Wir erkennen an, Mittel aus dem chemischen und biologischen Messtechnik-Programm von National Measurement Büro in Großbritannien. Wir danken Sebastian van de Linde, Miklos Erdelyi und Eric Rees für technische Beratung und Anregungen. Wir danken Miklos Erdelyi, Eric und Max Rees Ryadnov für hilfreiche Kommentare und Diskussionen zu diesem Manuskript.

Hinweis: In diesem Protokoll werden Tipps und Anregungen folgende bestimmte Schritte gefunden. Die Bezeichnung &quot;* 1&quot; zeigt an, dass Note 1 ist relevant für diesen bestimmten Schritt, und so weiter. 1. Leuchtstoff-Beschichtung von Glas-Dextran <ol><li> Nach Zugabe von 200 ul 0,01% Poly-L-Lysin-Lösung in jede Vertiefung einer 8-Kammerdeckgläser und Inkubation für 10 min. Entfernen mit einer Pipette, um sicherzustellen, dass keine Restflüssigkeit ist. </li><li> Rekonstituieren Dextran-Alexa 647 * 1 nach den Anweisungen des Herstellers, um eine 2 mg / ml Stammlösung erstellen. Daraus verdünnen 0,25 ul in 25 ul entionisiertem Wasser, um eine 20 ug / ml Lösung. </li><li> Um eine hohe Dichte der Beschichtungs Dextran-Alexa 647-Lösung zu erstellen verdünnt 20 &amp;mgr; l der 20 &amp;mgr; g / ml Lösung in einer Gesamtmenge von 200 &amp;mgr; l entionisiertem Wasser. Für eine mitteldichte Lösung zu verdünnen 2 ul in 200 ul de-ionisiertes Wasser (1:10.000 Verdünnung aus dem ursprünglichen Stammlösung). Für einen niedrigenDichte Lösung zu verdünnen 0,2 ul in 200 ul de-ionisiertes Wasser (1:100.000 Verdünnung aus dem ursprünglichen Stammlösung). </li><li> In 200 ul der verdünnten Dextran-Alexa 647-Lösungen in jede Vertiefung und Inkubation für 10 min. Längere Inkubationszeiten können verwendet werden, was zu einer dichteren Beschichtung Dextran zurückzuführen sind. Ausziehen und mit H 2 O dreimal * 2 </li></ol> Anmerkung 1: Andere Dextran-Farbstoff-Konjugate können verwendet werden. Unkonjugierten Dextran kann auch Farbstoffe konjugiert werden, falls gewünscht Kombinationen sind nicht im Handel erhältlich. Anmerkung 2: Die gleichen Dextran Kammern über einen Zeitraum von Wochen wieder abgebildet, obwohl die Gleichmäßigkeit der Fluoreszenz kann verringern. Lagerung bei 4 ° C in Abwesenheit eines Puffers wird empfohlen. 2. Leuchtstoff Aktin-Filamente auf Glas <ol><li> Nach Zugabe von 200 ul 0,01% Poly-L-Lysin-Lösung in jede Vertiefung und Inkubieren der Kammer für 10 min * 3. Rebewegen sich mit einer Pipette, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit übrig ist. </li><li> Hinzufügen von 90 &amp;mgr; l Actin allgemeinen Puffer (gemäß den Anweisungen des Herstellers rekonstituiert) zu jeder Kammer. In 10 ul von 10 uM vorgeformte Aktin-Filament-Lösung und 1 ul Phalloidin-Alexa 647 (0,2 Einheiten, wenn in 1,5 ml Methanol als den Anweisungen des Herstellers) gelöst und vorsichtig pipettieren, auf und ab zu mischen. Inkubation: 30 min * 4. </li></ol> Anmerkung 3: Eine Erhöhung des Volumens des Filaments Lösung innerhalb der Kammer zu weniger Filamente Bindung an die Poly-L-Lysin beschichteten Glas. Anmerkung 4: Die Inkubationszeiten von bis zu 48 Stunden bei 4 ° C mit guten Ergebnissen getestet. Bildqualität verschlechtert Aktin-Filament einmal Kammer Schaltpuffer so ist es nicht empfehlenswert, die dieselbe Probe für mehr als einen Tag benutzen ausgesetzt. 3. Microsphere Leuchtstoffkügelchen als Bezugsmarken <ol><li&gt; Verdünnen 1 ul TetraSpeck Perlen in 200 ul PBS und mischen. </li><li> Fügen Sie die verdünnt Perlen in einem bildgebenden Kammer und warten Sie 15 min * 5. Entfernen Sie die Lösung und 3 x waschen mit PBS vor der Bildgebung. </li></ol> Anmerkung 5 - die Verdünnung und Inkubationszeit kann angepasst werden, um unterschiedliche Dichten von Perlen zu erhalten. Dieses Protokoll führt in der Regel zwischen 3 bis 10 Perlen pro 20,5 x 20,5 um um Feld-of-view. 4. Epidermal Growth Factor Zellfärbung <ol><li> HeLa-Zellen in Kultur Abbildungskammern auf etwa 80% Konfluenz in Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung ergänzt. </li><li> Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen mit PBS. Dann fügen Sie 500 ul von 4% Formaldehydlösung (4 ml 10% Formaldehydlösung, 1 ml 10X PBS, 5 ml Wasser) für 10 min. Entfernen Sie die Formaldehyd und 3 x waschen mit PBS. Nicht in die Zellen d bleibenry und verwenden Sie immer PBS gepufferten Lösungen zu hypotone Stress zu vermeiden. </li></ol> ACHTUNG - Formaldehyd ist extrem giftig. Stellen Sie sicher, dass geeignete Schutzhandschuhe, Schutzbrille und Laborkittel getragen werden. Überprüfen Sie die lokalen Richtlinien für die Entsorgung von Formaldehyd. <ol start="3"><li> Rekonstituieren EGF-Alexa 647 nach Herstellerangaben um eine 50 ug / ml Stammlösung erstellen. In 2 ul dieser Stammlösung zu 200 ul 0,1% BSA-Lösung (in PBS). Entfernen Sie die PBS von den Zellen, fügen Sie den EGF-Lösung und Inkubation für 30 min. </li><li> Entfernen Lösung und wäscht 3 mal mit PBS vor der Zugabe einer Blockierungslösung aus 0,1% BSA (in PBS) für 15 min. Entfernen Sie diese und waschen noch 3 mal mit PBS vor der Bildgebung. </li></ol> 5. Schalt Buffer Vorbereitung <ol><li> Bilden eine Enzymstammlösung (A) mit 10 &amp;mgr; l Katalase (20 ug / ml), 20 ul 1 M Tris (2-carboxyelthyl) phosphin-Hydrochlorid (4 mM), 2,5 ml Glycerin (50%), 125 &amp;mgr; l1 M KCl (25 mM), 100 ul 1 M pH 7,5 Tris-HCl (20 mM), 5 mg Glucoseoxidase (1 mg / ml) und oben bis zu 5 ml Volumen mit diH20. Dies ist ausreichend, um 100 x 50 ul-Aliquots, die bei -20 ° C gelagert und für bis zu 1 Jahr verwendet werden kann, zu machen. </li><li> ) Machen Sie eine Glucose-Stammlösung (B) mit 4 g Glucose (100 mg / ml), 4 ml Glycerin (10%) und 36 ml diH20. Dies ist ausreichend, um 100 x 400 ul Aliquote, die gelagert werden können machen - 20 ° C und bis zu 1 Jahr verwendet. </li><li> Machen Sie eine Reduktionsmittel-Vorratslösung (C) mit 113,6 mg MEA-HCl (1M) und 1 ml diH 2 0. Verwenden Sie frische oder machen 10 x 100 ul Aliquots, die bei -20 ° C gelagert und für bis zu 1 Monat verwendet werden können (nicht Aliquots einfrieren). </li><li> Kurz vor der Bildgebung, mischen das Enzym (A), Glucose (B) und zusammen Reduktionsmittel (C) Stammlösungen im Verhältnis 50 ul, 400 ul, 100 ul und auf 1 ml mit PBS * 6. Dieser Puffer wird nun abfangen Sauerstoff und haben eine reduzierende Umgebung (100 mM MEA-HCl) * 7. * 8 8.5 (Einstellung ist normalerweise nicht notwendig) - Der endgültige pH-Wert sollte im Bereich von 6,0. </li></ol> Anmerkung 6 - dieser Puffer zur Verwendung mit Carbocyanin-Farbstoffe, wie Cy5 und Alexa 647. Anmerkung 7 - die endgültigen Enzymkonzentrationen sind 50 ug / ml (5 U / ml) Glucose-Oxidase und 1 ug / ml (40-60 Einheiten / ml) an Katalase. Die enzymatische Aktivität (Einheiten) wird von Lieferanten gegeben und können variieren. Die Berechnungen für Katalase annehmen, dass 1 ug / ml Endkonzentration nach dem Schritt 5.4 werden mit 50 Einheiten des Enzyms enthalten. Verschiedene Pufferzusammensetzungen einschließlich ähnlicher sauerstoffbindende Komponenten 21,30,40 gefunden werden. Für eine Zusammenfassung der Puffer-und Farbstoffkombinationen siehe Referenzen 28,29. Glycerin und TCEP sind für langfristige Lagerung bei -20 ° C erforderlich Anmerkung 8 - wenn die Bildgebung Aktinfilamente hinzufügen 2 mM MgCl 2 und 0,2 mM ATP zur Stabilisierung ter Filamente. 6. Mikroskop Erwerb von STORM-Daten (mit Alexa 647-Farbstoff) <ol><li> Schalten Sie die STORM / PALM Mikroskop, vorzugsweise mindestens 3 Stunden vor der Belichtung, damit ein thermisches Gleichgewicht zu erreichen. Vor diesem Abbildungs ​​eine erhöhte Chance Drift. </li><li> Setzen Sie die Bildraum in den Mikroskoptisch Probenhalter. Sicherzustellen, dass die Probe fest an der Halterung und ist flach. </li><li> Entfernen Sie die PBS von der Bildkammer und dann oben mit dem Schalt Puffer zu füllen. Ein Deckglas sorgfältig über die Oberseite der Kammer, um sicherzustellen, dass sich keine Blasen an alle und die gesamte Kammer bedeckt. Füllen Sie zusätzliche Puffer oder PBS, wenn irgendwelche Luftblasen zu sehen sind sonst Puffer Leistung sinken kann. </li></ol> VORSICHT -, um die Chancen der lateralen und axialen Drift der Probe in Bezug auf die Objektivlinse zu minimieren, wird empfohlen, dass die Probe und der Puffer äquilibrieren gelassenauf Raumtemperatur für mindestens 15 min vor der Bilderzeugung. <ol start="4"><li> Suchen Sie eine Leuchtstoffstruktur von Interesse, die abgebildet werden. Wählen Sie den gewünschten Beleuchtungswinkel, in diesem Fall ein TIRF oder stark geneigten Winkel wird empfohlen, da dies verbessert das Signal-zu-Rausch-Verhältnis durch Minimieren out-of-focus-Licht, die besonders von Vorteil für die Zellproben ist. Werfen Sie einen Referenzbeugungsbegrenzten Bild der Struktur vor der STORM-Bildgebung. </li><li> Erhöhung des Anregungslasers (mit einer geeigneten Anregungswellenlänge von ca. 640 nm) auf eine hohe Leistung, entsprechend etwa 2 kW / cm 2, während Bildgebung mit Kameraeinstellungen von 10 ms Belichtung und einer Zykluszeit von etwa 50 Hz (Frames pro Sekunde) . Sobald die Fluorophore sind in eine spärlich Blinkmuster (wahrscheinlich innerhalb von 10 Sekunden für die meisten Proben) umge sammeln 10.000 Frames * 9. </li></ol> Hinweis 9 - 10000 Rahmen ist für die hier beschriebenen Probenaber es kann notwendig sein, um die Rahmennummer zu 50.000 oder mehr für andere Proben zu erhöhen. 7. Die Rekonstruktion superauflösende Bilder von Raw-Daten (mit Regensturm) <ol><li> Öffnen Sie die Datei rainSTORM.m aus MATLAB und führen (Abbildung 1A). </li><li> In der Regensturm Fenster (Abbildung 1B) wählen Sie die Bilddatei mit der Schaltfläche Durchsuchen analysiert werden. Dies sollte ein. Tif-Datei (ImageJ kann verwendet werden, um andere Dateitypen in eine tif-Format zu konvertieren) sein. Ändern Sie die Pixelbreite, um die Rohdaten des Mikroskop-System verwendet, um die Daten zu erwerben * 10 entsprechen. Lassen Sie die anderen Werte auf die Standard. </li></ol> Anmerkung 10 - Eine typische EMCCD Kamera hat eine Pixelgröße von 16 um so auf ein System mit einem 100-fach Objektiv die Bildpunktgröße auf dem Bild 160 nm sein. Kommerziellen Systemen die Pixelgröße in der Regel innerhalb der Software angezeigt. Pixelgrößen variieren zwischen 100 nm und 160 nm für die meisten Lokalisierungs Mikroskopen.<ol start="3"><li> Drücken Sie die Taste &quot;Prozessbilder&quot; und warten, bis ein vorläufiges Bild erscheint. Die Dauer der Behandlung wird von der Dateigröße, Computer-Spezifikation und der Anzahl der Kandidaten blinkt in den Rohdaten * 11 ab. </li></ol> Anmerkung 11 - 10.000 Bildsequenzen von Aktin und EGF Daten dauerte 23 Sekunden und 25 Sekunden, um jeweils unter Verwendung eines PC mit einem Intel Xeon E5420 CPU. Mit dem gleichen Computer ohne Parallelverarbeitung Toolbox in MATLAB, oder mit einem Computer ohne Mehrkern-Verarbeitung, waren mal 66 sec und 81 sec auf. <ol start="4"><li> So generieren Sie einen aktualisierten Super-Resolution-Bild drücken Sie die Taste &quot;Open-Bewerter&quot; und ein zweites Fenster wird angezeigt (Abbildung 1C). Drücken Sie die &quot;Kontrast anpassen&quot;-Taste, um die Bildanzeige zu ändern wie gewünscht (1D). In einigen Fällen, wo das Bild sehr dunkel ist der Maximalwert verringert werden sollte. </li><li> Verwenden Sie die Drehzahliewer Fenster (Abbildung 1C), nützliche Bildqualitätsmetriken zu generieren und zu verfeinern, die Super-Resolution-Bild weiter. Stellen Sie die ersten drei Qualitätskontrollparameter auf Werte von 4.000, 0,1 und 0,8 bis 2,0 bzw. * 12. Aktualisieren Sie die Zählungen pro Photon-Wert, der entweder auf einem Photonenkalibrierungsmessung oder mit Photon-Kurve von der Kamera-Hersteller für einen bestimmten EM-Gain-Einstellung angegeben Eichkurve Werte beruhen sollte. Dies ist entscheidend für den Erhalt genaue Präzision und Auflösung * 13 Messungen. </li></ol> Anmerkung 12 - Signal Grafen lehnt blinkt basierend auf Helligkeit Kriterien. Je höher der Wert, desto heller die Blink sein muss, werden als Lokalisierungs im endgültigen Bild akzeptiert. Dies muss je nach den Photonenausgang des Farbstoffs und die Belichtungszeit und die Empfindlichkeit der Kamera verändert werden. Toleranz ablehnt blinkt, wenn eine signifikante quadratische Fehler zwischen dem Signal und der angepassten Gauß dh double Spitzen. PSF Sigma Bereich lehnt blinkt, wenn die Einbaubreite der PSF aus diesem Bereich liegt, kann also eine engere Bereich verwendet werden, um out-of-focus-Signale und großen aggregierten Blobs von konstanten Fluoreszenz abzulehnen. Mit einem breiteren Spektrum kann in Fehllokalisation Artefakte im endgültigen Bild erscheinen, führen. In der Praxis empfiehlt es sich, erste Qualitätskontrolle durchführen mit Hilfe der Lokalisierungsgenauigkeit Cutoff-Parameter. Anmerkung 13 - für mehr Auflösung Metriken siehe Referenzen 23,27. In Kürze durch das Wissen, die Anzahl der Photonen, die von jedem hergestellt blinken ist es möglich, die Lokalisierungsgenauigkeit jedes Lokalisierungs berechnen und somit ableiten Gesamtmittel Präzision Schätzungen für das gesamte Bild. Mit einem Andor Ixon DU-897E mit einem Gain-Einstellung von 200 den Grafen pro Photon-Wert beträgt 9,04. <ol start="6"><li> Ändern Sie die Lokalisierungsgenauigkeit Cutoff (1C), um zwischen der Optimierung mittlere Lokalisierungs precis KompromissIonen gegen Lokalisierungsnummer in dem endgültigen Bild. Werte von 30-50 nm in Abhängigkeit von der Qualität der Daten und der Probe empfohlen. Beide die Histogramme und die info.txt Dateien können verwendet werden, um diese Entscheidung (1F und 1G) zu informieren. </li><li> Die Rekonstruktion Skalierungsfaktor (Abbildung 1C) Standard ist 5, die Super-Resolution-Pixel des 32-nm-Annahme, dass die Pixelbreite in der Originalbilder ist 160 nm erzeugen wird. Wenn die RAW-Bilder haben eine Pixelgröße von 100 nm das wird super-aufgelöste Bilder mit Pixeln von 20 nm zu erzeugen. Erhöhen Sie den Skalierungsfaktor, der kleiner Super-Resolution-Pixel im fertigen Bild * 14 zu produzieren. </li></ol> Anmerkung 14 - Auflösung der Lokalisationsmikroskopie, hängt von der für die Visualisierung (dh die Pixelgröße von einem einfachen Histogramm-Rekonstruktion) sowie die Lokalisierungsgenauigkeit erforderlich Glättung. In der Praxis sollte die Rekonstruktionspixelgröße in der Regel kleiner als die Lokalisierungs seinPräzision (siehe mittlere Präzisionsschätz Metrik in der Info-Text-Datei - Schritte 6.11 &amp; 6.12). In diesem Fall ist der Auflösungsverlust durch Rekonstruktion Pixelgröße klein 23,27 sein. Beispielsweise können die Durchschnittsgenauigkeit Schätzungen in der Zeilen-und Spaltenrichtung von Fig. 4E sind 16,1 nm und 16,2 nm aufweist. Eine Pixelgröße von 16 nm wurde verwendet, um diese Daten (Rekonstruktion Skalierungsfaktor von 10 mit einem ursprünglichen Pixelbreite von 160 nm) sichtbar zu machen. <ol start="8"><li> Ändern Sie die Grenze Frame-Bereich (1C), um den Wiederaufbau, um Teilmengen der Rohdaten zu beschränken, zum Beispiel [2001-inf] würde die ersten 2000 Bilder von Rohdaten aus. </li><li> Drücken Sie die Schaltfläche &quot;Run Rezensent&quot; (1C), um eine aktualisierte Super-Resolution-Bild (1E) zu erzeugen. </li><li> Drücken Sie die &#39;Ansicht Histogramme &quot;-Taste (Abbildung 1C), um die Bildqualitätsmetriken (1F) * 15 anzuzeigen. </li></ol&gt; Anmerkung 15 - Die Grafik oben rechts, welches die Anzahl der angenommenen Lokalisierungen gegen Kamerarahmennummer und der Thompson-Lokalisierung Precisions Histogramm in der rechten unteren Ecke (1F) kann verwendet werden, um die Option Lokalisierungsgenauigkeit Cutoff-Rezension zu informieren. Zum Beispiel würde unter Verwendung einer 50 nm-Sperr alle Lokalisationen mit schlechter Genauigkeit von in dem endgültigen Bild Superauflösungs aufnehmen lässt. <ol start="11"><li> Drücken Sie die Schaltfläche &quot;Bild speichern&quot; in der Gutachter (1C), um alle diese Daten * 16 speichern. </li></ol> Anmerkung 16 - Zwischen 3 und 5-Dateien können je nach den gewählten (Bild Summe, STORMdataImage, STORMprocessed, Infos &amp; hists) Optionen gespeichert werden, siehe Abb. 1G. Die STORM verarbeitete Bild mit modifizierten Kontrast und Farbkarten angezeigt. Die STORMdataImage ist ein Graustufenbild, bei dem der Grauwert jedes Pixels entspricht der tauber von Lokalisierungen, die in ihm identifiziert wurden. <ol start="12"><li> Nach Prüfung der Daten (zB Info.txt Datei und Histogramme) Rückkehr zum Schritt 7.6 und wiederholen Sie die nachfolgenden Schritte mit verschiedenen Rezensent Parameter, falls gewünscht. Mit &#39;Save Image &quot;in Schritt 7.11 werden die zuvor gespeicherten Daten überschreiben. </li></ol> 8. Box-Tracking-und Drift-Korrektur (mit Regensturm) <ol><li> Folgen Sie den Schritten von 7,1 bis 7,9, um ein Bild in der üblichen Weise zu erzeugen. </li><li> Drücken Sie die Taste &#39;Box-Tracking&#39; in der Rezensent (1C), und klicken und ziehen Sie eine Box auf das Bezugsmarken oder die Struktur der Zinsen auf das Bild überprüft. </li><li> Warten Sie, bis ein neues Bild erscheint, die die &quot;Boxed Positionen&quot; (siehe 6B, 6C und 6F für Beispiele) angezeigt wird. Speichern Sie dieses Bild, wenn gewünscht. </li><li> Wenn das Objekt von Interesse ist ein Referenz-Markers dann Driftkorrektur kann durch Anklicken des &#39;Set Anchor &quot;-Taste gefolgt von der&quot; Sub durchgeführt werdenTrakt Drift &quot;-Taste. Schließlich klicken Sie auf &quot;Run Rezensent &#39;wieder eine neue STORM Bild, das jetzt werden alle Lokalisierungen nach den Bezugsmarken Positionen korrigiert generieren. Die Wulst Positionen werden von der endgültigen Bewertung Bild gelöscht. </li><li> Wenn es andere Bezugsmarkierungen im endgültigen Bild Drift korrigiert, können diese durch Drücken von &quot;Box-Tracking &#39;entfernt werden,&#39; Löschen Boxed &#39;und dann so oft&#39; Run-Bewerter&quot;, wie gewünscht. </li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Wir zeigen, mit einigen einfachen Testproben und der frei verfügbaren Software-Verarbeitung Rainstorm ist es möglich, STORM Super-Resolution Imaging optimieren. Diese Werkzeuge und Methoden wird nützliche Startpunkte für neue Benutzer und Möglichkeiten für erfahrene Benutzer das Vertrauen in ihre Mikroskope und ihre Verwendung von ihnen für die biologische und zelluläre Strukturen mit bisher unerreichter Genauigkeit untersuchen zu erhöhen. Durch Verwendung einer Kombination von Proben mit bekannter oder gut verstanden Strukturen und einem Algorithmus, der eine Anzahl von nützlichen Bildqualitätsmetriken, wie Mittelwert Präzisionsschätzungen Lokalisierungsnummer und Histogramme, ist es möglich, die Bildqualität zu verbessern und mehr Vertrauen haben, erzeugen kann, in der bildgebenden Verfahren STORM. Es gibt keine one-size fits all Ansatz zur Erfassung der Daten, da es eine Reihe von verschiedenen kommerziellen und selbst gebauten Mikroskop-Konfigurationen, die verwendet werden können. Darüber hinaus gibt es viele Probenvorbereitung und Bildaufnahmeschritte, die beeinflussen könnenReferenz das endgültige Bild daher mit Software-Tools und Testmuster ist entscheidend für das Verständnis und die Optimierung STORM Bildqualität. Darüber hinaus können diese Protokolle nützliche und weniger zweideutig Möglichkeiten der Fehlerbehebung von Problemen, die auftreten können. Beispielsweise das Dextran Probe ist ein sehr nützlicher Weg, um zu ermitteln, ob es eine Fehljustierungen oder ungleichmäßige Beleuchtung der Probe. Wenn es Bedenken, dass die Schaltpuffer kann nicht arbeiten eine sehr einfache Sichtprüfung, um zu sehen, ob es eine &quot;blinkende &#39;wird Ihnen helfen. Aktinfilamente sind eine nützliche Methode zur Messung der Auflösung mit FWHM Vergleiche sowie Hervorhebung Drift und Fehllokalisation Artefakte. Es sollte jedoch angemerkt, daß als Lokalisierung basierte Superauflösungsverfahren können Fluorophor Dichte empfindlich sein, ungeachtet der anderen Faktoren, wie Belichtungszeit, Bildrate, Laserleistung und der Art und Weise wird das Bild verarbeitet werden, ist es unmöglich, zuweisen Der Beschluss, eineninsbesondere Mikroskop und davon ausgehen, dass alle Bilder wird diese Auflösung haben. Was ist möglich, jedoch ist es, verschiedene Aspekte der Auflösung wie Mittelwert Lokalisierungsgenauigkeiten, Lokalisierung Zahl messen und Drift-27. Auch wenn Bezugsmarkierungen können nicht in jedem Versuch sie können eingearbeitet werden, zumindest, verwendet, um ein Mikroskop-System, seine Umwelt besser zu verstehen, zu charakterisieren und operativen Überlegungen wie, wie viel Zeit erforderlich ist, um das thermische Gleichgewicht erreicht nach dem Start werden. Sowie Korrektur von lateralen Drift können Bezugsmarkierungen verwendet werden, zu charakterisieren und zu korrigieren Axialdrift, obwohl dies erfordert die Verwendung einer astigmatischen Linse und einen Rückkopplungsmechanismus, um die Probenposition zu korrigieren, während die Bilder erworben 43. Handels Super-Resolution-Systeme gehören in der Regel eine Art von Stabilitätskontrolle oder Fokus-Lock-Mechanismus, der eine praktische Lösung für die Korrektur Fokusdrift sein können. Es gibt eineWieder Alternativen zu unspezifisch Beschichten des Glases mit Dextran, wie die Verwendung von Farbstoffen, die direkt oder anderen konjugierten Moleküle, wie Sekundärantikörper. Eine Einschränkung dieser Ansätze ist, dass die Anzahl der Moleküle an der Glas gebunden ist nicht bekannt. Alternative filamentöse Strukturen, die verwendet wurden, schließen Mikrotubuli 28 und 21 DNA. Die Kombination von sehr geringer Größe und bequem im Handel erhältlichen Reagenzien machen jedoch Aktin eine attraktive Alternative, insbesondere der Abstand des divergierenden oder verzweigte Filamente können auch eine nützliche Messung der Systemleistung 27 sein. Es gibt Raum für die weitere Entwicklung von Testproben, trotz der jüngsten Fortschritte in diesem Bereich 28,29,46,47. Insbesondere stellt Multi-Color-Imaging eine Reihe von Herausforderungen in allen drei Hauptaspekte der Bildgebung, Probenkennzeichnung, Bildaufnahme (Hardware) und Software (Bildverarbeitung und Ausrichtung). Es gibt ein seiteine Reihe von Publikationen die Lösung dieser Fragen 4-6 und es ist daher klar, dass geeignete Testproben und Methoden kritisch zu erzeugen und zuverlässig Interpretation dieser Bildtypen. In der Tat, vor kurzem wurde gezeigt, dass dSTORM könnte verwendet werden, um zwei Farbbilder zu nehmen, und zu beheben, die hochsymmetrische Natur der Kernporenkomplex und die Autoren vermuten, dass dies eine ideale Möglichkeit, um die Leistung der chromatischen Aberration 45 Korrekturen zu beurteilen. Ein weiterer interessanter Ansatz ist die Verwendung von DNA-Origami, ein nanoruler, die die Möglichkeit der Positionierung Fluorophore zu bestimmten Unter-Beugungs Abständen 46 schafft erstellen. Dies bietet eine Möglichkeit zur Beurteilung Auflösung und macht Abstandsmessungen. Jedoch ist das letztendliche Ziel, diese Superauflösungstechniken, um nicht-idealisierten Proben, wie Zellen, die komplexe dreidimensionale Strukturen anzuwenden. In diesem Fall wird eine Kombination aus gründlicheres Verständnis ter Technik kombiniert mit Software-Tools, die den Anwender bei der Erfassung von Daten, die Verarbeitung in geeigneter Weise, und Bereitstellung von Bild Metriken helfen, ist wahrscheinlich die letzte Antwort sein. 28,29,47,48

Vor kurzem wurde ein Bereich der optischen Mikroskopie Techniken entwickelt worden, die typischerweise als Super-Resolution-Mikroskopie oder Nanoskopie, die die Beugungsgrenze zu umgehen und erzeugen Bilder mit einer Auflösung von 100 nm oder besser 1,2 können bezeichnet. Seit der Ankündigung von Super-Resolution-Mikroskopie als die Nature Methods Verfahren des Jahres 2008 gab es eine große Entwicklung von Lokalisierungs-basierten Mikroskopen. Zum Beispiel gibt es Mehrfarbanwendungen 3-6, 7-12 3D-Implementierungen und Anwendungen auch mit lebenden Zellen 5,13-17. Darüber hinaus, da diese Systeme werden in die Hände von Zellbiologen kommerzialisiert und werden nun ihren Weg aus der Optik Laboratorien gibt es wahrscheinlich eine weitere Erhöhung ihrer Verwendung und Anwendung der biomedizinischen Fragen. Ein Zweig dieser Familie ist die Lokalisierungsbasierte Methoden, die durch den Aufbau eines Bildes Molekül-für-Molekül zu arbeiten. Ichn Um dies zu tun, muss der Großteil der Fluoreszenzmoleküle in der Probe aus, so dass nur wenige räumlich getrennten Moleküle zu einem Zeitpunkt aktiv geschaltet sein. Diese Moleküle werden dann schnell ein-und ausgeschaltet, und viele Bilder aufgenommen werden, so dass ein beträchtlicher Teil der Bevölkerung ist abgebildet, um die darunterliegende Struktur mit Unter-Beugungs Präzision wiedergeben. Eine Reihe von Ansätzen veröffentlicht einschließlich GSDIM 18, 19 PALM, FPALM 20, 21 und STORM RESOLFT 22. Algorithmen, die die Position eines Einzelmoleküldetektion messen kann dann verwendet werden, um die tatsächliche Position des Moleküls mit Genauigkeiten besser als 20 nm unter Verwendung von Gauß-Fitting 23 zu lokalisieren, beispielsweise rapidSTORM 24,25 QuickPALM 26, 12 und palm3d Regensturm 27. Bei der Abbildung Zelle oder anderen biologischen Proben, die eine hohe Moleküldichte haben, ist es daher erforderlich, viele Tausende von Rahmen zu nehmendiese blinkt, räumlich getrennten, Signals, um Bild ein erheblicher Anteil der markierten Moleküle. Stochastische optischen Rekonstruktion Mikroskopie (STORM) und der eng verwandten dSTORM und GSDIM Methoden-basierte Lokalisierungs Super-Resolution-Methoden, die gezeigt wurde, dass mit handelsüblichen organischen Farbstoffen 21 zu arbeiten. Sie haben sich seit gezeigt wurde für eine Reihe von verschiedenen Farbstoffen 28-30, die die Methodik insbesondere wegen der Spezifität und der relativen Bequemlichkeit der etablierten Immunmarkierung Ansätze zur Fluoreszenzmikroskopie durch attraktiv zu sein. Folglich gibt es einen einfachen Zugang zu einer Reihe von Farbstoff-Antikörper-und Farbstoff-Biomolekül-Konjugate, die das Potenzial in der Lokalisierung Basis-Superauflösende Bildgebung verwendet werden müssen. Während die allgemeinen Grundsätze des STORM und ähnliche Ansätze sind relativ einfach, und auf den ersten Blick die Hardware und die Probenvorbereitung scheinen relativ straightforward, gibt es eine Reihe von Schritten in dem Prozess, der entscheidend für die Erreichung hoher Qualität, artefaktfrei, Super-Resolution-Bilder sind. Wie bei allen Mikroskopie-Techniken kann der Prozess des in 3 Hauptschritte betrachtet werden: erstens, Probenvorbereitung, zweite Bildaufnahme und, drittens, die Bildverarbeitung und / oder Bildanalyse und Interpretation. Die zusätzliche Auflösungsvermögen und Verfahren zur Erzeugung von Super-Resolution-Bildern mit einem Lokalisierungs-Ansatz führt einige neue Probleme und Überlegungen 31-33. Beginnend mit der Probenvorbereitung bei der Durchführung der Immunmarkierung, insbesondere indirekte Immunfluoreszenz, wo eine primäre und sekundäre Antikörperkombination verwendet wird, ist anzumerken, dass der fluoreszierende Farbstoff kann bis zu 20 nm von dem Molekül von Interesse sein werden. Im Fall von Mikrotubuli, führt dies zu Durchmessern von 35-50 nm im Vergleich mit einer erwarteten Mikrotubuli-Durchmesser von 25 nm 28,30. Auch sollte die Markierungsdichte meet die Nyquist-Kriterien, um eine hohe Bildqualität 14 zu erzeugen. Zum Beispiel für eine erwartete Bildauflösung von 20 nm entlang einer filamentösen Struktur sollte ein Farbstoffmolekül mindestens alle 10 nm 27 sein. Während viele Farbstoffe sind veröffentlicht worden, um für die Lokalisierung Basis nähert sich die Gesamtleistung des Farbstoffs ist eine Mischung aus mindestens vier wichtige Kriterien, nämlich detektierten Photonen pro Schaltereignis (die Helligkeit jedes Blinzeln - heller ist besser) arbeiten, das Gleichgewicht auf -off-Arbeitszyklus (das Kontrastverhältnis von Farbstoffen in der Aus-Zustand gegenüber - mehr ist im Allgemeinen besser ab), die Überlebensfraktion (eine geringe Bleichrate ist besser) und die Anzahl der Schaltzyklen (die Anzahl der Blinkzeichen pro Fluorophor - mehr ist besser für hohe Auflösung, obwohl ein Aufblinken pro Fluorophor kann ein Vorteil für die Molekül-Zwecke Zählen sein). Die Situation wird weiter durch die Tatsache, dass diese Eigenschaften für einen bestimmten Farbstoff kann in verschiedenen Pufferbedingungen variieren und kompliziertLaserleistung mit 28,29. Zudem sowie diese einzigartige STORM Erwägungen kann die Bildqualität durch die Optimierung der Probenvorbereitung in der gleichen Weise wie traditionelle Fluoreszenzmikroskopie-Techniken beispielsweise durch Minimierung von Eigenfluoreszenz durch Modifikation Fixierungsbedingungen und die Verwendung von Reagenzien Abschrecken verbessert werden. Auch ist die Minimierung nicht-spezifisch gebundenen Fluorophore wichtig, welche durch Einstellen Etikett Konzentrationen, Inkubationszeiten und Blockieren und Waschschritte durchgeführt werden können. Der zweite Schritt der Bildaufnahme ist ebenfalls kritisch. Die optimalen Einstellungen des Mikroskops wird auf die Farbstoff, Pufferbedingungen Markierungsdichte und Probentyp, z. B. Monoschichten auf Glas, Zellen oder Gewebeproben ab. Die wichtigsten Überlegungen sind Kamera Belichtungszeit, Bildnummer, Beleuchtungswinkel (TIRF, Hilo, Epi) und Laserleistung. Das Ziel ist, so viele helle räumlich getrennten blinkt so schnell wie möglich zu sammeln. Wenn der Hintergrund is sehr hoch ist oder die blinkt nicht sehr hell, mit anderen Worten, das Signal-zu-Rauschverhältnis schlecht ist, wobei der Rekonstruktionsalgorithmus nicht in der Lage, die Positionen so genau zu lokalisieren. Sowie die Maximierung der Lokalisierungsgenauigkeit, also die Genauigkeit, mit jedem Molekül Position gemessen werden kann, hängt die Bildqualität auch bei einer hohen Anzahl von Lokalisierungen. Wenn eine unzureichende Anzahl der Moleküle von Interesse sind abgebildet, entweder aufgrund der schlechten Markierungseffizienz, übermäßiges Ausbleichen oder eine unzureichende Bildnummer, dann das resultierende Bild Super-Resolution wird punktiert und diskontinuierlich sein als Nyquist-Kriterien nicht eingehalten, 14,27 . Und schließlich ist der dritte Schritt, Bildverarbeitung, besonders wichtig im Vergleich mit Standard-Fluoreszenzmikroskopie-Techniken. Es gibt eine Reihe von frei im Handel erhältlich und Algorithmen, die sowohl ein Vorteil, in Bezug auf Auswahl, und ein Nachteil ist, dass es verwirrend sein kann zu wissen, welche am besten geeignet ist, um zu verwenden. Wenn zum Beispiel die Rohdaten gut verteilte räumlich getrennte blinkt dann eine Einzelmolekül-Anpassungsalgorithmus sehr genau und effizient zu sein, beispielsweise durch die spärlich Anpassungsalgorithmen im Regensturm 27, rapidSTORM 24,25, palm3d 12 und 26 QuickPALM Software . Wenn die Rohdaten enthält eine Menge von überlappenden Signalen dann Algorithmen, die besser geeignet sein können, umfassen DAOSTORM 34, 35 und 3B deconSTORM 36. Darüber hinaus sind diese Algorithmen enthalten Schwellenwerte für verschiedene Kriterien wie Signal zählt, oder Photonen pro Blinken, sowie verschiedene Bilddarstellungsmöglichkeiten wie die Visualisierung mit geglätteter Gauß-Funktionen oder als Histogramme mit Pixelraster, wo der Super-Auflösungspixelgröße kann durch den Benutzer ausgewählt. Alle diese Optionen ändern das Aussehen des fertigen Bildes und haben Auswirkungen auf die Bildinterpretation und-analyse. <p class="jove_content"&gt; Daher präsentieren wir 3 Testproben, die den neuen Benutzer mit einem Ausgangspunkt für Dye-Lokalisierung Basis Super-Resolution-Experimente, die aus Gründen der Klarheit werden wir so STORM zu beziehen und erfahrene Anwender die Möglichkeit bieten wird, um weiter zu optimieren, ihre Experimente. Erstens ist es möglich, die Oberfläche des Glases mit einer fluoreszierenden Schicht von Dextran-Farbstoff-Konjugat. Dies bietet eine schnelle und einfache Möglichkeit, um festzustellen, dass das Mikroskop-, Farbstoff-und Puffer arbeiten daran, blinkt Fluoreszenzsignal erzeugen. Das Verfahren kann dann durch den Vergleich mittlere Lokalisierungsgenauigkeit und Anzahl von Regensturm Metriken erzeugt werden, um Pufferbedingungen zu optimieren, Bildaufnahme-Einstellungen und testen verschiedene Farbstoffe erweitert werden. Zweitens stellen wir ein einfaches Protokoll zur Herstellung von Aktin-Filamenten auf Glas, das leicht mit Phalloidin-Farbstoff-Konjugaten markiert werden können. Diese bieten ideale Strukturen, um Messungen der Auflösung in der Regel 27 und der Halbwertsbreite (FWHM) nehmender ein Faden wird als eine empirische Abschätzung der Resolution 37 gegeben. Es ist zu beachten, dass die Auflösung variiert zwischen den Proben und zwischen den Bildern innerhalb der gleichen Probe, weil Auflösung in der Lokalisierung Basis Super-Resolution-Mikroskopie ist eine Funktion der Fluorophor Helligkeit, Hintergrundgeräusche und Lokalisierung Dichte 27 und das sind nicht unbedingt konstant über der Probe werden. Aktin-Filamente werden verwendet, um mögliche Artefakte wie mislocalizations demonstrieren und treiben und wie sie mit Software-Funktionen innerhalb von Rainstorm identifiziert werden. Außerdem beschreiben wir die Verwendung von fluoreszierenden Bezugsmarkierungen sowohl richtige Maß und Drift. Und drittens die Färbung der Zellen mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF)-Farbstoff-Konjugate beschrieben. EGF ein nützlicher Indikator für die superauflösenden Bildern, weil ein Teil des Rezeptors auf der Zelloberfläche eine Endocytose durchläuft über Vesikel, die Unter-Beugungsstrukturen Größe von etwa 50-150 nm Durchmesser 27,38,39.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labtek Imaging chamberglass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CBR-166-390E</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>* See below for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 X TIRF Objective Lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UAPON 100XOTIRF</td>
			<td>* See below for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon 897</td>
			<td>* See below for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>640 nm laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>iBEAM-SMART-640-S</td>
			<td>*150 mW - for imaging Alexa 647 or Cy5 dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>*Acquisition software (controlling hardware)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC</td>
			<td>Dell</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control and image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Image analysis and processing <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rainSTORM</td>
			<td>Laser Analytics Group (Cambridge) software</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources" target="_blank">http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Running rainSTORM</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/" target="_blank">http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Example of self-built STORM/PALM microscopes</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Also see reference 29 <a href="http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope" target="_blank">http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Commercial STORM/PALM super-resolution microscopes</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives to self-built microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Materials &amp; Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>VX70013065</td>
			<td>1; 2; 3; 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td>1.1; 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-Alexa fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-22914</td>
			<td>1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General actin buffer</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>BSA01</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preformed-actin filaments</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>AKF99</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phallodin-Alexa fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres (0.1 micron)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-7279</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>VX31966021</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>VX10500064</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Step</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070063</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic dishes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>734-0006</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF - Alexa fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E35351</td>
			<td>4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>4.3, 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde - 10% solution EM grade</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>04018-1</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C100</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2133</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4706</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93352</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7528</td>
			<td>5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6500</td>
			<td>5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2289</td>
			<td>5.1; 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Reagents</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

test samples for optimizing storm super-resolution microscopy

STORM ist eine neu entwickelte Super-Resolution-Mikroskopie-Technik mit bis zu 10-mal höhere Auflösung als Standard-Fluoreszenzmikroskopie-Techniken. Jedoch, wie das Bild in eine ganz andere Weise als normal erworben, durch den Aufbau eines Bildes Molekül-für-Molekül, gibt es einige bedeutende Herausforderungen für die Nutzer in die versuchen, ihre Bildaufnahme zu optimieren. Um diesen Prozess zu unterstützen und gewinnen mehr Einblick, wie STORM arbeitet präsentieren wir die Herstellung von 3 Testproben und die Methodik der Erfassung und Verarbeitung von STORM Super-Resolution-Bilder mit typischen Auflösungen von 30-50 nm auf. Durch die Kombination der Testproben mit der Verwendung der frei verfügbaren Rainstorm Verarbeitungssoftware ist es möglich, eine große Menge an Informationen über Bildqualität und Auflösung zu erhalten. Mit Hilfe dieser Messdaten ist es dann möglich, die Bildgebungsverfahren von der Optik zu optimieren, die Vorbereitung, Farbstoff Wahl, Pufferbedingungen, und Bildaufnahme-Einstellungen probieren. Wir sind einelso zeigen Beispiele für einige häufige Probleme, die zu einer schlechten Bildqualität führen, wie laterale Drift, wo die Probe bewegt sich während der Bildaufnahme und Dichte bezogene Probleme, die in der &quot;Fehllokalisation&quot; Phänomen.

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Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Wir beschreiben die Herstellung von drei Prüfmustern und wie sie verwendet werden, um beurteilen zu optimieren und die Leistung der STORM-Mikroskope. Mit diesen Beispielen zeigen wir, wie Roh-Daten zu erfassen und verarbeiten sie zu Super-Resolution-Bilder in Zellen von ca. 30-50 nm Auflösung zu erwerben.

Testproben zur Optimierung STORM Super Resolution Mikroskopie

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

test-samples-for-optimizing-storm-super-resolution-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

31.0K Aufrufe.  National Physical Laboratory.  Wir beschreiben die Herstellung von drei Prüfmustern und wie sie verwendet werden, um beurteilen zu optimieren und die Leistung der STORM-Mikroskope. Mit diesen Beispielen zeigen wir, wie Roh-Daten zu erfassen und verarbeiten sie zu Super-Resolution-Bilder in Zellen von ca. 30-50 nm Auflösung zu erwerben. 

Serie: Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Super-Resolution Imaging der Bakterien Abteilung Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Forschung

Biologie

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Probenvorbereitung für Single Virion Atomic Force Microscopy und Super-Resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Super-Resolution Imaging der zytokinetischen Z-Ring im Live-Bakterien mit Schnelle 3D-Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

Dreidimensionale Super Resolution Mikroskopie von F-Aktin durch interferometrische fotoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPalm)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Protokolle für Problematische Pflanze, Oomycete und Pilzproben

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Open-Source-Einzelpartikelanalyse für Super Resolution Mikroskopie mit VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

Grundzustand Erschöpfung Super-Resolution Imaging in Säugerzellen

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

Anwendung des High-Speed-Höchstauflösung Geschwindigkeit Mikroskopie in Live primäre Zilie

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to chromatic aberration and the imperfect alignment of cameras, images acquired in each channel may be shifted, and magnified, as well as rotated relative to each other in any of the three dimensions. With the classical calibration method, chromatic shifts are measured by multicolor beads attached to the surface of a coverslip, and a number of software are available to measure the chromatic shifts from such calibration samples. However, chromatic aberration can vary with depth, change with observation conditions and be induced by the biological sample itself, thus hindering determination of the true amount of chromatic shift in the sample of interest and across the volume. Correcting chromatic shifts at higher accuracy is particularly relevant for super-resolution microscopy where only slight chromatic shifts may affect quantitative analyses and alter the interpretation of multicolor images. We have developed an open-source software Chromagnon and accompanying methods to measure and correct 3D chromatic shifts in biological samples. Here we provide a detailed application protocol that includes special requirements for sample preparation, data acquisition, and software processing to measure chromatic shifts in biological samples of interest.

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Correction of chromatic shifts in three-dimensional (3D) multicolor fluorescence microscopy images is crucial for quantitative data analyses. This protocol is developed to measure and correct chromatic shifts in biological samples through acquisition of suitable reference images and processing with the open-source software, Chromagnon.

Hochpräzise Korrektur von 3D-Chromatischen Verschiebungen im Zeitalter der super-Resolution Biological Imaging mit Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Hochauflösende Live-Cell-Bildgebung subzellulärer Strukturen

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...