-Überstand für 30 s bei einer Hochleistungseinstellung. </li><li> Inkubieren Sie den beschallten FND-Überstand in einer PLL-beschichteten 8-Well-Deckglaskammer für 30 min bei Raumtemp. </li><li> 5x mit 1x PBS waschen und die FND-beschichtete Kammer mit 647 nm Laseranregung am TIRF-Mikroskop visualisieren. Idealerweise sollten 4-10 einzelne FNDs in einem Sichtfeld sichtbar sein, da die entsprechende Verdünnung der FNDs in Schritt 1.2.2 (wir verwenden ein 100X-Objektiv mit 256 x 256 Kamera-Pixel-Einstellung, um ein 61 x 61 μm-Sichtfeld zu ergeben) mitMindestens eine FND, die in jedem Quadranten des Bildgebungsfeldes vorhanden ist. Wenn die FNDs gruppiert sind ( dh FNDs mit deutlich höherem Signal als umgebende FNDs und eine Punktspreizfunktion größer als 200 nm), zentrifugieren FNDs bei 6.800 rcf für 1 min und wiederholen das Beschichtungsverfahren unter Verwendung des FND-Überstandes. </li><li> Füge 250 μl anti-CD3-Antikörper (10 μg / mL) in jede Vertiefung zu und inkubiere für 1 Stunde bei 37 ° C oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Lösung entfernen und 1x PBS für 30 Sek. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 5 mal (waschen Sie 5x). </li></ol></li><li> Aktivierung von Jurkat-T-Zellen <ol><li> 1 ml Jurkat-T-Zellen bei 800 rcf für 6 min spinnen und in 300 μl 1x HBS-Lösung resuspendieren. Jurkat-T-Zellen sollten idealerweise in einer Konzentration von 0,5-1,0 x 10 &amp; sup6; Zellen / ml vor dem Spinnen liegen. 1x HBS-Lösung besteht aus HEPES-Puffersalzlösung mit 1% Rinderserumalbumin, wie zuvor beschrieben 22 . </li><li> Füge 150 μl hinzuVon 1x HBS-Lösung in jeder Vertiefung und inkubieren bei 37 ° C für 15 min. </li><li> Füge 50 μl resuspendierte Jurkat T-Zellen zu jeder Vertiefung hinzu und inkubiere für 3 min bei 37 ° C. </li><li> Füge 300 μl 4% Paraformaldehyd zu jeder Vertiefung hinzu und inkubiere für 30 min bei 37 ° C. </li><li> Waschen 3x mit 1x PBS. </li><li> Permeabilisieren von Zellen durch Zugabe von 250 μl 0,1% Triton-X-Lösung für 5 min bei Raumtemp. </li><li> Waschen 3x mit 1x PBS. </li><li> Füge 250 μl 1% Fisch-Gelatinelösung in 1x PBS zu jeder Vertiefung für 30 min bei Raumtemp. </li><li> Waschen 3x mit 1x PBS. </li></ol></li><li> Imaging aktiviert Jurkat T-Zellen mit madSTORM <ol><li> Zugabe von 200 μl markiertem Antikörper bei 0,1-0,5 μg / ml zu fixierten Zellen für 1 Stunde bei Raumtemp. </li><li> Waschen 5x mit 1x PBS. </li><li> Füge 1 ml STORM-Puffer hinzu und decke die Kammer mit einem Glasdeckel ab, um die Einwirkung von Luft zu begrenzen. Der STORM-Puffer wurde zuvor beschrieben 10 . Wir empfehlen maKönig neue STORM Puffer für jede Runde der Bildgebung und Spinnen der STORM Puffer bei 20.800 rcf für 2 min, um Präzipitate zu entfernen. </li><li> Mit einer niedrigen 647-nm-Laserleistung im TIRF-Modus finden Sie eine gefärbte Zelle mit mindestens 3 FNDs im Sichtfeld. Um bei der Lokalisierung von FNDs zu helfen, kann eine gleichzeitige Erregung mit 568 nm Laser verwendet werden, um die Helligkeit des FND-Signals zu erhöhen. HINWEIS: Die in Abschnitt 2.1 beschriebene Leistung der gemittelten Referenzkorrektur verbessert sich durch die Aufnahme von mehr FNDs. </li><li> Erhöhen Sie 647 nm Laserleistung und erwerben Sie Bilder. Normalerweise erwerben wir 10.000 Frames bei 200 ms Belichtung, 125 mW 647 nm Laser, 100X TIRF Objektiv (1,49 NA), 100X EM Verstärkung (5 MHz bei 16 Bit, Umwandlungsverstärkung 1). Details zu unserem Bildaufbau wurden bereits beschrieben 10 . </li><li> Waschen 5x mit 1x TBS. </li><li> Füge 1 ml o hinzu(3,5 M MgCl 2 , 20 mM PIPES, 0,1% Tween-20, pH 6,5) und inkubieren bei Raumtemperatur für 1 min. </li><li> Wiederholung der Elution 3 mal. (Genaue Elutionsbedingungen und die Anzahl der Elutionsspülungen, die benötigt werden, um das Signal zu entfernen, müssen für jeden verwendeten Antikörper überprüft werden). </li><li> 3x mit 1x TBS waschen und 1 ml 1x PBS zugeben. </li><li> Photobleach unter Verwendung von 647 nm Laser bei hoher Leistung (125 mW) mit 405 nm Laser bei 2-5 mW, um A647 Farbstoffe im Dunkelzustand zu aktivieren. Warten Sie, bis alle verbleibenden Signale von nicht-eluiertem Antikörper photobleichen. Typischerweise dauert dies 2-5 s Laserbelichtung. Erfassung von Beispielbildern (~ 100 Frames) mit den STORM-Einstellungen in 1.3.5 nach der Elution und Photobleaching wird empfohlen, um das Entfernen des Signals zu bestätigen. Normalerweise entfernen wir 99,8% des Signals mit dieser Methode. Wir empfehlen die Prüfung der Elutionseffizienz jedes Antikörpers vor der Verwendung in madSTORM wie zuvor gezeigt 10 . </li><li> Füge 250 μl 4% Paraformaldehyd für 15 min hinzu. Diese prEreignisse reverse Vernetzung von festen Molekülen in der Zelle. </li><li> Waschen 3x mit 1x PBS. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1-1.3.12 für die sequentielle Etikettierung mehrerer Ziele. Fig. 1 zeigt ein zusammengesetztes Bild von mehreren Molekülen in einer aktivierten Jurkat-T-Zelle, die unter Verwendung von madSTORM erhalten wurde. </li></ol></li></ol> 2. Driftkorrektur und Ausrichtung von Multiplex-Bildstapeln <ol><li> Driftkorrektur von madSTORM Bildstapeln <ol><li> Öffnen Sie Bilder mit ImageJ. Wir empfehlen, die Bilddateien vor dem Öffnen in ImageJ in ein TIFF-Format umzuwandeln. Verwenden Sie den Rechteck ROI, um eine einzelne FND auszuwählen. Spielen Sie die Zeitspanne, um sicherzustellen, dass die FND in jedem Rahmen des Bildstapels sichtbar ist. Verwenden Sie Run-Analyse im ThunderSTORM-Plugin, um die FND zu lokalisieren. Für die gemittelte Referenzkorrekturmethode, die in 2.1.5 beschrieben ist, ist es wichtig, dass in jedem Bildrahmen eine einzelne FND lokalisiert ist ( dh die Anzahl der identifizierten Peaks sollte e seinQual auf die Anzahl der Frames). </li><li> Wenn die FND nicht in jedem Frame identifiziert wird, wählen Sie eine andere FND. Wenn sich mehrere Peaks in einem einzigen Frame befinden, entfernen Sie den Peak, der am meisten von früheren Peaks abweicht. </li><li> Wiederholen Sie 2.1.2 für jede FND im Bildstapel. Denken Sie daran, dass einige FNDs nicht in den Drift-Korrekturprozess einbezogen werden sollten, damit sie als unabhängiges Messgerät für Driftkorrekturgenauigkeit dienen können, wie in Schritt 2.1.7 beschrieben. </li><li> Für eine schnellere, weniger präzise Driftkorrektur verwenden Sie entweder die in ThunderSTORM enthaltenen Kreuzkorrelations- oder Fiducial-Korrekturalgorithmen, um die FND-Bilder zu korrigieren. Typischerweise verwenden wir 100 Bins, 5-Vergrößerungen und 0,1 Trajektorien-Glättungsfaktor für die Kreuzkorrelation und 10 max Distanz, 0,1 min Marker Sichtbarkeit und 0,01 Trajektorien Glättungsfaktor für die Referenzkorrektur. Kreuzkorrelation und Referenzkorrektur ergibt eine Korrekturdatei, die auf andere FNDs angewendet werden kann, um die Driftkorrekturgenauigkeit zu testen. </li><li> Für eine strengere, präzisere Driftkorrektur, verwenden Sie den gemittelten Fiducial Korrektur (AFC) Algorithmus wie zuvor beschrieben 10 . Dieser Prozess erfordert keine Optimierung von Parametern und liefert eine höhere Lokalisierungsgenauigkeit als durch SMLM-Lokalisierungsalgorithmen vorhergesagt. Die gemittelte Driftkorrektur erfordert jedoch mindestens 4 FNDs und die FNDs in jedem Frame des Bildstapels lokalisiert werden. Die AFC-Driftkorrektur führt mit der Aufnahme von mehr FNDs besser aus, da eine große Anzahl lokalisierter FNDs die verzerrende Wirkung eines Ausreißerpeaks in einem gegebenen Rahmen verringern wird. </li><li> Lokalisieren Sie alle Punktspreizfunktionen innerhalb des Bildstapels mit ThunderSTORM wie zuvor beschrieben 10 . Wir verwenden typischerweise eine Pixelgröße von 100 nm, Photoelektronen pro A / D-Zählwert von 4,28, Basispegel A / D-Zählwert von 100, EM-Verstärkung von 100, PSF: Integrierte Gaußsche Lokalisierung, 5-Pixel-Anpassungsradius, Maximum-Likelihood-Anpassungsmethode und 1,3 Pixel initial sigma</li><li> Wenden Sie den von FNDs erfassten Driftkorrekturfaktor auf Lokalisierungen aus dem gesamten Bildstapel an. Überprüfen Sie das endgültige Bild, um eine korrekte Driftkorrektur zu gewährleisten ( Abbildung 2 ). Der resultierende Driftkorrekturfaktor sollte unabhängig auf FNDs getestet werden, die nicht in der AFC-Prozedur enthalten sind, um den Grad der Driftkorrekturgenauigkeit zu messen. Die Genauigkeit von driftkorrigierten, unabhängigen FNDs sollte nahe dem durchschnittlichen Präzisions- / Unsicherheitswert liegen, der aus dem in Schritt 2.1.6 verwendeten Lokalisierungsalgorithmus berechnet wurde. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.7 für die madSTORM-Bildstapel von sequentiell markierten Antikörpern. Denken Sie daran, dass die Lokalisierung des gleichen Satzes von FNDs in jedem madSTORM-Bildstapel für das folgende Ausrichtungsverfahren entscheidend ist. </li></ol></li><li> Ausrichtung von madSTORM Bildern <ol><li> Berechnen Sie die Schwerpunktposition der Drift-korrigierten FNDs in jedem madSTORM-Bild. Um dies zu tun, finden Sie die mittlere x und y-Achse poFür jede lokalisierte FND und durchschnittlich die mittleren x- und y-Positionen aller FNDs in jedem madSTORM-Bild. Der detaillierte Algorithmus für diesen Schritt wurde zuvor beschrieben 10 . Ausrichten von sequentiellen madSTORM-Bildern unter Verwendung der Schwerpunktpositionen von FND-Markierungen. Um die Ausrichtung durchzuführen, berechnen Sie den Versatz zwischen zwei lokalisierten madSTORM-Bildern, indem Sie die Schwerpunktposition von FNDs im zweiten madSTORM-Bild von der ersten subtrahieren. Dann subtrahiere den Offsetbetrag von allen Lokalisierungen im zweiten madSTORM-Bild. </li><li> Wir empfehlen, das erste madSTORM-Bild als Referenzbild zu verwenden und diesen Ausrichtungsschritt zwischen dem ersten und dem dritten, dem ersten und dem vierten usw. zu wiederholen . Testen Sie die Ausrichtungsgenauigkeit, indem Sie den Versatz zwischen FNDs messen, die nicht im Ausrichtungsprozess enthalten sind. Große Offsets können darauf hindeuten, dass verschiedene Sätze von FNDs verwendet wurden, wenn die Schwerpunktpositionen von sequentiellen madSTORM-Bildern berechnet wurden. </li><li> Wenn ja, Schritte 2.2.1-2.2.2 shouLd wird mit demselben Satz von FNDs wiederholt, um die Ausrichtung durchzuführen. HINWEIS: Es werden benutzerdefinierte Codes für die AFC-Driftkorrektur- und Ausrichtungsverfahren bereitgestellt. </li></ol></li></ol>

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Die sequentielle Multiplex-, Driftkorrektur- und Ausrichtungsprozeduren in madSTORM ermöglichen eine präzise, ​​hochmultiplexierte Visualisierung heterogener Strukturen in Zellen. 10 Darüber hinaus vermeidet madSTORM die Einschränkungen von mehrfarbigem STORM wie chromatische Aberration und suboptimale Photoscharter / Emissionseigenschaften von nicht-fernen roten Farbstoffen 9 , 12 . Da der Elutionsschritt die sterische Interferen...

Es wurde eine Vielzahl von Super-Auflösungs-Mikroskopietechniken entwickelt, um die Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie (~ 200 nm) zu überwinden. Darunter befindet sich eine Kategorie von Techniken, die als Singlemolekül-Lokalisierungsmikroskopie (SMLM) bezeichnet werden, die eine Photoaktivierungslokalisierungsmikroskopie (PALM) und eine stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) umfasst. SMLM-Techniken teilen sich bei der Verwendung von Fluorophoren, die zwischen auf (fluoreszierenden) und aus (dunkel / foto geschalteten) Zuständen umgeschaltet werden können, was eine sequentielle Lokalisierung der Fluoreszenz von einzelnen Molekülen 1 , 2 , 3 ermöglicht . Aufgrund seiner Kompatibilität mit handelsüblichen Farbstoffen und Mikroskopen ist direkt STORM (dSTORM) zu einer weit verbreiteten SMLM-Technik geworden 4 . DSTORM kann routinemäßig ~ 10 nm Lokalisierungsgenauigkeit erreichen, definiert als die Unsicherheit bei der Berechnung des Zentrums eines BeugensIonen-begrenzte Punktspreizfunktion (PSF). Trotz der hohen Genauigkeit, die mit den Lokalisierungsalgorithmen 5 , 6 , 7 geschätzt wird , wurde eine genaue Bestimmung der tatsächlichen Lage einzelner Moleküle durch eine Reihe von Problemen behindert. Zunächst fügt eine mechanische Bewegung des Mikroskopstadiums während der Bildaufnahme eine erhebliche Unsicherheit zur Lokalisierungsgenauigkeit hinzu. Da SMLM-Bilder über Tausende von Zeitraffer-Frames erhalten werden, können nanoskalige Bewegungen des Mikroskopstadiums die Präzision des endgültigen Superauflösungsbildes erheblich beeinträchtigen 8 . Um die Bühnenbewegung während der Bilderfassung zu kompensieren, wird die Bühnendrift üblicherweise aus der regressionsbasierten Anpassung von Binned-Lokalisierungen aus dem Bild selbst (Kreuzkorrelation) oder sequentiellen Lokalisierungen von fiducial-Markern (Referenzkorrektur) 1 , 9 geschätzt. HowevDiese Methoden erfordern die Optimierung mehrerer Parameter für jeden Bildstapel und können keine Bühnenbewegungen bei kurzen Zeitskalen wie mechanische Vibration berücksichtigen. Gold-Nanopartikel und mehrfarbige fluoreszierende Perlen wurden als Fiducial-Marker in SMLM verwendet, sind aber nicht lichtstabil und führen zu einer deutlich geringeren Präzision nach Driftkorrektur als die eingesetzten Stickstoff-Vakanz-Zentrum-Fluoreszenz-Nanodiamanten (FNDs) In madSTORM 10 Neben der Beugungsgrenze wird die Lichtmikroskopie durch spektrale Grenzwerte weiter eingeschränkt. Die gleichzeitige Visualisierung mehrerer Targets erfordert fluoreszierende Sonden mit nicht überlappenden Spektralprofilen, die in der Regel die Fluoreszenz-basierte Lichtmikroskopie auf 6 Farben und SMLM auf 2-3 Farben 4 , 11 , 12 beschränken . Darüber hinaus verursacht eine nichtlineare chromatische Aberration eine Fehlausrichtung von mehrfarbigen Bildern, wDie umfangreiche Ausrichtungsverfahren mit mehrfarbigen Markierungen 8 , 13 erfordern. Um diese Grenzen zu überwinden, haben frühere Studien mehrere Targets unter Verwendung eines wiederholten Photobleichens oder chemischen Quenchens von sequentiell gebundenen Fluorophoren 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 abgebildet. Während diese Verfahren die spektralen Grenzen der Mikroskopie überwinden können, ist das Fluoreszenzbleichen bekannt als ein toxisches Verfahren 20 , und ein verlängertes Bleichen oder Abschrecken kann unerwünschte Nebenwirkungen wie den Verlust der Vernetzung verursachen. Darüber hinaus könnte die Anhäufung von fluoreszierenden Sonden zu einer sterischen Blockierung von Bindungsstellen in der Probe führen, was ein großflächiges Multiplexen und ein robustes Targeting von Epitopen verhindert. Um eine solche sterische Störung zu vermeiden,Tudy erreichte Multiplexing mit stochastischem Austausch von frei diffundierenden Proteinfragmenten 21 . Während dieses Verfahren eine dichte Markierung von zellulären Strukturen ermöglicht, erfordert es eine umfangreiche biochemische Präparation, um Peptidfragmente zu isolieren, kann keine Einzelmolekülpositionen lokalisieren und erleichtert nicht leicht das Multiplexen mit großem Maßstab unter Verwendung von handelsüblichen Sonden. Wir präsentieren ein detailliertes Video-Protokoll, das die sequentielle Bindung und Elution von fluoreszierenden Antikörpern für gemultiplexte, antikörpergrßenbeschränkte dSTORM (madSTORM) -Bildgebung und die Verwendung von fluoreszierenden Nanondiamanten beschreibt, um eine präzise Driftkorrektur und Ausrichtung zu erreichen.

<table><tbody><tr><td>8 well coverslip chamber</td><td>Lab-tek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>0.1% Poly-L-Lysine solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>NV-100 nm Fluorescent Nano-diamond</td><td>Adamas</td><td>Red FND</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3&amp;epsilon; antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin, Fraction V</td><td>KSE Scientific</td><td>98-100P</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>10% Paraformaldehyde</td><td>EMS</td><td>15712</td><td>Carcinogen</td></tr><tr><td>Gelatin from fresh water fish skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647 antibody labeling kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>A20186</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138924</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7154</td><td>Highly toxic, air sensitive</td></tr><tr><td>Cysteamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>Cyclooctatetraene 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138924</td><td>Highly toxic, air sensitive</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3210</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3385</td><td></td></tr></tbody></table>

highly multiplexed, super-resolution imaging of t cells using madstorm

Die Imaging heterogener zellulärer Strukturen unter Verwendung einer Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie wurde durch unzureichende Lokalisierungsgenauigkeit und Multiplexfähigkeit behindert. Unter Verwendung von fluoreszierenden Nano-Diamant-Markierungsmarkern beschreiben wir die Driftkorrektur- und Ausrichtungsverfahren, die erforderlich sind, um eine hohe Präzision in der Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie zu erhalten. Zusätzlich wird eine neue Multiplex-Strategie, madSTORM, beschrieben, bei der mehrere Moleküle in der gleichen Zelle mit sequentieller Bindung und Elution von fluoreszierenden Antikörpern gerichtet werden. MadSTORM wird auf einer aktivierten T-Zelle demonstriert, um die Orte verschiedener Komponenten innerhalb einer membrangebundenen, Multi-Protein-Struktur, die so genannte T-Zell-Rezeptor-Mikrocluster, zu visualisieren. Darüber hinaus wird die Anwendung von madSTORM als allgemeines Werkzeug zur Visualisierung von Multi-Protein-Strukturen diskutiert.

Das sequentielle Elutions- und Färbeverfahren wurde verwendet, um das gemultiplexte madSTORM-Bild von Mikroclustern und anderen Strukturen in einer aktivierten Jurkat-T-Zelle zu erzeugen ( Fig. 1 , Kontrollfigur-Ausrichtungen). Jedes pseudofarbige Bild repräsentiert eine Runde der madSTORM-Bildgebung, die in den Schritten 1.1.1 bis 1.3.13 erworben wurde. Wie zuvor beschrieben, sollte das Sichtfeld auf Restsignal von vorherigem, nicht-eluiertem Antikörper ...

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Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Wir zeigen eine Methode, um mehrere Moleküle innerhalb heterogener Nanostrukturen bei Einzelmolekülgenauigkeit unter Verwendung sequentieller Bindung und Elution von fluoreszenzmarkierten Antikörpern abzubilden.

Hochmultiplexed, Super-Auflösung Bildgebung von T-Zellen mit madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

highly-multiplexed-super-resolution-imaging-of-t-cells-using-madstorm

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.4K Aufrufe.  National Institutes of Health.  Wir zeigen eine Methode, um mehrere Moleküle innerhalb heterogener Nanostrukturen bei Einzelmolekülgenauigkeit unter Verwendung sequentieller Bindung und Elution von fluoreszenzmarkierten Antikörpern abzubilden. 

Serie: Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the structure-function relationship of these receptors in situ, we need to visualize and track them on the live cell surface with enough spatiotemporal resolution. Here we show how to use recently developed Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) to image T-cell receptors (TCRs) four-dimensionally (4D, space and time) at the live cell membrane. T cells are one of the main effector cells of the adaptive immune system, and here we used T cells as an example to show that the signaling and function of these cells are driven by the dynamics and interactions of the TCRs. LLSM allows for 4D imaging with unprecedented spatiotemporal resolution. This microscopy technique therefore can be generally applied to a wide array of surface or intracellular molecules of different cells in biology.

The goal of this protocol is to show how to use Lattice Light-Sheet Microscopy to four-dimensionally visualize surface receptor dynamics in live cells. Here T cell receptors on CD4+ primary T cells are shown.

Visualisierung der Oberflächen-T-Zell-Rezeptordynamik vierdimensional mit Lattice Light-Sheet-Mikroskopie

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Biochemie

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

Hochdurchsatz totale interne Reflexionfluoreszenz und direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie mit einem Photonischen Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is an effective methodology for tumor evaluation that improves the understanding of the tumor microenvironment. The visualization of protein expression in formalin-fixed, paraffin-embedded&#160;tissues is achieved when a specific fluorophore is annealed to an antibody-bound barcode via complementary oligonucleotides and then sample imaging is performed; indeed, this method allows for the use of customizable panels of more than 40 antibodies in a single tissue staining reaction. This method is compatible with fresh frozen tissue, formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, cultured cells, and peripheral blood mononuclear cells, meaning that researchers can use this technology to view a variety of sample types at single-cell resolution. This method starts with a manual staining and fixing protocol, and all the antibody barcodes are applied using an antibody cocktail. The staining fluidics instrument is fully automated and performs iterative cycles of labeling, imaging, and removing spectrally distinct fluorophores until all the biomarkers have been imaged using a standard fluorescence microscope. The images are then collected and compiled across all the imaging cycles to achieve single-cell resolution for all the markers. The single-step staining and gentle fluorophore removal not only allow for highly multiplexed biomarker analysis but also preserve the sample for additional downstream analysis if desired (e.g., hematoxylin and eosin staining). Furthermore, the image analysis software enables image processing-drift compensation, background subtraction, cell segmentation, and clustering-as well as the visualization and analysis of the images and cell phenotypes for the generation of spatial network maps. In summary, this technology employs a computerized microfluidics system and fluorescence microscope to iteratively hybridize, image, and strip fluorescently labeled DNA probes that are complementary to tissue-bound, oligonucleotide-conjugated antibodies.

Multiplexed barcoding image analysis has recently improved the characterization of the tumor microenvironment, permitting comprehensive studies of cell composition, functional state, and cell-cell interactions. Herein, we describe a staining and imaging protocol using the barcoding of oligonucleotide-conjugated antibodies and cycle imaging, which allows for the use of a high-dimensional image&#160;analysis technique.

Multiplex-Barcoding-Bildanalyse zur Immunprofilierung und räumlichen Kartierung bei der Einzelzellanalyse von Paraffingewebeproben

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

Krebsforschung

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Imaging the Human Immunological Synapse

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) and an effector helper T lymphocyte (Th) cell, and to record the images corresponding to the first stages of the IS formation and the subsequent trafficking events (occurring both in the APC and in the Th cell). These events will eventually lead to polarized secretion at the IS. In this protocol, Jurkat cells challenged with Staphylococcus enterotoxin E (SEE)-pulsed Raji cells as a cell synapse model was used, because of the closeness of this experimental system to the biological reality (Th cell-APC synaptic conjugates). The approach presented here involves cell-to-cell conjugation, time-lapse acquisition, wide-field fluorescence microscopy (WFFM) followed by image processing (post-acquisition deconvolution). This improves the signal-to-noise ratio (SNR) of the images, enhances the temporal resolution, allows the synchronized acquisition of several fluorochromes in emerging synaptic conjugates and decreases fluorescence bleaching. In addition, the protocol is well matched with the end point cell fixation protocols (paraformaldehyde, acetone or methanol), which would allow further immunofluorescence staining and analyses. This protocol is also compatible with laser scanning confocal microscopy (LSCM) and other state-of-the-art microscopy techniques. As a main caveat, only those T cell-APC boundaries (called IS interfaces) that were at the right 90&#176; angle to the focus plane along the Z-axis could be properly imaged and analyzed. Other experimental models exist that simplify imaging in the Z dimension and the following image analyses, but these approaches do not emulate the complex, irregular surface of an APC, and may promote non-physiological interactions in the IS. Thus, the experimental approach used here is suitable to reproduce and to confront some biological complexities occurring at the IS.

This protocol images both the immunological synapse formation and the subsequent polarized secretory traffic towards the immunological synapse. Cellular conjugates were formed between a superantigen-pulsed Raji cell (acting as an antigen-presenting cell) and a Jurkat clone (acting as an effector helper T lymphocyte).

Bildgebung der humanen immunologischen Synapse

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) ...

Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density and the location of immune cells in the TME have important diagnostic and prognostic values. Multiomic profiling of the TME has exponentially increased our understanding of the numerous cellular and molecular networks regulating tumor initiation and progression. However, these techniques do not provide information about the spatial organization of cells or cell-cell interactions. Affordable, accessible, and easy to execute multiplexing techniques that allow spatial resolution of immune cells in tissue sections are needed to complement single cell-based high-throughput technologies. Here, we describe a strategy that integrates serial imaging, sequential labeling, and image alignment to generate virtual multiparameter slides of whole tissue sections. Virtual slides are subsequently analyzed in an automated fashion using user-defined protocols that enable identification, quantification, and mapping of cell populations of interest. The image analysis is done, in this case using the analysis modules Tissuealign, Author, and HISTOmap. We present an example where we applied this strategy successfully to one clinical specimen, maximizing the information that can be obtained from limited tissue samples and providing an unbiased view of the TME in the entire tissue section.

Here, we describe a simple and accessible strategy for visualizing, quantifying, and mapping immune cells in formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue sections. This methodology combines existing imaging and digital analysis techniques with the purpose of expanding the multiplexing capability and multiparameter analysis of imaging assays.

Visualisierung, Quantifizierung und Kartierung von Immunzellpopulationen in der Tumormikroumgebung

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

Testproben zur Optimierung STORM Super Resolution Mikroskopie

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Biologie

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, polarity, and motility. The organization of the actin and microtubule networks has been extensively studied but that of IFs is not yet fully characterized. IFs have an average diameter of 10 nm and form a network extending throughout the cell cytoplasm. They are physically associated with actin and microtubules through molecular motors and cytoskeletal linkers. This tight association is at the heart of the regulatory mechanisms that ensure the coordinated regulation of the three cytoskeletal networks required for most cell functions. It is therefore crucial to visualize IFs alone and also together with each of the other cytoskeletal networks. However, IF networks are extremely dense in most cell types, especially in glial cells, which makes its resolution very difficult to achieve with standard fluorescence microscopy (lateral resolution of ~250 nm). Direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) is a technique allowing a gain in lateral resolution of one order of magnitude. Here, we show that lateral dSTORM resolution is sufficient to resolve the dense organization of the IF networks and, in particular, of IF bundles surrounding microtubules. Such tight association is likely to participate in the coordinated regulation of these two networks and may, explain how vimentin IFs template and stabilize microtubule organization as well as could influence microtubule dependent vesicular trafficking. More generally, we show how the observation of two cytoskeletal components with dual-color dSTORM technique brings new insight into their mutual interaction.

The overall goal of this methodology is to give the optimal experimental conditions from sample preparation to image acquisition and reconstruction in order to perform 2D dual color dSTORM images of microtubules and intermediate filaments in fixed cells