Die Autoren möchte der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) für die teilweise Finanzierung dieser Arbeit unter Grant Zahlen UR 70/10-01 und UR 70/12-01.

1. Herstellung von mikrofluidischen Biosensor verwenden DFR Technologie <ol><li>Vorbereitung der PI Wafer.
	<ol><li>Schnitt ein PI Substrat in 6 - In Runde Waffeln. Setzen den PI-Wafer in einem Ofen bei 120 ° C für etwa 1 h für eine Austrocknung backen.</li>
	</ol></li> <li>Photolithographie zunächst für den Lift-off-Prozess.
	<ol><li>Programm der Spin Coater auf eine 30-s Spinnerei Zeit bei 3.000 u/min, bei einer Beschleunigung von 2.000 u/min/s. Ort der PI-Wafer auf der Spin Coater und befestigen, Anlegen eines Vakuums. 2 mL einer Resist, ermöglichen die Lift-off, zu verzichten und das Spin Coater-Programm starten. Entfernen Sie die Wafer aus der Spin Coater und Soft-backen den PI-Wafer auf einer heißen Platte für 2 min bei 100 ° c</li>
		<li>Stellen Sie die gewünschte Maske für die Strukturierung der Elektroden auf die PI-Wafer mit bloßem Auge und setzen Sie es 400 mJ/cm 2 UV-Licht (365 nm). Ort der Wafer in einer Schüssel mit einem Resist-matching-Entwickler auf einem Orbitalschüttler gefüllt und lassen Sie es Schütteln leicht für 1 min.</li>
		<li>Nach dem Entfernen der überschüssigen Resist verwenden eine Dusche auf den PI-Wafer mit entionisiertem Wasser (VE-Wasser) auf einer nassen Bank spülen und trocknen Sie es anschließend mit Druckluft.</li>
	</ol></li> <li>Ablagerung von Platin für die Bildung der Elektroden.
	<ol><li>Verwenden eine standard körperliche Dampf-Abscheidung auf Kaution 200 nm von Platin auf den Wafer 19.</li>
		<li>Den Wafer in eine Schüssel legen. Geben Sie die passenden Entferner in die Schüssel und entfernen Sie der Lift-off-Resist unter leicht schütteln des Wafers auf einem Orbitalschüttler, bis alle überschüssigen Platin entfernt wird. Spülen und trocknen den PI-Wafer, wie unter Schritt 1.2.3.</li>
	</ol></li> <li>Zweiten Photolithographie Schritt: bilden die Isolationsschicht.
	<ol><li>Setzen den PI-Wafer in einem Ofen auf 120 ° C für 5 min zu it. dehydrieren vorgewärmt</li>
		<li>Programm der erste Schritt von einem Spin Coater, 5 s der Zeit bei 500 u/min drehen. Programmieren Sie den zweiten Schritt für 30 s bei 4.000 u/min, bei einer Beschleunigung von 700 u/min/s.</li>
		<li>Den PI-Wafer auf der Spin Coater und befestigen, Anlegen eines Vakuums. 4 mL einer entsprechenden Epoxy-basierte Photoresist vor dem Spin Coater Programmstart zu verzichten.</li>
		<li>Soft-Backen der beschichteten Wafer für 3 min bei 95 ° C auf einer heißen Platte.</li>
		<li>Stellen Sie die Maske für die Dämmschicht auf dem Wafer mit den jeweiligen Ausrichtungsmarken und ein Okular. Aussetzen den Wafer zu 100 mJ/cm 2 UV-Licht (365 nm).</li>
		<li>Für eine Post-Exposition Backen legen die Wafer auf einer vorgeheizten Herdplatte für 2 min bei 95 ° c</li>
		<li>Legen den Wafer in eine Schüssel geben und mit einem geeigneten Entwickler (z. B. 1-Methoxy-2-Propyl-Acetat für 2 min bei SU-8) auf einem Orbitalschüttler entwickeln.</li>
		<li>Den PI-Wafer zunächst mit Isopropanol abspülen und dann spülen und trocknen wie unter Schritt 1.2.3.</li>
		<li>Hard-Backen der Fotolack in einem Ofen für 3 h bei 150 ° c</li>
	</ol></li> <li>Plasmaunterstützte Reinigung der Elektroden.
	<ol><li>Die Photoresist-Rückstände zu entfernen, verwenden Sie Sauerstoffplasma mit einem standard-Plasma-Gerät. Starten Sie das Reinigungsprogramm mit 200-W-Niederfrequenz macht mit 100 % O 2 fließen, eine Rate von 250 Sccm und einer Gesamtzeit von 3 min.</li>
		<li>Legen Sie den PI-Wafer in der Plasmakammer, beheben die Wafer auf der geerdeten Platte mit Glasdeckel und starten das Plasmaverfahren.</li>
	</ol></li> <li>Silber und Silberchlorid Ablagerung: schaffen die auf dem Chip Bezugselektrode.
	<ol><li>Passivierungsschicht Platin Kontakt Pads von der Wafer mit einem Klebeband UV-empfindlich. Die Folie 5 mm Breite und 11 cm lange Streifen geschnitten und bringen Sie sie auf den Wafer, schützt die Teile nicht mit Silber hinterlegt werden.</li>
		<li>Für die silberne Abscheidung einen Laborabzug sonic Badewanne (35 kHz) hineingesteckt und legen Sie einen Behälter mit Silber Elektrolyt-Lösung (100 g/L Ag, pH 12,5) in das Bad. Das sonic Bad auf Raumtemperatur und der Leistung auf 10 % festgelegt. 
		Achtung: Silber Elektrolytlösungen sind sehr giftig und sollte mit äußerster Sorgfalt behandelt werden. Die Dämpfe sollten nicht eingeatmet werden.</li>
		<li>Schließen Sie den Masse-Kontakt der Referenzelektroden an eine Konstantstromquelle. Schließen Sie die Gegenelektrode ein Silberdraht, die in der silbernen Elektrolytlösung an die Stromquelle mit standard Verbindungskabel eingetaucht ist.</li>
		<li>Setzen die Stromquelle DC und eine Stromdichte von -4,5 mA/cm 2, wodurch in einer silbernen Abscheiderate von etwa 0,3 µm/min starten die sonic Bad und lassen Sie die Stromquelle für 10 min. Spülen der Wafer mit VE-Wasser laufen</li>
		<li>Für die Chlorierung der Bezugselektrode, stecken Sie ein Schiff von 0,1 M Kaliumchlorid (KCl) Lösung der sonic Bad. Schließen Sie den Masse-Kontakt der Wafer und eine Platin-Elektrode, die in der KCl-Lösung mit der Konstantstromquelle eingetaucht ist.</li>
		<li>Setzen die Stromquelle DC und eine Stromdichte von 0,6 mA/cm 2, wodurch eine Abscheiderate von ca. 0,075 µm/min starten die sonic Bad und lassen Sie die Stromquelle für 7,5 min. laufen</li>
		<li>Nachspülen und Trocknen der PI wafer, wie unter Schritt 1.2.3.</li>
		<li>Entfernen Sie das UV-Sensitive-Band nach einer UV (365 nm) Exposition von 300 mJ/cm 2 und spülen und Trocknen der PI-Wafer, wieder wie beschrieben Schritt 1.2.3.</li>
	</ol></li> <li>Dritten Photolithographie Schritt: Verwendung von DFRs mikrofluidische Kanäle erstellen.
	<ol><li>Schneiden Sie die benötigten DFR-Schichten auf eine Größe ähnlich dem des Wafers (20 x 20 cm 2). Beheben Sie die gewünschte Maske auf die Belichtungseinheit zu und richten Sie die DFR-Schicht auf die Maske mit dem bloßen Auge. Beleuchten mit 250 mJ/cm 2 UV-Licht (365 nm).</li>
		<li>Entfernen Sie die Schutzfolie von der Fotolack und entwickeln der Resist für etwa 2 min (abhängig von den Strukturen) in einer 1 % Natriumcarbonat (Na 2 CO 3) Lösung mit einem standard sonic Bad (35 kHz) auf 42 ° C und einer Klanggewalt vorgewärmt von 100 %. Um die Reaktion sofort zu stoppen, Schütteln des Resists für 1 min in einem 1 % HCl Bad auf einem Orbitalschüttler. Spülen und trocknen jede DFR-Schicht, wie unter Schritt 1.2.3. 
		Hinweis: Insgesamt vier DFR Schichten verarbeitet werden müssen wie in Schritt 1.7 erwähnt: ein Kanal-Ebene, einer Decklage und Rückseite zweilagig (verhindert, dass der Biosensor Biegung am Ende).</li>
	</ol></li> <li>Kaschierung von DFR "layers" auf dem Substrat PI.
	<ol><li>PI-Wafer auf eine Transparenz-Overhead-Folie und befestigen es mit standard Klebeband. Passen Sie die Kanalschicht DFR auf dem PI-Wafer unter dem Mikroskop, Nutzung der jeweiligen Ausrichtung Strukturen.</li>
		<li>Für die Laminierung, verwenden Sie einen standard heißen Roll Laminator und Heizen Sie die Oberwalze auf 100 ° C und der unteren Rolle bis 60 ° c Stellen Sie den Druck bis 3 Bar, mit einer Vorwärtsgeschwindigkeit von 0,3 m/min statt den Wafer mit festen DFR-Schicht in der Mitte das Laminiergerät und Starten Sie es; der DFR wird durch das Gerät geschoben. Wiederholen Sie den Schritt nach der Wafer um 180° drehen.</li>
		<li>Um zu verhindern, die Biegung der Biosensor, Laminat die beiden entwickelten Rückseite Schichten auf dem Wafer, die folgenden Schritte 1.8.1-1.8.2.</li>
	</ol></li> <li>Mit hydrophoben anhalten Barriere und Abdichtung des Chips.
	<ol><li>Entfernen legen die Schutzschicht von der Vorderseite des DFR-Kanalsäh indem standard Klebeband an einem Ende des DFR und nach oben herausziehen. Verwenden Sie einen Hand Dispenser mit 0,004-in Tuben um kleine Tröpfchen von gelösten Polytetrafluorethylen in die Vertiefungen der Isolierungsschicht zu verzichten. Um der Mikrofluidik-Chip zu versiegeln, Laminat DFR Deckschicht auf der Kanal-Ebene, wie in Schritt 1,8 beschrieben.</li>
	</ol></li> <li>Hard-Backen der mikrofluidischen Biosensor.
	<ol><li>Entfernen Sie alle schützende Folien auf dem Cover und Rückseite DFR Schichten. Schneiden Sie die Biosensoren in Streifen mit einer gewöhnlichen Schere. Heilen die Chips im Backofen bei 160 ° C für 3 h</li>
	</ol></li></ol> 2. Immobilisierung Testverfahren auf dem Chip <ol><li>Adsorption von Avidin im Bereich Immobilisierung des Kanals.
	<ol><li>Bereiten die 100 µg/mL Avidin Lösung in 10 mM Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei einem pH-Wert von 7,4.</li>
		<li>Verzichten 2 µL der Avidin-Lösung auf den Einlass der Biosensor. 
		Hinweis: Der Kanal durch Kapillarkräfte gefüllt, bis die Flüssigkeit die hydrophoben anhalten Barriere erreicht.</li>
		<li>Um sicherzustellen, dass die fluidische hält Halt an der Barriere während der ganzen Inkubationszeit 2 µL VE-Wasser am Ausgang des Chips verzichten. Den Chip bei 25 ° C für 1 h in einem geschlossenen Behälter inkubieren.</li>
		<li>Entfernen Sie überschüssige Reagenzien durch den Einlass des Chips durch Anlegen eines Vakuums. Waschen Sie den Kanal mit 50 µL Waschpuffer (PBS mit 0,05 % Tween 20), verzichtet auf die Steckdose während das Vakuum angewendet wird. Trocknen Sie den Kanal für 30 s, während das Vakuum angewendet wird.</li>
	</ol></li> <li>Blockieren die Kanal-Oberfläche, um unspezifische Bindung hemmen.
	<ol><li>Bereiten die Lösung 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in 10 mM PBS bei einem pH-Wert von 7,4.</li>
		<li>Pipette 2 µL der 1 % BSA Lösung auf den Einlass und 2 µL VE-Wasser am Ausgang des Kanals. Inkubieren Sie den Chip bei 25 ° C für 1 h in einem geschlossenen Behälter. Entfernen Sie überschüssige Reagenzien und den Kanal zu trocknen, wie unter Schritt 2.1.4.</li>
	</ol></li> <li>Inkubation von DNA Oligos beschriftet mit Biotin und 6-FAM.
	<ol><li>Bereiten verschiedene Konzentrationen (0,001 bis 5 µM) der DNA-Lösung in 10 mM PBS bei einem pH-Wert von 7,4.</li>
		<li>Verzichten 2 µL von einer Konzentration der DNA-Lösung am Einlass und 2 µL VE-Wasser am Ausgang. Den Chip bei 25 ° C für 15 min in einem geschlossenen Behälter inkubieren.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.3.2 für die anderen DNA-Konzentrationen mit zusätzlichen Biosensor Chips.</li>
		<li>Entfernen überschüssige Reagenzien und trocknen Sie den Kanal, wie in Schritt 2.1.4 beschrieben.</li>
	</ol></li> <li>6-FAM-Antikörper mit der Bezeichnung der Immobilisierung von GOx.
	<ol><li>Formulieren eine 5 µg/mL Konzentration von 6-FAM-Antikörpern in 10 mM PBS bei einem pH-Wert von 7,4.</li>
		<li>Einführen 2 µL der Antikörper-Lösung für den Einlass und 2 µL VE-Wasser an den Auslass des Kanals. Inkubieren Sie die beschriftete Antikörper bei 25 ° C für 15 min in einem geschlossenen Behälter. Entfernen Sie überschüssige Reagenzien, wie unter Schritt 2.1.4.</li>
	</ol></li></ol> 3. Konduktometrische Signal Erkennung mit Hilfe der Stop-Flow-Technik <ol><li>Vorbereitung der Substrat-Lösung zur elektrochemischen Detektion.
	<ol><li>Formulieren eine 40 mM Glukoselösung in 0,1 M PBS bei einem pH-Wert von 7,4 in Reinstwasser.</li>
		<li>Für die Vorbehandlung, bereiten Sie eine 0,1 M PBS-Lösung bei einem pH-Wert von 7,4 in Reinstwasser.</li>
	</ol></li> <li>Vorbehandlung der Elektroden arbeiten.
	<ol><li>Benutzen Sie den maßgeschneiderten Chip-Halter ermöglicht die einfache Platzierung des Chips und fluidische und elektrische Verbindung.</li>
		<li>Elektrisch verbinden der Biosensor zu dem Potentiostaten. Die fluidischen Kontakt des mikrofluidischen Kanals über eine Spritzenpumpe bis das Reagenz Reservoir mit maßgeschneiderten Adapter und Schläuche zu gewährleisten. Starten Sie das Notebook, das mit dem Potentiostaten verbunden ist und starten Sie die Spritze Pumpensteuerung, Steuerung durch den Chip fluidische.</li>
		<li>Die Spritzenpumpe manuell, mit 0,1 M PBS bei einer Durchflussmenge von 20 µL/min starten. An der Arbeitselektrode gegen die auf dem Chip Bezugselektrode, gelten eine Wechselspannung von 0,8 und -0,05 V für 5 s 30 Zyklen. Im Anschluss daran, oxidieren die Arbeitselektrode durch Anlegen einer Spannung von 0,8 V 60 s.</li>
	</ol></li> <li>Assay auslesen mit Hilfe der Stop-Flow Technik.
	<ol><li>Die Assay-Signal-Anzeige starten, warten, bis das aktuelle Messsignal stabilisiert. Stoppen Sie die Spritzenpumpe und wechseln Sie das Reagenz von 0,1 M PBS, die 40-mM Glukoselösung und starten Sie die Software auf die Spritze Pumpe Controller; Es stoppt automatisch den Fluss für 1, 2 oder 5 min und startet dann den Fluss wieder. Beobachten, die sich daraus ergebenden Spitzenstrom. 
		Hinweis: Für die Analyse der Daten, die Stromspitze oder die Ladung des Peaks kann berücksichtigt werden, wie beschrieben in das Modell ein elektrochemisches Signal auslesen ( Abbildung 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das Protokoll für die Herstellung von einem mikrofluidischen elektrochemische Biosensor hier vorgestellten ermöglicht die Entwicklung einer Low-Cost, kompakt und einfach zu bedienende Plattform für die Erkennung von Biomolekülen. Abhängig von der Test anschließend auf der Biosensor verwendet können mehrere verschiedene Biomarker erkannt werden. Dies macht die Plattform sehr vielseitig und bietet breite Zugriff auf verschiedene Anwendungsbereiche von standard-diagnostische Tests (z. B. das Vorhandensein vo...

In den letzten zwei Jahrzehnten sind diagnostische Anwendungen für eingehende Studien über die Entwicklung der globalen öffentlichen Gesundheit elementar geworden. Traditionell werden Labor-Diagnose-Tools zur Erkennung von Krankheiten verwendet. Obwohl sie nach wie vor eine wichtige Rolle bei der Diagnose von Krankheiten spielen, Point-of-Care testing (POCT) durchgeführt, in der Nähe des Patienten oder durch den Patienten selbst in den letzten Jahren mehr und mehr alltäglich geworden. Vor allem in solchen Fällen, die eine sofortige Behandlung, wie akutem Myokardinfarkt oder Diabeteskontrolle, erfordern unbedingt die rasche Bestätigung der klinischen Befund. Daher gibt es ein wachsender Bedarf für POCT-Geräte, die von Laien bedient werden und sind gleichzeitig in der Lage präzise in-vitro- diagnostische Tests in kurzer Zeit1,2,3,4 .
Auf dem Gebiet der POCT haben bereits bemerkenswerte Verbesserungen erzielt werden. Allerdings gibt es noch viele Herausforderungen zu überwinden,5,6,7,8. Für POCT Plattform erfolgreich auf den Markt gebracht werden und mit Labordiagnostik wettbewerbsfähig zu sein, muss das Gerät streng die folgenden Anforderungen erfüllen: (i) liefern präzise und quantitative Testergebnisse, die mit Labor übereinstimmen Ergebnisse; (Ii) haben Sie kurze Beispielergebnis Zeiten, ermöglicht die sofortige Behandlung des Patienten; (Iii) verfügen über unkomplizierte und einfache Handhabung, auch wenn von ungeschulten Personen betrieben, und minimale Benutzereingriffe erfordern; und (iv) bestehen aus einer kostengünstigen Sensoreinheit für Einweg-Anwendungen konzipiert. Darüber hinaus sind Ausrüstung-kostenlose Diagnose günstig, vor allem in ressourcenarmen Umgebungen3,4,6.
Durch diese strengen Anforderungen haben nur zwei POCT-Systeme basierend auf elektrochemischen Detektion (z. B. Blutzuckerteststreifen) und lateral Flow Immunoassays (z. B. Schwangerschaftstests) erfolgreich auf dem Markt so eingeführt weit. Beide Systeme leiden jedoch Nachteile, wie schlechte Leistung (z. B. Blutzucker-monitoring hat ungenaue Testergebnisse und lateral Flow Assays liefern nur qualitative (positiv oder negativ) Messergebnisse)4, 6. Diese Nachteile herkömmlicher POCT-Systeme führten zu einer steigenden Nachfrage auf die Erforschung neuer Technologies, die schnelle, kostengünstige und quantitative Erfassung am Point of Care4,5anbieten.
Um diese Herausforderungen POCT-Geräte zu erfüllen, ist DFR Technologie vor kurzem für die Herstellung von Einweg- und kostengünstige Biosensoren9,10,11,12, beschäftigt 13 , 14. im Vergleich zu weich und flüssig lithografischen Materialien, wie z. B. PDMS oder SU-8, DFRs präsentieren viele Vorteile: sie (i) sind erhältlich in einer Vielzahl von Kompositionen und stärken (von wenigen µm bis mehrere Millimeter); (Ii) haben Sie eine sehr raue Oberfläche, die Haftung auf verschiedenen Materialien erleichtert; (Iii) Feature ausgezeichnete Dicke Gleichförmigkeit; (iv) bieten Sie billige, einfache und Hochdurchsatz-Fertigung für die Massenproduktion; (V) sind leicht mit verschiedenen kostengünstigen Tools, wie eine einfache Schere schneiden; und (vi) für die Erstellung von dreidimensionalen Strukturen, z. B. mikrofluidische Kanäle ermöglichen durch mehrere DFR Schichten übereinander stapeln.
Auf der anderen Seite haben DFRs im Allgemeinen eine relativ schlechte Auflösung im Vergleich zu flüssigen Photoresists, hervorgerufen vor allem durch die Schichtdicke und der erhöhten Abstand zwischen der Maske und der DFR aufgrund der Schutzfolie, die zusätzlich Licht ermöglicht Streuung. Dennoch sind für die Fertigung von integrierten mikrofluidischen Biosensoren, DFRs bestens geeignet für die kostengünstige Massenproduktion.
Deshalb arbeiten wir in diesem vorliegenden die Herstellung und Anwendung von einem elektrochemischen mikrofluidischen DFR-basierten Biosensor. Das ausführliche Protokoll beschreibt jeden Produktionsschritt der Biosensor-Plattform, die auf dem Chip Immobilisierung von einem DNA-basierte Modell-Assay und seinen elektrochemischen auslesen mit Hilfe der Stop-Flow-Technik. Dieses universelle Plattform ermöglicht die Erkennung von zahlreichen Arten von Biomolekülen, mit verschiedenen Assay-Technologien (z. B. Genomik, Cellomics und Proteomics) oder Assay-Formate (z.B. Wettbewerb, Sandwich, oder direkt). Basierend auf einer DFR Plattform, zeigte unsere Fraktion zuvor erfolgreich die rasche und sensible Quantifizierung der verschiedenen Analyten, einschließlich Antibiotika13,15,16 (Tetracyclin, pristinamycinresistente, und ß-Lactam-Antibiotika), Troponin ich17und Substanz P18.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Material&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyralux</td><td>DuPont</td><td>AP8525R</td><td>Used as polyimide substrate</td></tr><tr><td>MA-N 1420</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MA-N1420</td><td>Lift-off resit to define the platinum depostion</td></tr><tr><td>Ma-D 533s</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MaD533S</td><td>Developer for MA-N1420</td></tr><tr><td>Platinum</td><td>-</td><td>-</td><td>Electrode and contact pad material</td></tr><tr><td>Ma-R 404s</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MaR404S</td><td>Remover for MA-N1420</td></tr><tr><td>SU-8 3005</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8-3005</td><td>Photoresist to define the electrode area and as insulation</td></tr><tr><td>1-methoxy-2-propanol acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108-65-6</td><td>Developer for SU-8 3005</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>VWR</td><td>8.18766.2500</td><td>Removing of the SU-8 developer</td></tr><tr><td>1020R</td><td>Ultron Systems Inc.</td><td>1020R</td><td>UV sensitive adhesive tape for protection of contact pads</td></tr><tr><td>Arguna S</td><td>Degussa</td><td>1935</td><td>For Silver depostion on reference electrode</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Methrom</td><td>62308.020</td><td>For chloridation of the silver reference electrode</td></tr><tr><td>Pyralux</td><td>DuPont</td><td>PC1025</td><td>Dry film photoresist</td></tr><tr><td>Sodium carbonat</td><td>Fluka</td><td>71352</td><td>Developer for Pyralux PC1025</td></tr><tr><td>Hydrogen chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30720</td><td>To top the development of the DFR</td></tr><tr><td>Teflon AF 1600</td><td>DuPont</td><td>AF1600</td><td>For employing the stopping barrier</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PA104</td><td>Mega Electronics</td><td>-</td><td>Bubble etch tank</td></tr><tr><td>FED 53</td><td>Binder</td><td>9010-0018</td><td>Oven</td></tr><tr><td>SPIN150</td><td>APT</td><td>-</td><td>Spin coater</td></tr><tr><td>Pr&amp;auml;zitherm</td><td>Harry Gestigkeit GmbH</td><td>PZ 28-2</td><td>Hot plate</td></tr><tr><td>Hellas</td><td>Bungard Elektronik</td><td>40000</td><td>Exposure unit</td></tr><tr><td>Tetra30-LF-PC</td><td>Diener</td><td>-</td><td>Plasma unit</td></tr><tr><td>Univex 500</td><td>Leybold</td><td>-</td><td>Physical vapor deposition unit</td></tr><tr><td>Shaker S4</td><td>ELMI</td><td>-</td><td>Orbital shaker</td></tr><tr><td>Sonorex Super 10 P</td><td>Bandelin</td><td>783</td><td>Sonic bath</td></tr><tr><td>6221 DC and AC</td><td>Keithley</td><td>-</td><td>Current source</td></tr><tr><td>HRL 350</td><td>Ozatec</td><td>-</td><td>Laminator unit</td></tr><tr><td>Vaccum pen</td><td>EFD</td><td>-</td><td>Vacuum pen</td></tr></tbody></table>

dry film photoresist-based electrochemical microfluidic biosensor platform: device fabrication, on-chip assay preparation, and system operation

In den letzten Jahren wurde die Biomarker-Diagnose ein unverzichtbares Werkzeug für die Diagnose der Krankheit beim Menschen, vor allem für die Point-of-Care-Diagnostik. Eine einfach zu bedienende und kostengünstige Sensorplattform ist sehr erwünscht, um verschiedene Arten von Analyten (z. B. Biomarker, Hormonen und Medikamenten) quantitativ und speziell zu messen. Aus diesem Grund wurde trockenen Film Photoresist Technologie - billig, oberflächlich und Hochdurchsatz-Fertigung - die hier vorgestellten mikrofluidischen Biosensor Herstellung verwendet. Abhängig von der Bioassay anschließend verwendet ist die vielseitige Plattform in der Lage, verschiedene Arten von Biomolekülen zu erkennen. Für die Herstellung des Geräts sind Platin-Elektroden auf eine flexible Polyimid (PI) Folie im Prozessschritt nur Reinraum-strukturiert. Die PI-Folie dient als Substrat für die Elektroden, die mit einem Epoxy-basierte Photoresist isoliert sind. Der Mikrofluidik-Kanal wird später durch die Entwicklung und Kaschierung von trockenen Film Fotolack (DFR) Folien auf die PI-Wafer erzeugt. Mithilfe einer hydrophoben anhalten Barriere im Kanal der Kanal ist aufgeteilt in zwei Bereiche: eine Immobilisierung Abschnitt für die Enzym-linked-Assay und eine elektrochemische Messzelle für die konduktometrische Signal Anzeige.
Die auf dem Chip Bioassay Immobilisierung erfolgt durch die Adsorption von Biomolekülen, die Kanal-Oberfläche. Die Glukose-Oxidase-Enzym dient als ein Wandler für elektrochemische Signalerzeugung. In Anwesenheit des Substrates, Glukose, entsteht Wasserstoffperoxid, nachgewiesen ist, auf die Platin Arbeitselektrode. Die Stop-Flow-Technik wird angewendet, um die Signalverstärkung zusammen mit schnellen Nachweis zu erhalten. Verschiedenen Biomolekülen können quantitativ mit Hilfe des eingeführten mikrofluidischen Systems, geben einen Hinweis auf verschiedene Arten von Krankheiten oder in Bezug auf therapeutische Drug monitoring, erleichtert eine personalisierte Therapie gemessen werden.

Design und Herstellung von mikrofluidischen Biosensor-Plattform:
Die Herstellung von mikrofluidischen Biosensor Chips wird durch photolithographische Standardtechniken beschäftigen DFR Mehrschichtigkeit auf Wafer-Ebene realisiert. Diese Herstellung Strategie stützt sich auf die Laminierung der entwickelten Schichten des DFRs auf einem Platin-gemusterten PI Substrat, Bildung von mikrofluidischen Kanälen. Eine kurze Zusammenfassun...

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Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Trockenen Film Photoresist-basierte elektrochemische mikrofluidischen Biosensor Plattform: Gerät Fertigung, On-Chip-Test Vorbereitung und Systembetrieb

Eine mikrofluidischen Biosensor-Plattform wurde entworfen und hergestellt mit kostengünstigen trocken Photoresist Filmtechnik für die rasche und sensible Quantifizierung der verschiedenen Analyten. Diese Einweg-System ermöglicht das elektrochemische Auslesen der Enzym-linked-Assays auf den Chip immobilisiert mittels der Stop-Flow-Technik.

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

dry-film-photoresist-based-electrochemical-microfluidic-biosensor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.7K Aufrufe.  University of Freiburg. Eine mikrofluidischen Biosensor-Plattform wurde entworfen und hergestellt mit kostengünstigen trocken Photoresist Filmtechnik für die rasche und sensible Quantifizierung der verschiedenen Analyten. Diese Einweg-System ermöglicht das elektrochemische Auslesen der Enzym-linked-Assays auf den Chip immobilisiert mittels der Stop-Flow-Technik.

Serie: Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Methods for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over orientation and immobilization density are highly desirable for biosensor and microarray applications. In this Study, we use a highly efficient covalent bioorthogonal [4+2] cycloaddition reaction between trans-cyclooctene (TCO) and 1,2,4,5-tetrazine (Tz) to enable the microfluidic immobilization of TCO/Tz-derivatized molecules. We monitor the process in real-time under continuous flow conditions using surface plasmon resonance (SPR). To enable reversible immobilization and extend the experimental range of the sensor surface, we combine a non-covalent antigen-antibody capture component with the cycloaddition reaction. By alternately presenting TCO or Tz moieties to the sensor surface, multiple capture-cycloaddition processes are now possible on one sensor surface for on-chip assembly and interaction studies of a variety of multi-component structures. We illustrate this method with two different immobilization experiments on a biosensor chip; a small molecule, AP1497 that binds FK506-binding protein 12 (FKBP12); and the same small molecule as part of an immobilized and in situ-functionalized nanoparticle.

We present a method for rapid, reversible immobilization of small molecules and functionalized nanoparticle assemblies for Surface Plasmon Resonance (SPR) studies, using sequential on-chip bioorthogonal cycloaddition chemistry and antibody-antigen capture.

Mikrofluidik-On-Chip-Capture-Cycloaddition reversibel Unbeweglichkeitseffekt kleine Moleküle oder Mehrkomponenten-Strukturen für Biosensor-Anwendungen

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

Forschung

Chemie

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Fluoreszenz-Nachweisverfahren für Mikrofluidik-Tropfen-Plattformen

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Biotechnik

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment 1,2 . These materials are desirable because they possess highly controllable dimensional and material characteristics, are biocompatible and promote cell adhesion, can be modified through topographic patterning or by chemically altering the surface, and can be used as a depot for biologically active molecules for drug delivery related applications 3-8 . In addition, silk films are relatively straightforward to custom design, can be designed to dissolve within minutes or degrade over years in vitro or in vivo, and are produce with the added benefit of being transparent in nature and therefore highly suitable for imaging applications 9-13. The culture system methodology presented here represents a scalable approach for rapid assessments of cell-silk film surface interactions. Of particular interest is the use of surface patterned silk films to study differences in cell proliferation and responses of cells for alignment 12,14 . The seeded cultures were cultured on both micro-patterned and flat silk film substrates, and then assessed through time-lapse phase-contrast imaging, scanning electron microscopy, and biochemical assessment of metabolic activity and nucleic acid content. In summary, the silk film in vitro culture system offers a customizable experimental setup suitable to the study of cell-surface interactions on a biomaterial substrate, which can then be optimized and then translated to in vivo models. Observations using the culture system presented here are currently being used to aid in applications ranging from basic cell interactions to medical device design, and thus are relevant to a broad range of biomedical fields.

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk films are a novel class of biomaterials readily customizable for an array of biomedical applications. The presented silk film culture system is highly adaptable to a variety of in vitro analyses. This system represents a biomaterial design platform offering in vitro optimization before direct translation to in vivo models.

Silk Film Culture-System für In-vitro- Analyse und Design-Biomaterial

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Einem mikrofluidischen Biochip-basierte Elektrochemische für Markierungsfreie DNA-Hybridisierungsanalyse

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

Digitale Mikrofluidik für die automatisierte Verarbeitung Proteomic

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Biologie

Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation

For the successful implementation of microfluidic reaction systems, such as PCR and electrophoresis, the movement of small liquid volumes is essential. In conventional lab-on-a-chip-platforms, solvents and samples are passed through defined microfluidic channels with complex flow control installations. The droplet actuation platform presented here is a promising alternative. With it, it is possible to move a liquid drop (microreactor) on a planar surface of a reaction platform (lab-in-a-drop). The actuation of microreactors on the hydrophobic surface of the platform is based on the use of magnetic forces acting on the outer shell of the liquid drops which is made of a thin layer of superhydrophobic magnetite particles. The hydrophobic surface of the platform is needed to avoid any contact between the liquid core and the surface to allow a smooth movement of the microreactor. On the platform, one or more microreactors with volumes of 10 &#181;L can be positioned and moved simultaneously. The platform itself consists of a 3 x 3 matrix of electrical double coils which accommodate either neodymium or iron cores. The magnetic field gradients are automatically controlled. By variation of the magnetic field gradients, the microreactors' magnetic hydrophobic shell can be manipulated automatically to move the microreactor or open the shell reversibly. Reactions of substrates and corresponding enzymes can be initiated by merging the microreactors or bringing them into contact with surface immobilized catalysts.

Lab-in-a-drop reaction systems allow the versatile implementation of complex reactions in a microfluidic scale. An automated actuation platform consisting of a 3 x 3 matrix of electromagnetic coils was developed and successfully used to merge two 10 &#181;L microreactors and thereby initiate an enzymatic reaction in the resulting liquid marbles.

Wässrige Tröpfchen als enzymatische Mikroreaktoren und deren elektromagnetischen Betätigung

For the successful implementation of microfluidic reaction systems, such as PCR and electrophoresis, the movement of small liquid volumes is essential. In ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

Mikrofluidik-Plattform mit Multiplexed elektronische Sensoren für Raumverfolgung von Partikeln

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits the dielectric properties of thin insulator films to enhance the charge density and hence boost the electrowetting effect. The presence of charges results in an electrically induced spreading of the droplet which permits purposeful manipulation across a hydrophobic surface. Here, we demonstrate EWOD-based protocol for sample processing and detection of four categories of antigens, using an automated surface actuation platform, via two variations of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) methods. The ELISA is performed on magnetic beads with immobilized primary antibodies which can be selected to target a specific antigen. An antibody conjugated to HRP binds to the antigen and is mixed with H2O2/Luminol for quantification of the captured pathogens. Assay completion times of between 6 and 10 min were achieved, whilst minuscule volumes of reagents were utilized.

Electrowetting-based digital microfluidic is a technique that utilizes a voltage-driven change in the apparent contact angle of a microliter-volume droplet to facilitate its manipulation. Combining this with functionalized magnetic beads enables the integration of multiple laboratory unit operations for sample preparation and identification of pathogens using Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Elektrowetting-basierte Digital Microfluidics Plattform für automatisierte enzymgebundene Immunsorbent Assay

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

Mechano-Node-Pore Sensing: A Rapid, Label-Free Platform for Multi-Parameter Single-Cell Viscoelastic Measurements

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer metastasis. Conventional methods for measuring these properties, such as atomic force microscopy (AFM) and micropipette aspiration (MA), capture rich information, reflecting a cell's full viscoelastic response; however, these methods are limited by very low throughput. High-throughput approaches, such as real-time deformability cytometry (RT-DC), can only measure limited mechanical information, as they are often restricted to single-parameter readouts that only reflect a cell's elastic properties. In contrast to these methods, mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) is a flexible, label-free microfluidic platform that bridges the gap in achieving multi-parameter viscoelastic measurements of a cell with moderate throughput. A direct current (DC) measurement is used to monitor cells as they transit a microfluidic channel, tracking their size and velocity before, during, and after they are forced through a narrow constriction. This information (i.e., size and velocity) is used to quantify each cell's transverse deformation, resistance to deformation, and recovery from deformation. In general, this electronics-based microfluidic platform provides multiple viscoelastic cell properties, and thus a more complete picture of a cell's mechanical state. Because it requires minimal sample preparation, utilizes a straightforward electronic measurement (in contrast to a high-speed camera), and takes advantage of standard soft lithography fabrication, the implementation of this platform is simple, accessible, and adaptable to downstream analysis. This platform's flexibility, utility, and sensitivity have provided unique mechanical information on a diverse range of cells, with the potential for many more applications in basic science and clinical diagnostics.

Presented here is a method to mechanically phenotype single cells using an electronics-based microfluidic platform called mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). This platform maintains moderate throughput of 1-10 cells/s while measuring both the elastic and viscous biophysical properties of cells.

Mechano-Node-Pore Sensing: Eine schnelle, markierungsfreie Plattform für viskoelastische Multiparameter-Einzelzellmessungen

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer ...

Trockenen Film Photoresist-basierte elektrochemische mikrofluidischen Biosensor Plattform: Gerät Fertigung, On-Chip-Test Vorbereitung und Systembetrieb

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