Les auteurs tiennent à remercier la Fondation allemande de la recherche (DFG) pour financer partiellement cette œuvre sous Grant Numbers UR 70/10-01 et UR 70/12-01.

1. fabrication de la microfluidique biocapteur utilisant la technologie DFR <ol><li>gaufrettes de préparation de la PI.
	Substrat de couper un PI <ol><li>in 6 - autour de gaufrettes. Mettre la plaquette de la PI dans un four à 120 ° C pendant environ 1 h pour une cuisson au four déshydratation.</li>
	</ol></li> <li>Pour le processus de décollage, première étape de photolithographie.
	<ol><li>Programme l’essorage-coater à une heure de spinning de 30 s à 3 000 tr/min, avec une accélération de 2 000 tr/min/s. Place la plaquette PI sur le spin-coater et résoudre ce problème, appliquer le vide. Verser 2 mL d’une résistance, permettant le processus de décollage et démarrer le programme d’essorage-coater. Enlever la plaquette de l’essorage-coater et soft-cuire la gaufrette PI sur une plaque chauffante pendant 2 min à 100 ° C.</li>
		<li>Ajuster le masque souhaité pour les électrodes sur la plaquette de PI à le œil nu le patterning et l’exposer à la lumière de 2 UV 400 mJ/cm (365 nm). Place la plaquette dans un bol rempli d’un développeur de filtrage de résister dans un agitateur orbital et laissez-le agiter légèrement pendant 1 min.</li>
		<li>Après avoir retiré l’excédent resist, utiliser une douche pour rincer la gaufrette de PI à l’eau désionisée (DI-eau) sur un banc humide et ensuite à l’aide d’air comprimé sec.</li>
	</ol></li> <li>Dépôt de platine pour la formation des électrodes.
	<ol><li>Utilise un procédé de déposition de vapeur physique standard de dépôt 200 nm de platine la gaufrette 19.</li>
		<li>Dans un bol, mettre la plaquette. Ajouter le solvant correspondant dans le bol et enlevez la resist déjaugeage et en agitant légèrement la plaquette dans un agitateur orbital jusqu'à ce que tous les excès platine est supprimé. Rincez et séchez la gaufrette PI tel que décrit à l’étape 1.2.3.</li>
	</ol></li> <li>Deuxième étape de photolithographie : formant la couche d’isolation.
	<ol>, <li>Mettre la plaquette de la PI dans un four préchauffé à 120 ° C pendant 5 min déshydrater les it.</li>
		<li>Programme de la première étape d’un spin-coater à 5 s de la filature de temps à 500 tr/min. Programme de la deuxième étape de 30 s à 4 000 tr/min, avec une accélération de 700 tr/min/s.</li>
		<li>Placer la plaquette PI sur le spin-coater et résoudre ce problème, appliquer le vide. Verser 4 mL d’une photorésine de base d’époxy approprié avant de démarrer le programme d’essorage-coater.</li>
		<li>Soft-cuire la gaufrette couchée pendant 3 min à 95 ° C sur une plaque chauffante.</li>
		<li>Ajuster le masque pour la couche d’isolation sur la plaquette en utilisant les repères respectifs et une lentille de l’oculaire. Exposer la gaufrette à 100 mJ/cm 2 UV light (365 nm).</li>
		<li>Pour une cuisson au four après l’exposition, placer les tranches sur une plaque chauffante préchauffée pendant 2 minutes à 95 ° C.</li>
		<li>Placer les tranches dans un bol et développer la résistance avec un développeur approprié (par exemple, 1-méthoxy-2-propyle-acetat pendant 2 min, dans le cas de SU-8) dans un agitateur orbital.</li>
		<li>Rincer la gaufrette PI d’abord avec de l’isopropanol et puis rincer et sécher comme indiqué au point 1.2.3.</li>
		<li>Dur-cuire la résine photosensible dans une étuve pendant 3 h à 150 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Assisté par plasma nettoyage des électrodes.
	<ol><li>Pour enlever les résidus de résine photosensible, utiliser le plasma d’oxygène avec une unité de plasma standard. Démarrez le programme de nettoyage, à l’aide de puissance de 200 W basse fréquence avec un temps total de 3 min. 100 % O 2 flux et un taux de 250 sccm</li>
		<li>Placer la plaquette de la PI dans la chambre de plasma, fixer la plaquette sur la plaque de mise à la terre à l’aide de couvercles en verre et démarrer le processus de plasma.</li>
	</ol></li> <li>Argent et dépôts de chlorure d’argent : création de l’électrode de référence sur puce.
	<ol><li>Passivation le contact platine tampons de la plaquette avec un ruban adhésif de sensibles aux UV. Couper la feuille à 5 mm de largeur et 11 cm de long rayures et joignez-les à la plaquette, en protégeant les parties ne pas à déposer d’argent.</li>
		<li>Pour le dépôt d’argent, mettre un bain à ultrasons (35 kHz) dans une hotte et insérez un conteneur de solution d’électrolyte argent (100 g/L Ag, pH 12,5) dans la baignoire. Mettre le bain à ultrasons à température ambiante et la puissance de 10 %. 
		ATTENTION : Solutions électrolytiques argent sont très toxiques et doivent être manipulées avec précaution. Les fumées ne devraient jamais être inhalées.</li>
		<li>Connecter le contact en vrac les électrodes de référence à une source de courant constant. Connecter l’électrode du compteur, un fil d’argent qui est immergé dans la solution d’électrolyte argent, à la source de courant à l’aide de câbles de raccordement standards.</li>
		<li>Définir la source de courant DC et une densité de courant de -4,5 mA/cm 2, soit un taux de dépôt argent d’environ 0,3 µm/min. commencer le bain à ultrasons et laisser la source actuelle tourner pendant 10 min. Rincer la gaufrette à DI-eau</li>
		<li>Pour la chloration de l’électrode de référence, insérez un navire de solution de chlorure de potassium (KCl) 0,1 M dans le bain à ultrasons. Raccorder le contact en vrac de la plaquette et une électrode de platine qui est immergée dans la solution de KCl avec la source de courant constant.</li>
		<li>Définir la source de courant DC et une densité de courant de + 0,6 mA/cm 2, soit un taux de dépôt d’environ 0,075 µm/min. commencer le bain à ultrasons et laissez la source de courant pour 7,5 min.</li>
		<li>Rincer et sécher le PI de wafer, tel que décrit à l’étape 1.2.3.</li>
		<li>Enlever le ruban de sensibles aux UV après un UV (365 nm) exposition de 300 mJ/cm 2 et de rincer et de sécher la gaufrette de PI, à nouveau, comme décrit dans étape 1.2.3.</li>
	</ol></li> <li>Troisième étape photolithographie : DRJ aide à créer des canaux microfluidiques.
	<ol><li>Coupe les couches DFR nécessaires à une taille similaire à celle de la plaquette (20 x 20 cm 2). Fixer le masque désiré sur l’Exposeur et aligner la couche DFR sur le masque en utilisant l’oeil nu. Illuminer la resist avec 250 mJ/cm 2 UV light (365 nm).</li>
		<li>Retirer le film protecteur de la résine photosensible et développer la résistance pendant environ 2 minutes (selon les structures) dans une solution de carbonate de sodium (Na 2 CO 3) de 1 % à l’aide d’un bain à ultrasons standard (35 kHz) préchauffé à 42 ° C et une puissance sonore de 100 %. Pour arrêter la réaction immédiatement, secouez la résister pendant 1 min dans un bain d’HCl 1 % dans un agitateur orbital. Rincer et sécher chaque couche DFR, tel que décrit à l’étape 1.2.3. 
		Remarque : Au total, quatre couches DFR doivent être traités comme indiqué dans l’étape 1.7 : couche un canal, un couvre couche et deux couches de dos (empêchant le biocapteur de plier à la fin).</li>
	</ol></li> <li>Des couches de stratification de la DRF sur le substrat PI.
	<ol><li>Placer la plaquette PI sur une feuille de frais généraux de transparence et fixez-le à l’aide d’un ruban adhésif standard. Ajuster la couche de canal DFR sur la plaquette PI sous un microscope, en utilisant les structures respectives alignement.</li>
		<li>Pour la stratification, utiliser une plastifieuse standard de pain chaud et préchauffer le rouleau supérieur à 100 ° C et le rouleau inférieur à 60 ° C. régler la pression à 3 bars, avec une vitesse de 0,3 m/min. Place la gaufrette avec la couche DFR fixe au milieu de la plastifieuse et Démarrez-le ; la DRF est poussée par la plastifieuse. Répétez l’étape après avoir tourné la gaufrette de 180°.</li>
		<li>Pour éviter la flexion du biocapteur, stratifié les deux couches de dos développés sur la plaquette suivant étapes 1.8.1-1.8.2.</li>
	</ol></li> <li>Employant une barrière hydrophobe s’arrêter et la puce d’étanchéité.
	<ol><li>Enlever la couche protectrice de la face avant du chenal DFR laycateur en plaçant un ruban adhésif standard à une extrémité de la DRF et en tirant vers le haut. Utiliser un distributeur de main avec tubes de 0,004 composant logiciel enfichable pour distribuer des petites gouttelettes de polytétrafluoroéthylène dissous dans les puits de la couche d’isolation. Pour sceller la puce microfluidique, laminé la pellicule protectrice DFR sur la couche de canal, tel que décrit à l’étape 1.8.</li>
	</ol></li> <li>Dur la cuisson les biocapteurs microfluidiques.
	<ol><li>Supprimer tous les protecteur feuilles sur la couverture et le dos de couches DFR. Couper les biocapteurs en lanières à l’aide d’une paire de ciseaux d’ordinaire. Guérir les puces dans un four à 160 ° C pendant 3 h</li>
	</ol></li></ol> 2. MODE OPERATOIRE immobilisation sur puce <ol><li>Adsorption d’avidine dans le domaine de l’immobilisation de la chaîne.
	<ol><li>Préparer une solution d’avidine 100 µg/mL en 10 mM tampon phosphate salin (PBS) à un pH de 7.4.</li>
		<li>Distribuer 2 µL de la solution de l’avidine à la prise du biocapteur. 
		Remarque : Le canal est rempli par des forces capillaires jusqu'à ce que le liquide atteigne la barrière hydrophobe arrêt.</li>
		<li>Pour s’assurer que la fluidique continue d’arrêt à la barrière pendant le temps entier d’incubation, administrer 2 µL de DI-l’eau à la sortie de la puce. Incuber la puce à 25 ° C pendant 1 h dans un récipient fermé.</li>
		<li>Supprimer excès réactifs grâce à l’entrée de la puce en appliquant un vide. Laver le canal avec 50 µL de tampon de lavage (PBS avec 0,05 % Tween 20), distribué à la sortie alors que le vide est appliqué. Sécher le canal pendant 30 s, tandis que le vide est appliqué.</li>
	</ol></li> <li>Bloquer la surface du canal pour inhiber la liaison non-spécifique.
	<ol><li>Préparer une solution d’albumine sérique bovine (BSA) de 1 % en 10 mM PBS à un pH de 7.4.</li>
		<li>Pipette 2 µL de la solution de BSA 1 % sur l’entrée et 2 µL de DI-l’eau à la sortie du canal. Incuber la puce à 25 ° C pendant 1 h dans un récipient fermé. Retirez l’excès réactifs et sécher le canal comme indiqué au point 2.1.4.</li>
	</ol></li> <li>Oligos d’incubation de l’ADN marqué avec biotine et 6-Fam.
	<ol><li>Préparer à différentes concentrations (0,001-5 µM) de la solution d’ADN en 10 mM PBS à un pH de 7.4.</li>
		<li>Distribuer 2 µL d’une concentration de la solution d’ADN sur l’entrée et 2 µL de DI-l’eau à la sortie. Incuber la puce à 25 ° C pendant 15 minutes dans un récipient fermé.</li>
		<li>Répéter l’étape 2.3.2 pour les autres concentrations d’ADN à l’aide de jetons supplémentaires biocapteur.</li>
		<li>Enlever les excès réactifs et sécher le canal comme indiqué au point 2.1.4.</li>
	</ol></li> <li>Anticorps marqués immobilisation de GOx de 6-FAM.
	<ol><li>Formuler une concentration de 5 µg/mL d’anticorps 6-FAM en 10 mM PBS à un pH de 7.4.</li>
		<li>Introduire 2 µL de la solution d’anticorps à l’entrée et 2 µL de DI-l’eau à la sortie du canal. Incuber les anticorps marqués à 25 ° C pendant 15 minutes dans un récipient fermé. Retirez l’excès réactifs, comme indiqué au point 2.1.4.</li>
	</ol></li></ol> 3. Ampérométrique Signal Detection Using la Technique coule-Stop <ol><li>préparation de la solution de substrat pour la détection électrochimique.
	<ol><li>Formuler une solution de glucose de 40 mM dans du PBS de 0,1 M à un pH de 7,4 à ultra-pures.</li>
		<li>Pour le traitement préliminaire, préparer une solution de PBS de 0,1 M à pH 7,4 dans ultra-pures.</li>
	</ol></li> <li>Traitement préliminaire des électrodes travail.
	<ol><li>Utiliser le support de la puce sur mesure afin de permettre la mise en place facile de la puce et un lien fluidique et électrique.</li>
		<li>Connecter électriquement le biocapteur au potentiostat. Assurer le contact fluidique du canal microfluidique un pousse-seringue et le réservoir de réactif à l’aide de l’adaptateur sur mesure et les tubes. Démarre l’ordinateur portable qui est connecté à la potentiostat et démarrer le contrôleur de pompe seringue, contrôle de la circulation fluidique grâce à la puce.</li>
		<li>Démarrer manuellement, le pousse-seringue avec du PBS de 0,1 M à un débit de 20 µL/min. À l’électrode de travail par rapport à l’électrode de référence sur puce, appliquer une tension alternative de 0,8 et de -0,05 V pour 5 s chaque 30 cycles. Suite à cela, s’oxydent l’électrode de travail en appliquant une tension de 0,8 V pendant 60 s.</li>
	</ol></li> <li>Lecture de test en utilisant la technique d’arrêt de débit.
	<ol><li>Pour commencer la lecture du signal test, attendez jusqu'à ce que le signal mesuré actuel se stabilise. Arrêter la pompe de seringue et basculer le réactif de PBS de 0,1 M à la solution de glucose de 40 mM et démarrez le logiciel sur le contrôleur de pompe seringue ; Il s’arrête automatiquement l’écoulement pour 1, 2 ou 5 min et va redémarrer puis le débit à nouveau. Observez la pointe de courant qui en résulte. 
		Remarque : Pour l’analyse des données, la pointe de courant ou de la charge du PIC sont envisageables, comme décrit dans le modèle d’un affichage de signal électrochimique ( Figure 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole présenté ici pour la fabrication d’un Biocapteur électrochimique microfluidique permet le développement d’une plate-forme abordable, compact et facile à utiliser pour la détection des biomolécules. Selon le test utilisé par la suite sur le biocapteur, plusieurs différents biomarqueurs peuvent être détectées. Cela rend la plate-forme très polyvalent et fournit un accès étendu à divers domaines d’application, des tests de diagnostic standards (p. ex., déterminer la présence de ...

Pendant les deux dernières décennies, les applications diagnostiques sont devenus élémentaires pour des études approfondies sur le développement de la santé publique mondiale. Traditionnellement, les outils de diagnostic de laboratoire sont utilisées pour la détection des maladies. Même s’ils jouent encore un rôle essentiel dans le diagnostic des maladies, point-of-care test (FAOP) effectué à proximité du patient ou par le patient lui-même est devenu de plus en plus monnaie courante ces dernières années. Surtout dans de tels cas nécessitant un traitement immédiat, tels que l’infarctus aigu du myocarde ou de suivi de diabète, la confirmation rapide d’une constatation clinique est indispensable. Par conséquent, il y a un besoin croissant de dispositifs FAOP qui peut être utilisé par des non-spécialistes et qui sont en même temps capables d’effectuer des tests de diagnostic précis en vitro dans un court laps de temps1,2,3,4 .
Des améliorations remarquables ont été accomplis dans le domaine de la FAOP. Cependant, il existe encore de nombreux défis à surmonter5,6,7,8. Pour une plate-forme de FAOP qui sera lancé avec succès sur le marché et d’être compétitifs avec les diagnostics de laboratoire, l’appareil doit strictement remplir les exigences suivantes : (i) fournir des résultats précis et quantitatives qui sont en accord avec le laboratoire constatations ; (ii) avoir court échantillon-à-résultat fois, ce qui permet le traitement immédiat du patient ; (iii) disposent d’une manipulation simple et facile, même lorsque utilisé par des personnes inexpérimentées et nécessitent l’intervention de l’utilisateur réduite ; et (iv) comprennent un détecteur de faible coût conçu pour les applications à usage unique. En outre, exempte d’équipement diagnostic est favorables, principalement dans des environnements pauvres en ressources3,4,6.
En raison de ces exigences sévères, que deux systèmes FAOP basés sur détection électrochimique (p. ex., bandelettes de test glycémique) et sur les immuno-essais écoulement latéral (p. ex., les tests de grossesse maison) ont été lancés avec succès sur le marché ainsi jusqu'à maintenant. Cependant, les deux systèmes souffrent de désavantages comme mauvaises performances (c'est-à-dire sang surveillance du glucose a résultats inexacts et essais d’écoulement latéral fournissent seulement des résultats de mesure qualitative de (positifs ou négatifs))4, 6. Ces inconvénients des systèmes conventionnels de FAOP ont conduit à une demande croissante sur l’exploration de nouvelles technologies qui offrent une détection rapide, peu coûteux et quantitative au point de soins4,5.
Pour relever ces défis de dispositifs FAOP, technologie DFR a été récemment employée pour la fabrication de biocapteurs jetables et low-cost9,10,11,12, 13 , 14. par rapport aux matériaux lithographiques mou et liquides, comme le PDMS ou SU-8, DRJ présente de nombreux avantages : (i) sont disponibles dans une variété de compositions et d’épaisseurs (de quelques microns à quelques millimètres) ; (ii) ont une surface très rugueuse, qui facilite l’adhérence aux différents matériaux ; (iii) uniformité d’épaisseur excellente fonctionnalité ; (iv) offrir à peu de frais, facile et haut débit de fabrication pour la production de masse ; (v) sont facile à couper avec divers outils de faible coût, comme une simple paire de ciseaux ; et (vi) permettent la création de structures tridimensionnelles, comme canaux microfluidiques, par empilement des couches multiples de DFR uns sur les autres.
En revanche, DRJ ont en général une résolution relativement faible par rapport aux résines photosensibles liquides, qui sont principalement causés par l’épaisseur du film et de la distance accrue entre le masque et la DRF en raison de la pellicule protectrice, ce qui permet en outre de lumière diffusion. Pourtant, pour la fabrication de biocapteurs microfluidiques intégrée, DRJ est parfaitement adapté à la production de masse de faible coût.
Donc, nous présentons dans ce travail la fabrication et l’application d’un biocapteur axée sur la DFR électrochimique microfluidiques. Le protocole détaillé décrit chaque étape de production de la plateforme de biocapteurs, l’immobilisation sur puce d’un essai de modèle basé sur l’ADN et sa lecture électrochimique en utilisant la technique d’arrêt de débit. Cette plateforme universelle permet la détection de nombreuses sortes de biomolécules, utilisant des technologies de test différents (p. ex., génomique, cellomics et la protéomique) ou formats de test (p. ex., concurrentiel, sandwich ou direct). Basé sur une telle plate-forme DFR, notre groupe précédemment démontré avec succès la quantification rapide et sensible des analytes différents, y compris les antibiotiques13,15,16 (tétracycline, pristinamycine et ß-lactamines), troponine j’ai17et18de la substance P.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Material&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyralux</td><td>DuPont</td><td>AP8525R</td><td>Used as polyimide substrate</td></tr><tr><td>MA-N 1420</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MA-N1420</td><td>Lift-off resit to define the platinum depostion</td></tr><tr><td>Ma-D 533s</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MaD533S</td><td>Developer for MA-N1420</td></tr><tr><td>Platinum</td><td>-</td><td>-</td><td>Electrode and contact pad material</td></tr><tr><td>Ma-R 404s</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MaR404S</td><td>Remover for MA-N1420</td></tr><tr><td>SU-8 3005</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8-3005</td><td>Photoresist to define the electrode area and as insulation</td></tr><tr><td>1-methoxy-2-propanol acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108-65-6</td><td>Developer for SU-8 3005</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>VWR</td><td>8.18766.2500</td><td>Removing of the SU-8 developer</td></tr><tr><td>1020R</td><td>Ultron Systems Inc.</td><td>1020R</td><td>UV sensitive adhesive tape for protection of contact pads</td></tr><tr><td>Arguna S</td><td>Degussa</td><td>1935</td><td>For Silver depostion on reference electrode</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Methrom</td><td>62308.020</td><td>For chloridation of the silver reference electrode</td></tr><tr><td>Pyralux</td><td>DuPont</td><td>PC1025</td><td>Dry film photoresist</td></tr><tr><td>Sodium carbonat</td><td>Fluka</td><td>71352</td><td>Developer for Pyralux PC1025</td></tr><tr><td>Hydrogen chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30720</td><td>To top the development of the DFR</td></tr><tr><td>Teflon AF 1600</td><td>DuPont</td><td>AF1600</td><td>For employing the stopping barrier</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PA104</td><td>Mega Electronics</td><td>-</td><td>Bubble etch tank</td></tr><tr><td>FED 53</td><td>Binder</td><td>9010-0018</td><td>Oven</td></tr><tr><td>SPIN150</td><td>APT</td><td>-</td><td>Spin coater</td></tr><tr><td>Pr&amp;auml;zitherm</td><td>Harry Gestigkeit GmbH</td><td>PZ 28-2</td><td>Hot plate</td></tr><tr><td>Hellas</td><td>Bungard Elektronik</td><td>40000</td><td>Exposure unit</td></tr><tr><td>Tetra30-LF-PC</td><td>Diener</td><td>-</td><td>Plasma unit</td></tr><tr><td>Univex 500</td><td>Leybold</td><td>-</td><td>Physical vapor deposition unit</td></tr><tr><td>Shaker S4</td><td>ELMI</td><td>-</td><td>Orbital shaker</td></tr><tr><td>Sonorex Super 10 P</td><td>Bandelin</td><td>783</td><td>Sonic bath</td></tr><tr><td>6221 DC and AC</td><td>Keithley</td><td>-</td><td>Current source</td></tr><tr><td>HRL 350</td><td>Ozatec</td><td>-</td><td>Laminator unit</td></tr><tr><td>Vaccum pen</td><td>EFD</td><td>-</td><td>Vacuum pen</td></tr></tbody></table>

dry film photoresist-based electrochemical microfluidic biosensor platform: device fabrication, on-chip assay preparation, and system operation

Ces dernières années, diagnostic biomarqueur est devenu un outil indispensable pour le diagnostic de la maladie humaine, en particulier pour les diagnostics de point-of-care. Une plateforme facile à utiliser et peu coûteux de capteur est hautement souhaitée pour mesurer différents types d’analytes (p. ex., biomarqueurs, hormones et des médicaments) quantitativement et spécifiquement. Pour cette raison, la technologie de résine photosensible feuil sec - permettant pas cher, fabrication facile et haut débit - servait à fabriquer les biocapteurs microfluidiques présentées ici. Selon l’essai biologique utilisé par la suite, la plate-forme polyvalente est capable de détecter différents types de biomolécules. Pour la fabrication de l’appareil, les électrodes de platine sont articule autour d’une feuille souple polyimide (PI) dans l’étape du processus de salle blanche seulement. La feuille PI sert de substrat pour les électrodes, qui sont isolés avec un photosensible à base d’époxy. Le canal microfluidique est ensuite généré par le développement et le laminage de feuilles de résine photosensible (DFR) feuil sec sur la plaquette de la PI. En utilisant une barrière hydrophobe s’arrêter dans le canal, le canal est divisé en deux domaines spécifiques : une section d’immobilisation pour le dosage immunoenzymatique et une cellule de mesure électrochimique pour la lecture du signal ampérométrique.
L’immobilisation de l’essai biologique sur puce est interprétée par l’adsorption de la biomolécules à la surface du canal. L’enzyme oxydase de glucose est utilisé comme un capteur pour la génération de signaux électrochimiques. En présence du substrat, glucose, peroxyde d’hydrogène est produit, qui est détecté à l’électrode de travail platine. La technique de coule-stop est appliquée pour obtenir l’amplification du signal avec une détection rapide. Biomolécules différent peut être mesurée quantitativement au moyen du système microfluidique introduite, ce qui donne une indication des différents types de maladies, ou, en ce qui concerne les drogues thérapeutiques surveillance, facilitant une thérapie personnalisée.

Conception et Fabrication de la plate-forme de biocapteurs microfluidiques :
La fabrication des puces microfluidiques biocapteur est réalisée sur le wafer-niveau par des techniques photolithographiques standard utilisant des couches multiples de DFR. Cette stratégie de fabrication repose sur la stratification de couches développés de DRJ sur un substrat de PI platine à motifs, formant des canaux microfluidiques. Un bref rés...

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Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Feuil sec axée sur la résine photosensible de biocapteurs microfluidiques électrochimiques plate-forme : Fabrication de dispositifs, préparation de dosage sur puce et fonctionnement du système

Une plateforme de biocapteurs microfluidiques a été conçue et fabriqué en utilisant la technologie de résine photosensible feuil sec peu coûteux pour la quantification rapide et sensible des analytes différents. Ce système à usage unique permet la lecture électrochimique du-puce-immobilisé les dosages-enzymatique au moyen de la technique d’arrêt de débit.

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.7K vues.  University of Freiburg. Une plateforme de biocapteurs microfluidiques a été conçue et fabriqué en utilisant la technologie de résine photosensible feuil sec peu coûteux pour la quantification rapide et sensible des analytes différents. Ce système à usage unique permet la lecture électrochimique du-puce-immobilisé les dosages-enzymatique au moyen de la technique d’arrêt de débit.

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Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Methods for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over orientation and immobilization density are highly desirable for biosensor and microarray applications. In this Study, we use a highly efficient covalent bioorthogonal [4+2] cycloaddition reaction between trans-cyclooctene (TCO) and 1,2,4,5-tetrazine (Tz) to enable the microfluidic immobilization of TCO/Tz-derivatized molecules. We monitor the process in real-time under continuous flow conditions using surface plasmon resonance (SPR). To enable reversible immobilization and extend the experimental range of the sensor surface, we combine a non-covalent antigen-antibody capture component with the cycloaddition reaction. By alternately presenting TCO or Tz moieties to the sensor surface, multiple capture-cycloaddition processes are now possible on one sensor surface for on-chip assembly and interaction studies of a variety of multi-component structures. We illustrate this method with two different immobilization experiments on a biosensor chip; a small molecule, AP1497 that binds FK506-binding protein 12 (FKBP12); and the same small molecule as part of an immobilized and in situ-functionalized nanoparticle.

We present a method for rapid, reversible immobilization of small molecules and functionalized nanoparticle assemblies for Surface Plasmon Resonance (SPR) studies, using sequential on-chip bioorthogonal cycloaddition chemistry and antibody-antigen capture.

Microfluidique Capture-cyclo-réaction sur puce pour immobiliser de façon réversible de petites molécules ou structures multi-composants pour applications biocapteurs

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

Recherche

Chimie

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Méthodes de détection par fluorescence pour les plateformes microfluidiques gouttelettes

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Bio-ingénierie

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment 1,2 . These materials are desirable because they possess highly controllable dimensional and material characteristics, are biocompatible and promote cell adhesion, can be modified through topographic patterning or by chemically altering the surface, and can be used as a depot for biologically active molecules for drug delivery related applications 3-8 . In addition, silk films are relatively straightforward to custom design, can be designed to dissolve within minutes or degrade over years in vitro or in vivo, and are produce with the added benefit of being transparent in nature and therefore highly suitable for imaging applications 9-13. The culture system methodology presented here represents a scalable approach for rapid assessments of cell-silk film surface interactions. Of particular interest is the use of surface patterned silk films to study differences in cell proliferation and responses of cells for alignment 12,14 . The seeded cultures were cultured on both micro-patterned and flat silk film substrates, and then assessed through time-lapse phase-contrast imaging, scanning electron microscopy, and biochemical assessment of metabolic activity and nucleic acid content. In summary, the silk film in vitro culture system offers a customizable experimental setup suitable to the study of cell-surface interactions on a biomaterial substrate, which can then be optimized and then translated to in vivo models. Observations using the culture system presented here are currently being used to aid in applications ranging from basic cell interactions to medical device design, and thus are relevant to a broad range of biomedical fields.

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk films are a novel class of biomaterials readily customizable for an array of biomedical applications. The presented silk film culture system is highly adaptable to a variety of in vitro analyses. This system represents a biomaterial design platform offering in vitro optimization before direct translation to in vivo models.

Système de culture de la soie du film pour In vitro Analyse et conception des biomatériaux

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Une puce microfluidique pour l&#39;analyse chimique polyvalente de cellules isolées

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Une biopuce microfluidique électrochimique à base d&#39;analyse ADN hybridation Sans étiquette

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

Microfluidique numérique pour le traitement automatisé protéomiques

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Biologie

Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation

For the successful implementation of microfluidic reaction systems, such as PCR and electrophoresis, the movement of small liquid volumes is essential. In conventional lab-on-a-chip-platforms, solvents and samples are passed through defined microfluidic channels with complex flow control installations. The droplet actuation platform presented here is a promising alternative. With it, it is possible to move a liquid drop (microreactor) on a planar surface of a reaction platform (lab-in-a-drop). The actuation of microreactors on the hydrophobic surface of the platform is based on the use of magnetic forces acting on the outer shell of the liquid drops which is made of a thin layer of superhydrophobic magnetite particles. The hydrophobic surface of the platform is needed to avoid any contact between the liquid core and the surface to allow a smooth movement of the microreactor. On the platform, one or more microreactors with volumes of 10 &#181;L can be positioned and moved simultaneously. The platform itself consists of a 3 x 3 matrix of electrical double coils which accommodate either neodymium or iron cores. The magnetic field gradients are automatically controlled. By variation of the magnetic field gradients, the microreactors' magnetic hydrophobic shell can be manipulated automatically to move the microreactor or open the shell reversibly. Reactions of substrates and corresponding enzymes can be initiated by merging the microreactors or bringing them into contact with surface immobilized catalysts.

Lab-in-a-drop reaction systems allow the versatile implementation of complex reactions in a microfluidic scale. An automated actuation platform consisting of a 3 x 3 matrix of electromagnetic coils was developed and successfully used to merge two 10 &#181;L microreactors and thereby initiate an enzymatic reaction in the resulting liquid marbles.

Aqueux gouttelettes servis de microréacteurs enzymatiques et leur déclenchement électromagnétique

For the successful implementation of microfluidic reaction systems, such as PCR and electrophoresis, the movement of small liquid volumes is essential. In ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

Plate-forme microfluidique avec multiplexée Détection électronique pour le suivi spatial des particules

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits the dielectric properties of thin insulator films to enhance the charge density and hence boost the electrowetting effect. The presence of charges results in an electrically induced spreading of the droplet which permits purposeful manipulation across a hydrophobic surface. Here, we demonstrate EWOD-based protocol for sample processing and detection of four categories of antigens, using an automated surface actuation platform, via two variations of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) methods. The ELISA is performed on magnetic beads with immobilized primary antibodies which can be selected to target a specific antigen. An antibody conjugated to HRP binds to the antigen and is mixed with H2O2/Luminol for quantification of the captured pathogens. Assay completion times of between 6 and 10 min were achieved, whilst minuscule volumes of reagents were utilized.

Electrowetting-based digital microfluidic is a technique that utilizes a voltage-driven change in the apparent contact angle of a microliter-volume droplet to facilitate its manipulation. Combining this with functionalized magnetic beads enables the integration of multiple laboratory unit operations for sample preparation and identification of pathogens using Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Plateforme microfluidique numérique basée sur l’électrowetting pour l’analyse immunosorbent liée à l’enzyme automatisée

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

Mechano-Node-Pore Sensing: A Rapid, Label-Free Platform for Multi-Parameter Single-Cell Viscoelastic Measurements

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer metastasis. Conventional methods for measuring these properties, such as atomic force microscopy (AFM) and micropipette aspiration (MA), capture rich information, reflecting a cell's full viscoelastic response; however, these methods are limited by very low throughput. High-throughput approaches, such as real-time deformability cytometry (RT-DC), can only measure limited mechanical information, as they are often restricted to single-parameter readouts that only reflect a cell's elastic properties. In contrast to these methods, mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) is a flexible, label-free microfluidic platform that bridges the gap in achieving multi-parameter viscoelastic measurements of a cell with moderate throughput. A direct current (DC) measurement is used to monitor cells as they transit a microfluidic channel, tracking their size and velocity before, during, and after they are forced through a narrow constriction. This information (i.e., size and velocity) is used to quantify each cell's transverse deformation, resistance to deformation, and recovery from deformation. In general, this electronics-based microfluidic platform provides multiple viscoelastic cell properties, and thus a more complete picture of a cell's mechanical state. Because it requires minimal sample preparation, utilizes a straightforward electronic measurement (in contrast to a high-speed camera), and takes advantage of standard soft lithography fabrication, the implementation of this platform is simple, accessible, and adaptable to downstream analysis. This platform's flexibility, utility, and sensitivity have provided unique mechanical information on a diverse range of cells, with the potential for many more applications in basic science and clinical diagnostics.

Presented here is a method to mechanically phenotype single cells using an electronics-based microfluidic platform called mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). This platform maintains moderate throughput of 1-10 cells/s while measuring both the elastic and viscous biophysical properties of cells.

Mechano-node-pore Sensing: une plate-forme rapide et sans marquage pour les mesures viscoélastiques multi-paramètres à cellule unique

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer ...

Feuil sec axée sur la résine photosensible de biocapteurs microfluidiques électrochimiques plate-forme : Fabrication de dispositifs, préparation de dosage sur puce et fonctionnement du système

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