Os autores gostaria de agradecer o alemão Research Foundation (DFG) para financiamento parcialmente este trabalho sob Grant números UR 70/10-01 e UR 70/12-01.

1. fabricação da tecnologia de DFR Microfluidic Biosensor usando <ol><li>bolachas de preparação da PI.
	Substrato de corte um PI <ol><li>em 6 - em rodada bolachas. Colocar a bolacha de PI em um forno a 120 ° C por cerca de 1h para assar uma desidratação.</li>
	</ol></li> <li>Primeiro passo de fotolitos para o processo de decolagem.
	<ol><li>Programar a rotação-aplicador para um tempo de 30-s giro a 3.000 rpm, com uma aceleração de 2.000 rpm/s. lugar a bolacha de PI sobre o spin-revestidor e corrigi-lo, a aplicação de um vácuo. Dispense a 2 mL de uma resist, permitindo que o processo de decolagem e iniciar o programa de centrifugação-aplicador. Retire a bolacha o spin-revestidor e macio-asse a bolacha de PI sobre uma chapa quente durante 2 minutos a 100 ° C.</li>
		<li>Ajustar a máscara desejada para padronização dos eléctrodos sobre a bolacha de PI a olho nu e expô-lo à luz de 2 UV 400 mJ/cm (365 nm). Lugar a hóstia em uma tigela cheia de um desenvolvedor de correspondência de resistir em um agitador orbital e deixá-lo agite ligeiramente durante 1 min.</li>
		<li>Após a resistir em excesso é removido, usar um chuveiro para enxaguar o wafer de PI com água deionizada (DI-água) num banco molhado e seque-o depois com ar comprimido.</li>
	</ol></li> <li>Deposição de platina para a formação dos eléctrodos.
	<ol><li>Use um processo de deposição de vapor físico padrão para depósito de 200 nm de platina para a bolacha 19.</li>
		<li>Coloque a bolacha em uma tigela. Adicionar o removedor correspondente para a tigela e retire o resistir de decolagem agitando ligeiramente a bolacha em um agitador orbital até todos platina em excesso é removida. Lave e seque a bolacha de PI, conforme descrito na etapa 1.2.3.</li>
	</ol></li> <li>Segunda etapa de fotolitografia: formando a camada de isolamento.
	<ol><li>Colocar a bolacha de PI em um forno pré-aquecido a 120 ° C por 5 min desidratar lo</li>
		<li>Programa a primeira etapa de um giro-aplicador para 5 s de girando tempo a 500 rpm. Programa da segunda etapa por 30 s a 4.000 rpm, com uma aceleração de 700 rpm/s.</li>
		<li>Coloque a bolacha de PI sobre o spin-revestidor e corrigi-lo, a aplicação de um vácuo. Dispense a 4 mL de um apropriado com base em epóxi fotorresiste antes de iniciar o programa de centrifugação-revestidor.</li>
		<li>Soft-asse a bolacha revestida por 3 min a 95 ° C, em uma chapa quente.</li>
		<li>Ajustar a máscara para a camada de isolamento sobre a bolacha usando as marcas de alinhamento respectivo e uma lente ocular. Expor o wafer de luz de 2 UV 100 mJ/cm (365 nm).</li>
		<li>Para um Asse pós-exposição, coloque a bolacha em um prato quente pré-aquecido por 2 min em 95 ° C.</li>
		<li>Coloque a bolacha numa tigela e desenvolver a resistir com um desenvolvedor apropriado (por exemplo, 1-metoxi-2-propil-acetat por 2 min, no caso do SU-8) em um agitador orbital.</li>
		<li>Enxaguar a bolacha PI primeiro com isopropanol e depois enxaguar e secá-lo, conforme descrito na etapa 1.2.3.</li>
		<li>Hard-Asse o fotorresiste em um forno para 3h a 150 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Assistido por plasma limpeza dos eletrodos.
	<ol><li>Para remover os resíduos de fotorresiste, use o plasma de oxigênio com uma unidade de plasma padrão. Iniciar o programa de limpeza, usando energia de baixa frequência de 200 W com fluxo 100% O 2, uma taxa de 250 sccm e um tempo total de 3 min.</li>
		<li>Coloque a bolacha de PI para a câmara de plasma, corrigir a bolacha na placa aterrada usando tampas de vidro e iniciar o processo de plasma.</li>
	</ol></li> <li>Prata e deposição de cloreto de prata: criando o eléctrodo de referência em-microplaqueta.
	Almofadas de <ol><li>Passivate o contato de platina de wafer com fita adesiva sensíveis ao UV. Corte a folha 5 mm de largura e 11 cm de comprimento de listras e anexá-los para o wafer, protegendo as partes a não ser depositado com prata.</li>
		<li>Para a deposição de prata, colocou um banho sônico (35 kHz) uma hotte e introduza um recipiente de solução eletrolítica de prata (Ag, pH 12,5 100 g/L) para o banho. Definir o sonic banho à temperatura ambiente e o poder de 10%. 
		Atenção: Soluções de eletrólitos prata são altamente tóxicas e devem ser manuseadas com extremo cuidado. A fumaça nunca deve ser inalada.</li>
		<li>Ligar o contato em massa dos eléctrodos de referência a uma fonte de corrente constante. Conecte o eletrodo contador, um fio de prata que está imersa na solução de Prata eletrolítica, a fonte de corrente usando cabos de conexão padrão.</li>
		<li>Definir a fonte de corrente DC e uma densidade de corrente de-4.5 mA/cm 2, resultando em uma taxa de deposição de prata de aproximadamente 0,3 µm/min. Prepare o banho sônico e deixe a fonte atual executar durante 10 min. Enxágue a bolacha com DI-água</li>
		<li>Para a cloração do eletrodo de referência, introduza um recipiente de solução 0,1 M de cloreto de potássio (KCl) banho de sonic. Ligar o contacto em massa de wafer e um eletrodo de platina que está imersa na solução de KCl com fonte de corrente constante.</li>
		<li>Definir a fonte de corrente DC e uma densidade de corrente de +0.6 mA/cm 2, resultando em uma taxa de deposição de aproximadamente 0,075 µm/min. Prepare o banho sônico e deixe a fonte atual executar 7,5 min.</li>
		<li>Enxagúe e seque o PI da bolacha, conforme descrito na etapa 1.2.3.</li>
		<li>Remova a fita de UV-sensíveis após um UV (365 nm) exposição de 300 mJ/cm 2 e enxagúe e seque a bolacha de PI, novamente como descrito no passo 1.2.3.</li>
	</ol></li> <li>Terceira etapa de fotolitografia: DFRs usando para criar os canais microfluídicos.
	<ol><li>Corta as camadas DFR necessárias para um tamanho semelhante do wafer (20 x 20 cm 2). Corrigir a máscara desejada para a unidade de exposição e alinhar a camada DFR para a máscara usando a olho nu. Iluminar a resistir com 250 luz de mJ/cm 2 UV (365 nm).</li>
		<li>Remover a película protectora do fotorresiste e desenvolver a resistir por mais ou menos 2 min (dependendo das estruturas) em uma solução de carbonato de sódio (Na 2 CO 3) 1% usando um padrão banho sônico (35 kHz) pré-aquecido a 42 ° C e um poder sônico de 100%. Para parar a reação imediatamente, agite a resistir por 1 min em um banho de HCl 1% em um agitador orbital. Enxaguar e secar cada camada DFR, conforme descrito na etapa 1.2.3. 
		Nota: No total, quatro camadas DFR precisam ser processadas como mencionado na etapa 1.7: um canal camada, camada de cobertura de uma e duas camadas de traseiro (impedindo o biosensor de dobra no final).</li>
	</ol></li> <li>Camadas de laminação da DFR no substrato PI.
	<ol><li>Coloque a bolacha de PI em uma folha de aéreos de transparência e fixe-a com fita adesiva padrão. Ajustar a camada DFR canal sobre a bolacha PI sob um microscópio, usando as estruturas do respectivo alinhamento.</li>
		<li>Para a laminação, use um padrão quente rolo laminador e pré-aqueça o rolo superior a 100 ° C e o rolo inferior a 60 ° C. ajustar a pressão de 3 bar, com uma velocidade de 0,3 m/min. lugar a bolacha com a camada DFR fixa no meio do laminador e iniciá-lo; o DFR é empurrado através do Laminador. Repita a etapa após a bolacha de giro de 180°.</li>
		<li>Para evitar a dobra do biosensor, laminar as duas camadas de traseiro desenvolvidos sobre a bolacha seguindo passos 1.8.1-1.8.2.</li>
	</ol></li> <li>Empregando uma barreira hidrofóbica parando e selando o chip.
	<ol><li>Remover a camada protetora do lado da frente do canal DFR leigosEr, colocando fita adesiva padrão em uma extremidade da DFR e puxando para cima. Use um dispensador de mão com 0,004-em tubos para dispensar pequenas gotículas de politetrafluoroetileno dissolvido em poços da camada de isolamento. Para selar o chip microfluídicos, estratificação da camada de cobertura DFR para a camada de canal, conforme descrito na etapa 1.8.</li>
	</ol></li> <li>Rígido de cozer o biosensor microfluidic.
	<ol><li>Remover tudo protetora folhas na capa e parte traseira camadas DFR. Corte os biossensores em tiras usando um simples par de tesouras. Curar as fichas em um forno a 160 ° C por 3 h.</li>
	</ol></li></ol> 2. Procedimento de imobilização do ensaio no chip <ol><li>adsorção de avidina na área do canal de imobilização.
	<ol><li>Preparar uma solução de avidina 100 µ g/mL em 10 mM fosfato salino (PBS) a um pH de 7.4.</li>
		<li>Dispensar 2 µ l da solução para a entrada do biosensor avidina. 
		Nota: O canal é preenchido por forças capilares até que o líquido atinge a barreira hidrofóbica parar.</li>
		<li>Para garantir que o fluídico continua parando na barreira durante o tempo de incubação inteira, dispensar 2 µ l de DI-água na saída do chip. Incubar o chip a 25 ° C, durante 1 h em um recipiente fechado.</li>
		<li>Remover os reagentes em excesso através da entrada do chip pela aplicação de um vácuo. Lavar o canal com 50 µ l de tampão de lavagem (PBS com 0,05% Tween 20), dispensado na tomada enquanto o vácuo está sendo aplicado. Secar o canal por 30 s, enquanto que o vácuo está sendo aplicado.</li>
	</ol></li> <li>Bloqueando a superfície do canal para inibir a ligação inespecífica.
	<ol><li>Preparar uma solução de albumina de soro bovino (BSA) de 1% em PBS de 10mm a um pH de 7.4.</li>
		<li>Pipeta 2 µ l da solução de BSA de 1% sobre a entrada e 2 µ l de DI-água na saída do canal. Incube o chip a 25 ° C, durante 1 h em um recipiente fechado. Remover os reagentes em excesso e secar o canal, conforme descrito na etapa 2.1.4.</li>
	</ol></li> <li>Oligos incubação do DNA marcados com biotina e 6-fam
	<ol><li>Preparar diferentes concentrações (0,001-5 µM) da solução de DNA em 10mm PBS a um pH de 7.4.</li>
		<li>Dispensar 2 µ l de uma concentração da solução de DNA na entrada e 2 µ l de DI-água na saída. Incubar o chip a 25 ° C durante 15 minutos em um recipiente fechado.</li>
		<li>Repita o passo para as outras concentrações de DNA usando fichas adicionais biosensor 2.3.2.</li>
		<li>Remover os reagentes em excesso e secar o canal, conforme descrito na etapa 2.1.4.</li>
	</ol></li> <li>Imobilização de GOx-etiquetado anticorpos de 6-FAM.
	<ol><li>Formular uma concentração de 5 µ g/mL de anticorpos 6-FAM em 10mm PBS a um pH de 7.4.</li>
		<li>Introduzir 2 µ l da solução de anticorpo para a entrada e 2 µ l de DI-água para a saída do canal. Incube os anticorpos etiquetados a 25 ° C durante 15 minutos em um recipiente fechado. Remover os reagentes em excesso, conforme descrito na etapa 2.1.4.</li>
	</ol></li></ol> 3. Amperométrico sinal deteção usando a técnica de Stop-fluxo <ol><li>preparação da solução de substrato para a deteção de eletroquímica.
	<ol><li>Formular uma solução de glicose 40mm em PBS 0,1 M em pH de 7,4 na água ultra-pura.</li>
		<li>Para o tratamento preliminar, preparar uma solução de PBS 0,1 M em pH de 7,4 na água ultra-pura.</li>
	</ol></li> <li>Tratamento preliminar dos eléctrodos trabalho.
	<ol><li>Utilize o suporte de microplaqueta feitos sob medida para permitir a fácil colocação de chip e uma conexão elétrica e fluídico.</li>
		<li>Conectar eletricamente o biosensor para a potentiostat. Garantir o contato fluídico do canal microfluidic numa bomba e o reservatório de reagente, usando o adaptador feitos sob medida e tubos. Iniciar o laptop que está conectado para o potentiostat e iniciar o controlador de bomba de seringa, controlando o fluxo fluídico através do chip.</li>
		<li>Ligue a bomba de seringa manualmente, com PBS 0,1 M, com um caudal de 20 µ l/min. Para o eletrodo de trabalho contra o eletrodo de referência em-microplaqueta, aplicar tensão alternada de 0,8 e-0.05 V para 5 s cada 30 ciclos. Em seguida, oxidar o eletrodo de trabalho aplicando uma tensão de 0,8 V por 60 s.</li>
	</ol></li> <li>Leitura do ensaio, usando a técnica de stop-fluxo.
	<ol><li>Para iniciar a leitura do sinal de ensaio, aguarde até que o sinal medido atual estabiliza. Parar a bomba de seringa e alternar o reagente de PBS 0,1 M, para a solução de glicose 40mm e iniciar o software para o controlador de bomba de seringa; Ele irá parar automaticamente o fluxo de 1, 2 ou 5 minutos e então irá reiniciar o fluxo novamente. Observar o pico de corrente resultante. 
		Nota: Para a análise dos dados, o pico de corrente ou a carga de pico pode ser considerada, conforme descrito no modelo de uma leitura de sinal eletroquímico ( Figura 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo aqui apresentado para a fabricação de um biossensor electroquímico microfluidic permite o desenvolvimento de uma plataforma de baixo custo, compacto e fácil de usar para a detecção de biomoléculas. Dependendo o ensaio usado mais tarde no biosensor, vários biomarcadores diferentes podem ser detectados. Isto torna a plataforma muito versátil e fornece acesso aos vários domínios de aplicativos, de testes de diagnóstico padrão (por exemplo, determinar a presença de doenças específicas no ...

Nas últimas duas décadas, aplicações diagnósticas tornaram-se fundamental para estudos aprofundados sobre o desenvolvimento da saúde pública global. Tradicionalmente, ferramentas de diagnóstico de laboratório são utilizadas para a detecção de doenças. Mesmo que eles ainda desempenham um papel chave no diagnóstico de doenças, teste point-of-care (bolso) executada perto do paciente ou pelo próprio paciente tornou-se mais e mais comuns nos últimos anos. Especialmente em tais casos que requerem tratamento imediato, tais como infarto agudo do miocárdio ou monitoramento de diabetes, a confirmação rápida de uma constatação clínica é essencial. Portanto, há uma necessidade crescente de dispositivos de bolso que pode ser operado por não-especialistas e que são simultaneamente capaz de realizar testes diagnósticos precisos em vitro em um curto espaço de tempo,1,2,3,4 .
Melhorias notáveis já foram alcançadas no domínio do bolso. No entanto, ainda existem muitos desafios a superar,5,6,7,8. Para uma plataforma de bolso para ser lançado com sucesso no mercado e ser competitivo com o diagnóstico de laboratório, o dispositivo estritamente deve cumprir os seguintes requisitos: (i) fornecer resultados de testes precisos e quantitativos que são consistentes com o laboratório conclusões; (ii) ter curto amostra para o resultado vezes, permitindo o tratamento imediato do paciente; (iii) apresentam descomplicado e fácil manuseio, mesmo quando operado por pessoas inexperientes e requer a intervenção do usuário minimizado; e (iv) são compostos por uma unidade de sensor de baixo custo projetada para aplicações de uso único. Além disso, livre de equipamentos diagnósticos são favoráveis, principalmente em ambientes de poucos recursos,3,4,6.
Devido a estas exigências severas, apenas dois sistemas de bolso, baseados na deteção de eletroquímica (por exemplo, sangue teste tiras de glicose) e em imunoensaios de fluxo lateral (por exemplo, testes de gravidez) tem sido lançados com sucesso ao mercado tão até agora. No entanto, ambos os sistemas sofrem desvantagens como mau desempenho (ou seja, sangue glicose monitoramento tem resultados imprecisos e ensaios de fluxo lateral apenas fornecem resultados qualitativos (positivo ou negativo) medição)4, 6. Estas desvantagens dos sistemas convencionais de bolso têm levado a uma crescente demanda em explorar novas tecnologias que oferecem deteção rápida, baixo custo e quantitativa no ponto de cuidado4,5.
Para enfrentar estes desafios frente para dispositivos de bolso, DFR tecnologia tem sido recentemente empregada para a fabricação de biosensores descartável e de baixo custo9,10,11,12, 13 , 14. em comparação com materiais litográficas moles e líquidos, tais como PDMS ou SU-8, DFRs apresentam muitos benefícios: (i) estão disponíveis em uma variedade de composições e espessuras (a partir de alguns mícrons a vários milímetros); (ii) tem uma área de superfície muito áspera, o que facilita a adesão de vários materiais; (iii) uniformidade de espessura excelente recurso; (iv) oferecer fabricação barata, fácil e alta produtividade para a produção em massa; (v) são fáceis de cortar com várias ferramentas de baixo custo, como um simples par de tesouras; e (vi) permitem a criação de estruturas tridimensionais, tais como canais microfluídicos, empilhando camadas múltiplas de DFR em cima do outro.
Por outro lado, DFRs em geral têm uma resolução relativamente pobre em comparação com photoresists líquido, que é causada principalmente pela espessura do filme e pela maior distância entre a máscara e o DFR devido a película protectora, que além disso permite que a luz dispersão. Ainda, para a fabricação de biosensores microfluidic integrado, DFRs são altamente adequados para produção em massa de baixo custo.
Portanto, nós apresentamos neste trabalho a fabricação e aplicação de um biossensor microfluidic eletroquímica DFR-baseado. O protocolo detalhado descreve cada etapa de produção da plataforma de biosensor, a imobilização em-microplaqueta de um ensaio de modelo baseado em DNA e sua leitura eletroquímica, usando a técnica de stop-fluxo. Esta plataforma universal permite a detecção de vários tipos de biomoléculas, usando tecnologias de ensaio diferentes (por exemplo, genómica, cellomics e proteômica) ou formatos de ensaio (por exemplo, do competidor, sanduíche ou direta). Com base em tal uma plataforma DFR, nosso grupo anteriormente demonstrou com sucesso a quantificação rápida e sensível de vários analitos, incluindo antibióticos13,15,16 (tetraciclina, pristinamicina e ß-lactâmicos), troponina17e substância P18.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Material&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyralux</td><td>DuPont</td><td>AP8525R</td><td>Used as polyimide substrate</td></tr><tr><td>MA-N 1420</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MA-N1420</td><td>Lift-off resit to define the platinum depostion</td></tr><tr><td>Ma-D 533s</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MaD533S</td><td>Developer for MA-N1420</td></tr><tr><td>Platinum</td><td>-</td><td>-</td><td>Electrode and contact pad material</td></tr><tr><td>Ma-R 404s</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MaR404S</td><td>Remover for MA-N1420</td></tr><tr><td>SU-8 3005</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8-3005</td><td>Photoresist to define the electrode area and as insulation</td></tr><tr><td>1-methoxy-2-propanol acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108-65-6</td><td>Developer for SU-8 3005</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>VWR</td><td>8.18766.2500</td><td>Removing of the SU-8 developer</td></tr><tr><td>1020R</td><td>Ultron Systems Inc.</td><td>1020R</td><td>UV sensitive adhesive tape for protection of contact pads</td></tr><tr><td>Arguna S</td><td>Degussa</td><td>1935</td><td>For Silver depostion on reference electrode</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Methrom</td><td>62308.020</td><td>For chloridation of the silver reference electrode</td></tr><tr><td>Pyralux</td><td>DuPont</td><td>PC1025</td><td>Dry film photoresist</td></tr><tr><td>Sodium carbonat</td><td>Fluka</td><td>71352</td><td>Developer for Pyralux PC1025</td></tr><tr><td>Hydrogen chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30720</td><td>To top the development of the DFR</td></tr><tr><td>Teflon AF 1600</td><td>DuPont</td><td>AF1600</td><td>For employing the stopping barrier</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PA104</td><td>Mega Electronics</td><td>-</td><td>Bubble etch tank</td></tr><tr><td>FED 53</td><td>Binder</td><td>9010-0018</td><td>Oven</td></tr><tr><td>SPIN150</td><td>APT</td><td>-</td><td>Spin coater</td></tr><tr><td>Pr&amp;auml;zitherm</td><td>Harry Gestigkeit GmbH</td><td>PZ 28-2</td><td>Hot plate</td></tr><tr><td>Hellas</td><td>Bungard Elektronik</td><td>40000</td><td>Exposure unit</td></tr><tr><td>Tetra30-LF-PC</td><td>Diener</td><td>-</td><td>Plasma unit</td></tr><tr><td>Univex 500</td><td>Leybold</td><td>-</td><td>Physical vapor deposition unit</td></tr><tr><td>Shaker S4</td><td>ELMI</td><td>-</td><td>Orbital shaker</td></tr><tr><td>Sonorex Super 10 P</td><td>Bandelin</td><td>783</td><td>Sonic bath</td></tr><tr><td>6221 DC and AC</td><td>Keithley</td><td>-</td><td>Current source</td></tr><tr><td>HRL 350</td><td>Ozatec</td><td>-</td><td>Laminator unit</td></tr><tr><td>Vaccum pen</td><td>EFD</td><td>-</td><td>Vacuum pen</td></tr></tbody></table>

dry film photoresist-based electrochemical microfluidic biosensor platform: device fabrication, on-chip assay preparation, and system operation

Nos últimos anos, o diagnóstico de biomarcador tornou-se uma ferramenta indispensável para o diagnóstico de doenças humanas, especialmente para o diagnóstico point-of-care. Uma plataforma fácil de usar e de baixo custo sensor é altamente desejada para medir vários tipos de analitos (por exemplo, biomarcadores, hormônios e drogas) quantitativamente e especificamente. Por esta razão, tecnologia de película seca fotorresiste - permitindo barato, fabricação fácil e elevado-throughput - foi usada para fabricar o biosensor microfluidic aqui apresentado. Dependendo o bioensaio usado depois disso, a plataforma versátil é capaz de detectar vários tipos de biomoléculas. Para a fabricação do dispositivo, eléctrodos de platina são estruturados em uma folha de poliimida flexível (PI) na etapa de processo de sala limpa apenas. A folha PI serve como substrato para os eletrodos, que são isolados com uma fotorresiste baseada em epóxi. O canal microfluídicos é posteriormente gerado pelo desenvolvimento e laminação de folhas de fotorresiste (DFR) de película seca para a bolacha de PI. Usando uma barreira hidrofóbica parar no canal, o canal é separado em duas áreas específicas: uma seção de imobilização para o ensaio enzima-lig e uma célula eletroquímica de medição para a leitura de sinal amperométrico.
A imobilização de bioensaio em-microplaqueta é executada por adsorção das biomoléculas para a superfície do canal. Enzima glicose oxidase é usada como um transdutor para geração de sinal eletroquímico. Na presença do substrato, glicose, peróxido de hidrogênio é produzido, que é detectada ao eléctrodo de platina trabalho. A técnica de stop-fluxo é aplicada para obter amplificação de sinal junto com detecção rápida. Biomoléculas diferentes podem ser medidas quantitativamente por meio do sistema introduzido microfluídicos, dando uma indicação dos diferentes tipos de doenças, ou, em relação a drogas terapêuticas, monitoramento, facilitando uma terapia personalizada.

Projeto e fabricação da plataforma Microfluidic Biosensor:
A fabricação dos chips microfluídicos biosensor é realizada no nível do bolacha por técnicas padrão fotolitográfica, empregando várias camadas DFR. Esta estratégia de fabricação depende da laminação de camadas desenvolvidas de DFRs sobre um substrato de PI platina-modelados, formando os canais microfluídicos. Um breve resumo descrevendo as etapas de fabrica...

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Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Película seca baseada em fotorresiste eletroquímica Microfluidic Biosensor plataforma: Fabricação de dispositivo, ensaio em-microplaqueta preparação e operação de sistema

Uma plataforma de biosensor microfluidic foi projetada e fabricado usando a tecnologia de fotorresiste de película seca de baixo custo para a quantificação rápida e sensível de vários analitos. Este sistema de uso único permite a leitura eletroquímica de ensaios de enzima-lig na-microplaqueta-imobilizado mediante a técnica de stop-fluxo.

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

dry-film-photoresist-based-electrochemical-microfluidic-biosensor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.7K visualizações.  University of Freiburg. Uma plataforma de biosensor microfluidic foi projetada e fabricado usando a tecnologia de fotorresiste de película seca de baixo custo para a quantificação rápida e sensível de vários analitos. Este sistema de uso único permite a leitura eletroquímica de ensaios de enzima-lig na-microplaqueta-imobilizado mediante a técnica de stop-fluxo.

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Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Methods for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over orientation and immobilization density are highly desirable for biosensor and microarray applications. In this Study, we use a highly efficient covalent bioorthogonal [4+2] cycloaddition reaction between trans-cyclooctene (TCO) and 1,2,4,5-tetrazine (Tz) to enable the microfluidic immobilization of TCO/Tz-derivatized molecules. We monitor the process in real-time under continuous flow conditions using surface plasmon resonance (SPR). To enable reversible immobilization and extend the experimental range of the sensor surface, we combine a non-covalent antigen-antibody capture component with the cycloaddition reaction. By alternately presenting TCO or Tz moieties to the sensor surface, multiple capture-cycloaddition processes are now possible on one sensor surface for on-chip assembly and interaction studies of a variety of multi-component structures. We illustrate this method with two different immobilization experiments on a biosensor chip; a small molecule, AP1497 that binds FK506-binding protein 12 (FKBP12); and the same small molecule as part of an immobilized and in situ-functionalized nanoparticle.

We present a method for rapid, reversible immobilization of small molecules and functionalized nanoparticle assemblies for Surface Plasmon Resonance (SPR) studies, using sequential on-chip bioorthogonal cycloaddition chemistry and antibody-antigen capture.

Microfluidic On-chip Reação Capture-cicloadição para imobilizar reversível pequenas moléculas ou estruturas multi-componentes para aplicações de biossensores

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

Química

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Métodos de detecção de fluorescência para as plataformas de gotículas microfluídicos

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Bioengenharia

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment 1,2 . These materials are desirable because they possess highly controllable dimensional and material characteristics, are biocompatible and promote cell adhesion, can be modified through topographic patterning or by chemically altering the surface, and can be used as a depot for biologically active molecules for drug delivery related applications 3-8 . In addition, silk films are relatively straightforward to custom design, can be designed to dissolve within minutes or degrade over years in vitro or in vivo, and are produce with the added benefit of being transparent in nature and therefore highly suitable for imaging applications 9-13. The culture system methodology presented here represents a scalable approach for rapid assessments of cell-silk film surface interactions. Of particular interest is the use of surface patterned silk films to study differences in cell proliferation and responses of cells for alignment 12,14 . The seeded cultures were cultured on both micro-patterned and flat silk film substrates, and then assessed through time-lapse phase-contrast imaging, scanning electron microscopy, and biochemical assessment of metabolic activity and nucleic acid content. In summary, the silk film in vitro culture system offers a customizable experimental setup suitable to the study of cell-surface interactions on a biomaterial substrate, which can then be optimized and then translated to in vivo models. Observations using the culture system presented here are currently being used to aid in applications ranging from basic cell interactions to medical device design, and thus are relevant to a broad range of biomedical fields.

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk films are a novel class of biomaterials readily customizable for an array of biomedical applications. The presented silk film culture system is highly adaptable to a variety of in vitro analyses. This system represents a biomaterial design platform offering in vitro optimization before direct translation to in vivo models.

Silk Sistema de Cultura de Cinema para In vitro Análise e Desenho Biomaterial

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Um chip microfluídico para a Versátil Análise Química de células individuais

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

A Biochip eletroquímica microfluídica à base de Análise de hibridação DNA livre-Label

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

A microfluídica digital para processamento automatizado Proteômica

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Biologia

Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation

For the successful implementation of microfluidic reaction systems, such as PCR and electrophoresis, the movement of small liquid volumes is essential. In conventional lab-on-a-chip-platforms, solvents and samples are passed through defined microfluidic channels with complex flow control installations. The droplet actuation platform presented here is a promising alternative. With it, it is possible to move a liquid drop (microreactor) on a planar surface of a reaction platform (lab-in-a-drop). The actuation of microreactors on the hydrophobic surface of the platform is based on the use of magnetic forces acting on the outer shell of the liquid drops which is made of a thin layer of superhydrophobic magnetite particles. The hydrophobic surface of the platform is needed to avoid any contact between the liquid core and the surface to allow a smooth movement of the microreactor. On the platform, one or more microreactors with volumes of 10 &#181;L can be positioned and moved simultaneously. The platform itself consists of a 3 x 3 matrix of electrical double coils which accommodate either neodymium or iron cores. The magnetic field gradients are automatically controlled. By variation of the magnetic field gradients, the microreactors' magnetic hydrophobic shell can be manipulated automatically to move the microreactor or open the shell reversibly. Reactions of substrates and corresponding enzymes can be initiated by merging the microreactors or bringing them into contact with surface immobilized catalysts.

Lab-in-a-drop reaction systems allow the versatile implementation of complex reactions in a microfluidic scale. An automated actuation platform consisting of a 3 x 3 matrix of electromagnetic coils was developed and successfully used to merge two 10 &#181;L microreactors and thereby initiate an enzymatic reaction in the resulting liquid marbles.

Aquosas gotículas usadas como Microreactors enzimática e sua atuação eletromagnética

For the successful implementation of microfluidic reaction systems, such as PCR and electrophoresis, the movement of small liquid volumes is essential. In ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

Plataforma microfluídico com multiplexada detecção electrónica do Ordenamento do Rastreamento de Partículas

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits the dielectric properties of thin insulator films to enhance the charge density and hence boost the electrowetting effect. The presence of charges results in an electrically induced spreading of the droplet which permits purposeful manipulation across a hydrophobic surface. Here, we demonstrate EWOD-based protocol for sample processing and detection of four categories of antigens, using an automated surface actuation platform, via two variations of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) methods. The ELISA is performed on magnetic beads with immobilized primary antibodies which can be selected to target a specific antigen. An antibody conjugated to HRP binds to the antigen and is mixed with H2O2/Luminol for quantification of the captured pathogens. Assay completion times of between 6 and 10 min were achieved, whilst minuscule volumes of reagents were utilized.

Electrowetting-based digital microfluidic is a technique that utilizes a voltage-driven change in the apparent contact angle of a microliter-volume droplet to facilitate its manipulation. Combining this with functionalized magnetic beads enables the integration of multiple laboratory unit operations for sample preparation and identification of pathogens using Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Plataforma de Microfluidos Digitais baseada em eletrowetting para ensaio imunosorbent automatizado ligado à enzima

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

Mechano-Node-Pore Sensing: A Rapid, Label-Free Platform for Multi-Parameter Single-Cell Viscoelastic Measurements

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer metastasis. Conventional methods for measuring these properties, such as atomic force microscopy (AFM) and micropipette aspiration (MA), capture rich information, reflecting a cell's full viscoelastic response; however, these methods are limited by very low throughput. High-throughput approaches, such as real-time deformability cytometry (RT-DC), can only measure limited mechanical information, as they are often restricted to single-parameter readouts that only reflect a cell's elastic properties. In contrast to these methods, mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) is a flexible, label-free microfluidic platform that bridges the gap in achieving multi-parameter viscoelastic measurements of a cell with moderate throughput. A direct current (DC) measurement is used to monitor cells as they transit a microfluidic channel, tracking their size and velocity before, during, and after they are forced through a narrow constriction. This information (i.e., size and velocity) is used to quantify each cell's transverse deformation, resistance to deformation, and recovery from deformation. In general, this electronics-based microfluidic platform provides multiple viscoelastic cell properties, and thus a more complete picture of a cell's mechanical state. Because it requires minimal sample preparation, utilizes a straightforward electronic measurement (in contrast to a high-speed camera), and takes advantage of standard soft lithography fabrication, the implementation of this platform is simple, accessible, and adaptable to downstream analysis. This platform's flexibility, utility, and sensitivity have provided unique mechanical information on a diverse range of cells, with the potential for many more applications in basic science and clinical diagnostics.

Presented here is a method to mechanically phenotype single cells using an electronics-based microfluidic platform called mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). This platform maintains moderate throughput of 1-10 cells/s while measuring both the elastic and viscous biophysical properties of cells.

Mechano-Node-Pore Sensing: Uma plataforma rápida e sem rótulos para medições viscoelásticas de célula única multiparâmetro

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer ...

Película seca baseada em fotorresiste eletroquímica Microfluidic Biosensor plataforma: Fabricação de dispositivo, ensaio em-microplaqueta preparação e operação de sistema

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