Dieses Protokoll ist eine einfache Möglichkeit, die Profile von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen post-translationalen Modifikationen zu generieren, indem spezifische identifizierte Proteine identifiziert und halbquantifiziert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Verwendung von Lentiviren, um eine stabile Zelllinie der Expression innerhalb einer Woche zu schaffen, und die Verwendung von zwei Tags, um Proteine gezielt zu reinigen. Tatsächlich sind diese Post-Translations-Änderungen an den meisten biologischen Funktionen beteiligt, und Veränderungen dieses Mechanismus sind bei den meisten Krankheiten zu finden.
Daher kann die Identifizierung dieser Veränderungen als prognostische und/oder diagnostische und natürlich als molekulare Targets dienen. Ubiquitin ist eines der am besten konservierten Protein in eukaryotischen Zellen und dies ist für ihr Überleben unerlässlich. Daher könnte diese Art von Methode auf jedes eukaryotische Modell angewendet werden, von Säugetieren bis Hefe.
Unser lentivirales System beschränkt sich jedoch auf die Untersuchung von Zellen. Da das ganze Verfahren ziemlich lang ist mit manchmal langer Inkubationszeit, ist es möglich, es über zwei Tage statt eines zu tun. Das Eluat aus Nickelperlen kann bei minus 20 eingefroren werden und vor dem Hinzufügen der Flaggenperlen.
Dieses Protokoll enthält viele Schritte, von denen einige entscheidend sind, um den endgültigen Erfolg der Reinigung zu gewährleisten, und damit die genaue Erstellung des post-translationalen Änderungsprofils. Die Demonstration des Verfahrens wird von Mirna Swayden und Aurelie Dobric, zwei Doktoranden des Labors, durchgeführt. Zunächst fügen Sie 0,5 mal 10 zu der sechsten der HEK 293T-Zellen in einer Sechs-Brunnen-Platte mit zwei Millilitern pro Brunnen DMEM mit 10%FBS zu Samen hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 100% Luftfeuchtigkeit.
Am nächsten Tag wird 50 bis 70% Zusammenfluss erreicht. Kotransfieren Sie die Zellen mit einer Mischung aus einem Mikrogramm pCCL-6HF-Ubiquitin-ähnlichen oder pCCL-GFP, einem Mikrogramm PBS VG und einem Mikrogramm Delta-Hilfsvektoren mit einem Transfektionsreagenz und Protokoll für die Lentivirus-Produktion. Ändern Sie nach sechs Stunden Transfektion das Medium in ein frisches Medium, das den zu transduzierenden Medien der zu transduzierenden Zellen entspricht.
Säen Sie die Zellen, die in einer Sechs-Brunnen-Platte mit ihren Standard-Kulturmedien transduziert werden sollen, um am Tag danach 10 bis 20 % Zusammenfluss zu erhalten. 24 Stunden nach der Transfektion das Medium mit lentiviralen Partikeln wiederherstellen und mit 0,45-Mikron-Filtern filtern. Ersetzen Sie das Medium der zu transduzierenden Zellen durch das gefilterte Medium, das Lentiviren enthält.
Inkubieren Sie die Zellen mit Lentiviren 24 bis 72 Stunden in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, und wechseln Sie dann das Medium mit frischem, Standard-Eins. Überprüfen Sie die GFP-Expression mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop, um die Effizienz der Transduktion zu bewerten. Wenn keine Fluoreszenz erkannt wird, warten Sie zwei bis drei Tage weiter.
Wenn die GFP-Kontrolle mit grüner Fluoreszenz positiv ist, wachsen alle Zellen, bis sie genug haben, um eine Expressionskontrolle von 6-His-FLAG-Ubiquitin-ähnlichen durch Immunfluoreszenz durchzuführen, wie hier gezeigt, und westlichen Blot mit Anti-FLAG-Antikörper. Nach dem Anbau der Zellen in 15-Zentimeter-Geschirr die Kulturgerichte mindestens einmal mit phosphatgepufferter Saline bei Raumtemperatur waschen. Um mit der Zelllyse zu beginnen, fügen Sie zwei Milliliter Puffer eins in jede 15-Zentimeter-Schale bei Raumtemperatur ein.
Verwenden Sie einen Zellschaber, um alle Lysate in 50-Milliliter-Konifugenröhren zurückzugewinnen. Sonicate die Lystates dreimal für 30 Sekunden, getrennt durch eine einminütige Pause. Zentrifugieren Sie die beschallten Lysate 15 Minuten lang mit 15.000 mal g.
Übertragen Sie den Überstand durch ein 40-Mikron-Zellsieb auf ein neues Rohr. Es ist sehr wichtig, Lysate nach Beschallung und Zentrifugation zu filtern. Wenn dies nicht geschieht, kann dies zur Koreinigung vieler unspezifischer Proteine führen, wodurch der Hintergrund erhöht und die Größe des PTM-Profils stark reduziert wird.
Übertragen Sie eine gleiche Menge Protein zwischen 50 und 100 Milligramm in neue Falcon-Röhrchen. Fügen Sie Nickel-Ionen-NTA-Perlen in jede Röhre mit der Menge von zwei Mikroliter Perlen pro einem Milligramm Protein hinzu. Legen Sie die Rohre auf einen Rotator, um bei 30 U/min für 2 1/2 Stunden bei Raumtemperatur zu drehen.
Dann pellet die Perlen bei 500 mal g für fünf Minuten. Waschen Sie die Perlen mit einem Milliliter Puffer ein, und übertragen Sie die Proben in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Legen Sie die Röhre auf Eis.
Zweimal mit einem Milliliter eiskalten Puffer zwei mit zehn Millimolar Imidazol waschen. Um elute-gebundene Proteine, fügen Sie 600 Mikroliter Puffer zwei enthält 250-Millimolar Imidazol, und rotieren für zwei Stunden bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie die Perlen eine Minute lang per Zentrifugieren bei 500 mal g gepelt haben, den Überstand in ein neues vorgekühltes 1,5-Milliliter-Rohr übertragen und 50 Mikroliter Anti-FLAG M2-Antikörperkonjugatierte Perlen hinzufügen.
Drehen Sie bei 30 Rpm für 2 1/2 Stunden bei vier Grad Celsius. Dann zweimal mit 500 Mikroliter Puffer zwei waschen, dann zweimal mit 500 Mikroliter Puffer drei. Für die endgültige Elution 100 Mikroliter Puffer drei hinzufügen, die ein FLAG-Peptid bei 0,01 Mikrogramm pro Mikroliter enthalten, und drehen Sie bei vier Grad Celsius für 1 1/2 Stunden.
Nach der Zentrifugation bei 500 mal g für eine Minute, übertragen Sie den Überstand auf ein neues vorgekühltes Rohr. Nehmen Sie 10 Mikroliter, um auf SDS-PAGE zu laden, und führen Sie eine Silberfärbung des Gels durch, um die Reinigungsqualität zu kontrollieren. Wenn die Reinigung gut aussieht, analysieren Sie die 90%, die von LC-MS übrig bleiben.
Um die Normalisierung durchzuführen, verwenden Sie die Formeln, um Werte zwischen medikamentös behandelten Zellen und unbehandelten Zellen für Ubiquitin und GFP zu normalisieren. Um den Hintergrund zu entfernen, subtrahieren Sie Die Werte in der Kontrollstichprobe GFP von den Werten in den Ubiquitin-Proben, um spezifische Werte für jedes identifizierte Protein unter beiden Bedingungen zu erhalten. Um die Variation der Ubiquitination zu erhalten, erhalten Sie einen Wert zwischen minus 100 und plus 100 für positive und negative Variationen von PTMs, die durch ein Medikament induziert werden.
Die Differenz zwischen den spezifischen Werten der behandelten und der unbehandelten Proben wird durch die Summe aller Werte, einschließlich der Werte im Steuerelement, dividiert und mit 100 multipliziert. Variationen unter minus 50, die eine Repression von PTM oder über 50, die die Induktion von PTM darstellen, werden als signifikant angesehen. Verwenden Sie diese Formel, um einen Konfidenzwert zwischen Null und 100 %Werte über 50 zu erhalten, die in der Regel als sicher angesehen werden.
Um eine schönere Verteilung der Induktions- und Repressionswerte zu erhalten und sowohl Variations- als auch Konfidenzparameter zu berücksichtigen, verwenden Sie diese Formel, um die Varianz- und Konfidenzwerte zu multiplizieren. In dieser Studie wurde die Transduktion von Kultur-Säugetierzellen erreicht, um GFP und 6-Histidin FLAG-Ubiquitin-exzessierende Zellen zu erzeugen. Die Wirksamkeit der lentiviralen Transduktion wurde zunächst durch die Betrachtung der GFP-Fluoreszenz von GFP-transduced-Zellen kontrolliert.
Die Expression von FLAG-Ubiquitin erfolgte durch Immunfluoreszenzfärbung mit einem Anti-FLAG-Antikörper, der den Prozentsatz der transduzierten Zellen anzeigt. Um den Expressionsgrad von exogenem FLAG-Ubiquitin zu kontrollieren, wurden Lysate aus transduzierten Zellen von SDS-PAGE gefolgt von Western Blot mit Anti-FLAG-Antikörper analysiert. Nach der Reinigung der ubiquitinierten Proteine wurden 10% der endigen Elution verwendet, um die Menge und Integrität des gereinigten Materials durch SDS-PAGE und Silberfärbung des Gels zu kontrollieren.
Die GfP-Probensubtraktion im Hintergrund identifizierte 364 Proteine, die signifikant mit einem Wert über 50% ubiquitiniert waren. Potenzielle interagierende Netzwerke, die durch Gemcitabin-induzierte Veränderungen der Ubiquitination gebildet werden. Dies führte zur Identifizierung von funktionellen interagierenden Netzwerken, die stark von einer erhöhten oder verminderten Ubiquitination der beteiligten Proteine betroffen sind.
Es wurde auch bestätigt, dass die Ubiquitination von PCNA nach der Behandlung von Gemcitabin zunahm. Es ist sehr wichtig, die Übertragung von einigen Perlen nach beiden Elutionsschritten zu vermeiden, da es zu einer signifikanten Zunahme des Hintergrunds führen kann. Dieses Verfahren wird spezifische post-translationale Änderungen hervorbringen, die durch den Vergleich verschiedener Bedingungen die Identifizierung spezifischer Änderungen ermöglichen.
Der erste nächste Schritt wird darin bestehen, zumindest die Änderungen von Interesse auf der Grundlage biochemischer Ansätze zu validieren. Wir haben diese Methode entwickelt, um ubiquitinbasierte, posttranslationale Modifikationen zu erforschen, um neue Wege und Mechanismen von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen zu identifizieren. Da dieses Protokoll und andere weltweit entwickelte Protokolle erfolgreich eingesetzt wurden, um verschiedene biologische Prozesse zu entschlüsseln.
Die Lentiviren müssen mindestens im BL-2 Labor eingesetzt werden. Guanidin ist ein starkes Denaturierungsmittel und muss sorgfältig eingesetzt werden. Der Beschallungsgerät kann auch für die Ohren schädlich sein und muss nach den Empfehlungen verwendet werden.
