Gli autori vorrei ringraziare la Fondazione di ricerca tedesca (DFG) per finanziare parzialmente questo lavoro sotto Grant numeri UR 70/10-01 e UR 70/12-01.

1. fabbricazione della tecnologia microfluidica biosensore utilizzando DFR <ol><li>cialde di preparazione della PI.
	<ol><li>Taglio una PI substrato nella 6 - in cialde tonde. Mettere la cialda di PI in un forno a 120 ° C per circa 1 h per cuocere una disidratazione.</li>
	</ol></li> <li>Primo passo fotolitografia per il processo di Lift-off.
	<ol><li>Programma spin-spalmatrice a un tempo di 30 s filatura a 3.000 giri/min, con un'accelerazione di 2.000 giri/min/s. posto il wafer di PI su spin-coater e risolvere il problema, applicare il vuoto. Pipettare 2 mL di un resist, consentendo il processo di Lift-off e avviare il programma di spin coater. Rimuovere la cialda da spin-coater e soft-cuocia il wafer di PI su una piastra calda per 2 min a 100 ° C.</li>
		<li>Regolare la maschera desiderata per patterning gli elettrodi sul wafer PI con l'occhio nudo ed esporlo alla luce di 2 UV 400 mJ/cm (365 nm). Posto la cialda in una ciotola riempita con uno sviluppatore di resistere di corrispondenza su agitatore orbitale e lasciarlo agitare leggermente per 1 min.</li>
		<li>Dopo il resist in eccesso viene rimosso, è possibile utilizzare una doccia per sciacquare il wafer di PI con acqua deionizzata (acqua deionizzata) su una panchina umida e asciugarlo in seguito usando aria compressa.</li>
	</ol></li> <li>Deposizione di platino per la formazione degli elettrodi.
	<ol><li>Utilizzare un processo di deposizione di vapore fisico standard al deposito 200 nm di platino sul wafer 19.</li>
		<li>Mettere la cialda in una ciotola. Aggiungere il remover corrispondente nella ciotola e rimuovere il fotoresist sganciabile agitando leggermente la cialda su agitatore orbitale fino tutti platinum in eccesso viene rimosso. Sciacquare e asciugare la cialda di PI come descritto al punto 1.2.3.</li>
	</ol></li> <li>Seconda fase Fotolitografia: formando lo strato dell'isolamento.
	<ol><li>Mettere la cialda di PI in forno preriscaldato a 120 ° C per 5 min disidratare it.</li>
		<li>Programma il primo passo di una spin coater per 5 s di filatura tempo a 500 giri/min. Programmare il secondo passo per 30 s a 4.000 giri/min, con un'accelerazione di 700 giri/min/s.</li>
		<li>Posizionare la cialda di PI su spin-coater e risolvere il problema, applicare il vuoto. Dispensare 4 mL di un'appropriata base epossidica photoresist prima di iniziare il programma di spin coater.</li>
		<li>Soft-cuocia il wafer rivestito per 3 min a 95 ° C su una piastra calda.</li>
		<li>Regolare la maschera per il livello di isolamento sul wafer utilizzando gli indicatori di allineamento rispettivi e una lente oculare. Esporre la cialda a 100 mJ/cm 2 UV luce (365 nm).</li>
		<li>Per cuocere un post-esposizione, posizionare la cialda su un piatto caldo preriscaldato per 2 min a 95 ° C.</li>
		<li>Inserire la cialda in una ciotola e sviluppare la resistenza con uno sviluppatore adatto (ad es., 1-metossi-2-propil-acetat per 2 min, nel caso di SU-8) su agitatore orbitale.</li>
		<li>Prima sciacquare la cialda di PI con isopropanolo e poi risciacquare e asciugare come descritto al punto 1.2.3.</li>
		<li>Rigido-cuocia il photoresist in forno per 3 ore a 150 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Assistita da plasma pulizia degli elettrodi.
	<ol><li>Per rimuovere i residui di photoresist, utilizzare il plasma ad ossigeno con un'unità di plasma standard. Avviare il programma di lavaggio, alimentato a bassa frequenza 200-W con il 100% O 2 flusso, un tasso di sccm 250 e un tempo totale di 3 min.</li>
		<li>Inserire la cialda PI camera plasma, difficoltà la cialda sulla piastra con messa a terra con coperchi in vetro e avviare il processo al plasma.</li>
	</ol></li> <li>Argento e deposizione di cloruro d'argento: creazione dell'elettrodo di riferimento su chip a.
	<ol><li>Passivazione il contatto platino pastiglie del wafer con un nastro adesivo UV sensibili. Tagliare il foglio a strisce lunghe cm 5 mm di larghezza e 11 e allegarli al wafer, proteggendo le parti di non essere depositato con argento.</li>
		<li>Per la deposizione di argento, mettere un bagno ad ultrasuoni (35 kHz) in una cappa e un contenitore di soluzione elettrolitica argento (100 g/L Ag, pH 12,5) inserire la vasca. Impostare il bagno a ultrasuoni a temperatura ambiente e il potere di 10%. 
		Attenzione: Soluzioni di elettroliti d'argento sono altamente tossici e devono essere maneggiati con estrema cura. I fumi non devono mai essere inalati.</li>
		<li>Collegare il contatto di massa degli elettrodi di riferimento a una fonte di corrente costante. Collegare l'elettrodo contatore, un filo d'argento che è immerso nella soluzione dell'elettrolito d'argento, all'origine corrente utilizzando cavi di collegamento standard.</li>
		<li>Impostare la sorgente di corrente a DC e una densità di corrente di -4,5 mA/cm 2, con un tasso di deposizione d'argento di circa 0,3 µm/min iniziare il bagno ad ultrasuoni e lasciate in origine corrente per 10 minuti la cialda di risciacquo con acqua DI</li>
		<li>Per la clorazione dell'elettrodo di riferimento, inserire un vaso di soluzione di cloruro di potassio (KCl) 0,1 M nel bagno ad ultrasuoni. Collegare il contatto di massa di un elettrodo di platino che è immersa nella soluzione KCl con la fonte di corrente costante e il wafer.</li>
		<li>Impostare la sorgente di corrente a DC e una densità di corrente di + 0,6 mA/cm 2, con un tasso di deposizione di circa 0.075 µm/min avviare il bagno ad ultrasuoni e lasciate che la sorgente di corrente per un minimo di 7,5</li>
		<li>Sciacquare e asciugare il PI di wafer, come descritto al punto 1.2.3.</li>
		<li>Rimuovere il nastro UV sensibili dopo un UV (365 nm) esposizione di 300 mJ/cm 2 e risciacquare ed asciugare la cialda di PI, nuovamente come descritto nel passo 1.2.3.</li>
	</ol></li> <li>Terzo passo di fotolitografia: utilizzando DFRs per creare i canali microfluidici.
	<ol><li>Tagliare gli strati DFR necessari a una dimensione simile a quella del wafer (20 x 20 cm 2). Fissare la maschera desiderata sull'unità di esposizione e allineare lo strato DFR sulla maschera utilizzando l'occhio nudo. Illuminare il resistere con 250 mJ/cm 2 UV luce (365 nm).</li>
		<li>Rimuovere la pellicola protettiva del photoresist e sviluppare il resistere per circa 2 min (a seconda delle strutture) in una soluzione di carbonato di sodio (Na 2 CO 3) 1% mediante un bagno ad ultrasuoni standard (35 kHz) preriscaldato a 42 ° C e una potenza sonora del 100%. Per interrompere immediatamente la reazione, agitare il resist per 1 min in un bagno di HCl 1% su agitatore orbitale. Sciacquare e asciugare ogni strato DFR, come descritto al punto 1.2.3. 
		Nota: In totale, quattro strati DFR devono essere elaborati come indicato al punto 1.7: strato di un canale, un rivestimento protettivo e due strati di retro (impedendo il biosensore di piegatura alla fine).</li>
	</ol></li> <li>Strati di laminazione del DFR sul substrato PI.
	<ol><li>Posizionare la cialda di PI su una lamina di overhead di trasparenza e fissarlo con nastro adesivo standard. Regolare il livello del DFR canale sul wafer PI sotto un microscopio, utilizzando le strutture di allineamento rispettivi.</li>
		<li>Per la laminazione, utilizzare una plastificatrice a caldo standard del rotolo e preriscaldare il rullo superiore a 100 ° C e la bobina inferiore a 60 ° C. impostare la pressione a 3 bar, con una velocità di avanzamento di 0,3 m/min posto la cialda con lo strato DFR fisso al centro la plastificatrice e avviarlo; Il DFR viene spinto attraverso la plastificatrice. Ripetere il passaggio dopo aver ruotato la cialda di 180°.</li>
		<li>Per evitare la flessione del biosensore, laminato due strati retro sviluppati su wafer seguendo passaggi 1.8.1-1.8.2.</li>
	</ol></li> <li>Impiegando una barriera idrofoba fermarsi e il chip di sigillamento.
	<ol><li>Rimuovi lo strato protettivo dal lato anteriore del canale DFR laicier posizionando il nastro adesivo standard ad una estremità del DFR e tirandolo verso l'alto. Utilizzare un mano dispenser con tubi di 0,004 per versare piccole goccioline di politetrafluoroetilene disciolto nei pozzetti dello strato isolante. Per sigillare il chip microfluidici, laminato lo strato di copertura DFR sul livello di canale, come descritto al punto 1.8.</li>
	</ol></li> <li>Hard-cottura biosensore microfluidici.
	<ol><li>Rimuovi tutto protettivo sventa sulla copertina e retro strati DFR. I biosensori tagliate a strisce utilizzando un normale paio di forbici. Curare le patatine in forno a 160 ° C per 3 h.</li>
	</ol></li></ol> 2. Procedura di dosaggio immobilizzazione su chip <ol><li>adsorbimento dell'avidina nella zona del canale immobilizzazione.
	<ol><li>Preparare una soluzione di avidina 100 µ g/mL in soluzione tampone fosfato 10 mM (PBS) ad un pH di 7,4.</li>
		<li>Erogare 2 µ l della soluzione avidina sull'ingresso del biosensore. 
		Nota: Il canale è riempito da forze capillari fino a quando il fluido raggiunge la barriera di arresto idrofobo.</li>
		<li>Per garantire che la fluidica continua a fermarsi alla barriera durante il tempo di incubazione intero, dispensare 2 µ l di acqua DI sull'uscita del chip. Incubare il chip a 25 ° C per 1 h in un contenitore chiuso.</li>
		<li>Rimuovere i reagenti in eccesso attraverso l'entrata del chip applicando un vuoto. Lavare il canale con 50 µ l di tampone di lavaggio (PBS con 0.05% Tween 20), erogata in uscita mentre viene applicato il vuoto. Asciugare il canale per 30 s mentre viene applicato il vuoto.</li>
	</ol></li> <li>Blocco nell'area di canale per inibire il grippaggio aspecifiche.
	<ol><li>Preparare una soluzione di albumina di siero bovino (BSA) di 1% in PBS di 10mm a pH 7.4.</li>
		<li>Pipetta 2 µ l della soluzione di BSA 1% su ingresso e 2 µ l di acqua distillata all'uscita del canale. Incubare il chip a 25 ° C per 1 h in un contenitore chiuso. Rimuovere i reagenti in eccesso e asciugare il canale come descritto al punto 2.1.4.</li>
	</ol></li> <li>I oligos di incubazione di DNA etichettati con biotina e 6-FAM.
	<ol><li>Preparare diverse concentrazioni (0,001-5 µM) della soluzione di DNA in 10mm PBS a pH 7.4.</li>
		<li>Erogare 2 µ l di una concentrazione della soluzione del DNA in ingresso e 2 µ l di acqua deionizzata sulla presa. Incubare il chip a 25 ° C per 15 min in un contenitore chiuso.</li>
		<li>Ripetere il punto 2.3.2 per le altre concentrazioni di DNA mediante biosensore ulteriori fiches.</li>
		<li>Rimuovere i reagenti in eccesso e asciugare il canale come descritto al punto 2.1.4.</li>
	</ol></li> <li>Immobilizzazione di GOx-etichettato anticorpi 6-FAM.
	<ol><li>Formulare una concentrazione di 5 µ g/mL di anticorpi di 6-FAM in 10mm PBS a pH 7.4.</li>
		<li>Introdurre 2 µ l della soluzione dell'anticorpo per l'ingresso e 2 µ l di acqua deionizzata per la presa del canale. Incubare gli anticorpi con etichettati a 25 ° C per 15 min in un contenitore chiuso. Rimuovere i reagenti in eccesso, come descritto al punto 2.1.4.</li>
	</ol></li></ol> 3. Amperometrico segnale rilevamento utilizzando la tecnica Stop-flow <ol><li>preparazione della soluzione di substrato per rilevazione elettrochimica.
	<ol><li>Formulare una soluzione di glucosio 40mm in PBS 0.1 M a pH 7.4 in acqua ultra-pura.</li>
		<li>Per il trattamento preliminare, preparare una soluzione di PBS 0.1 M a pH 7.4 in acqua ultra-pura.</li>
	</ol></li> <li>Trattamento preliminare degli elettrodi lavoro.
	<ol><li>Usare il supporto di chip su misura per consentire il facile posizionamento delle chip e una connessione elettrica e fluidica.</li>
		<li>Collegare elettricamente il biosensore per il potenziostato. Garantire il contatto fluidico del canale microfluidico per una pompa a siringa e il serbatoio del reagente utilizzando l'adapter su misura e tubi. Avviare il computer portatile che è collegato al potenziostato e avviare il controller di pompe siringa, controllo del flusso fluidic attraverso il chip.</li>
		<li>Avviare la pompa a siringa manualmente, con 0.1 M PBS ad una portata di 20 µ l/min. Presso l'elettrodo di lavoro contro l'elettrodo di riferimento su chip, applicare una tensione alternata di 0,8 e -0,05 V per 5 s ciascuno per 30 cicli. In seguito, si ossidano l'elettrodo di lavoro applicando una tensione di 0,8 V per 60 s.</li>
	</ol></li> <li>Della lettura di dosaggio usando la tecnica stop-flow.
	<ol><li>Per avviare la lettura del segnale di test, attendere il segnale di corrente misurato si stabilizzi. Arrestare la pompa a siringa e passare il reagente da 0.1 M PBS per la soluzione di glucosio di 40 mM e avviare il software presso il controllore della pompa siringa; fermerà automaticamente il flusso per 1, 2 o 5 min e quindi riavvia nuovamente il flusso. Osservare il picco di corrente risultante. 
		Nota: Per l'analisi dei dati, il picco di corrente o la carica del picco può essere considerata, come descritto nel modello di una lettura del segnale elettrochimico ( Figura 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo presentato qui per la realizzazione di un biosensore elettrochimico di microfluidica consente lo sviluppo di una piattaforma di basso costo, compatta e facile da usare per la rilevazione di biomolecole. A seconda del dosaggio utilizzato in seguito il biosensore, diversi biomarcatori diversi possono essere rilevati. Questo rende la piattaforma molto versatile e offre ampio accesso ai vari campi di applicazioni, dai test diagnostici standard (ad esempio, determinare la presenza di malattie specifiche...

Durante le due decadi scorse, applicazioni diagnostiche sono diventati Elementare per studi approfonditi sullo sviluppo della salute pubblica globale. Tradizionalmente, strumenti di diagnostica di laboratorio sono utilizzati per la rilevazione di malattie. Anche se hanno ancora un ruolo chiave nella diagnosi di malattie, point-of-care testing (POCT) eseguita vicino al paziente o dal paziente stesso è diventato più facile e più comune negli ultimi anni. Soprattutto in questi casi che richiedono un trattamento immediato, come infarto miocardico o monitoraggio del diabete, la conferma veloce di un'individuazione clinica è essenziale. Quindi, c'è un crescente bisogno di dispositivi POCT che può essere azionato da non esperti e che sono contemporaneamente in grado di eseguire precisi in vitro test diagnostici in un breve periodo di tempo1,2,3,4 .
Notevoli miglioramenti sono già stati raggiunti nel campo della POCT. Tuttavia, ci sono ancora molte sfide da superare5,6,7,8. Per una piattaforma POCT per essere lanciato con successo sul mercato ed essere competitivi con diagnostica di laboratorio, il dispositivo deve rigorosamente rispettare i seguenti requisiti: (i) fornire risultati precisi e quantitativa che siano coerenti con laboratorio Risultati; (ii) avere breve esempio di risultato volte, consentendo il trattamento immediato del paziente; (iii) offrono la gestione semplice e facile, anche se operati da inesperte e richiedono l'intervento dell'utente ridotta a icona; e (iv) è composto da un'unità di sensori a basso costo progettata per applicazioni monouso. Inoltre, privo di attrezzatura diagnostica è favorevoli, soprattutto in ambienti poveri di risorse3,4,6.
A causa di questi requisiti severi, solo due sistemi POCT basate sulla rilevazione elettrochimica (ad es., strisce reattive per glicemia) e il test immunologici di flusso laterale (ad es., prove di gravidanza domestiche) sono stati lanciati con successo sul mercato così lontano. Tuttavia, entrambi i sistemi soffrono di svantaggi quali la riduzione delle prestazioni (cioè, monitoraggio della glicemia ha risultati di prova inaccurati e flusso laterale saggi forniscono solo risultati di misurazione qualitativa (positiva o negativa))4, 6. Questi inconvenienti dei sistemi convenzionali di POCT hanno portato ad una crescente domanda di esplorare nuove tecnologie che offrono funzionalità di rilevamento veloce, basso costo e quantitativa nel punto di cura4,5.
Per soddisfare queste sfide dispositivi POCT, tecnologia DFR è stato recentemente impiegata per la fabbricazione di biosensori monouso e basso costo9,10,11,12, 13 , 14. rispetto ai materiali litografici morbidi e liquidi, ad esempio PDMS o SU-8, DFRs presentano molti vantaggi: (i) sono disponibili in una varietà di composizioni e spessori (da pochi micron ad alcuni millimetri); (ii) hanno una superficie molto ruvida, che facilita l'adesione ai vari materiali; (iii) uniformità di spessore eccellente caratteristica; (iv) offrono la fabbricazione a basso costo, facile e ad alta produttività per la produzione di massa; (v) sono facili da tagliare con vari strumenti di basso costo, come un semplice paio di forbici; e (vi) consentono la creazione di strutture tridimensionali, quali canali microfluidici, impilando strati multipli di DFR in cima a vicenda.
D'altra parte, DFRs in generale hanno una risoluzione relativamente povera rispetto i photoresists liquidi, che è principalmente causati dallo spessore del film e l'aumento della distanza tra la maschera e il DFR dovuto la pellicola protettiva, che consente inoltre di luce scattering. Ancora, per la produzione di biosensori di microfluidica integrata, DFRs sono particolarmente adatte per la produzione di massa di basso costo.
Pertanto, vi presentiamo in questo lavoro la fabbricazione e l'applicazione di un biosensore DFR-based microfluidic elettrochimica. Il protocollo dettagliato descrive ogni fase di produzione della piattaforma biosensore, l'immobilizzazione su chip di un saggio del modello basati sul DNA e sua lettura elettrochimica usando la tecnica stop-flow. Questa piattaforma universale consente il rilevamento di numerosi tipi di biomolecole, utilizzando tecnologie diverse analisi (ad es., genomica, cellomics e proteomica) o formati di dosaggio (ad es., competitivo, panino o diretta). Basato su una piattaforma di DFR, il nostro gruppo precedentemente dimostrato con successo la quantificazione rapida e sensibile di analiti vari, tra cui antibiotici13,15,16 (tetraciclina, pristinamicina e gli antibiotici ß-lattamici), troponina I17e18di sostanza P.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Material&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyralux</td><td>DuPont</td><td>AP8525R</td><td>Used as polyimide substrate</td></tr><tr><td>MA-N 1420</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MA-N1420</td><td>Lift-off resit to define the platinum depostion</td></tr><tr><td>Ma-D 533s</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MaD533S</td><td>Developer for MA-N1420</td></tr><tr><td>Platinum</td><td>-</td><td>-</td><td>Electrode and contact pad material</td></tr><tr><td>Ma-R 404s</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MaR404S</td><td>Remover for MA-N1420</td></tr><tr><td>SU-8 3005</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8-3005</td><td>Photoresist to define the electrode area and as insulation</td></tr><tr><td>1-methoxy-2-propanol acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108-65-6</td><td>Developer for SU-8 3005</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>VWR</td><td>8.18766.2500</td><td>Removing of the SU-8 developer</td></tr><tr><td>1020R</td><td>Ultron Systems Inc.</td><td>1020R</td><td>UV sensitive adhesive tape for protection of contact pads</td></tr><tr><td>Arguna S</td><td>Degussa</td><td>1935</td><td>For Silver depostion on reference electrode</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Methrom</td><td>62308.020</td><td>For chloridation of the silver reference electrode</td></tr><tr><td>Pyralux</td><td>DuPont</td><td>PC1025</td><td>Dry film photoresist</td></tr><tr><td>Sodium carbonat</td><td>Fluka</td><td>71352</td><td>Developer for Pyralux PC1025</td></tr><tr><td>Hydrogen chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30720</td><td>To top the development of the DFR</td></tr><tr><td>Teflon AF 1600</td><td>DuPont</td><td>AF1600</td><td>For employing the stopping barrier</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PA104</td><td>Mega Electronics</td><td>-</td><td>Bubble etch tank</td></tr><tr><td>FED 53</td><td>Binder</td><td>9010-0018</td><td>Oven</td></tr><tr><td>SPIN150</td><td>APT</td><td>-</td><td>Spin coater</td></tr><tr><td>Pr&amp;auml;zitherm</td><td>Harry Gestigkeit GmbH</td><td>PZ 28-2</td><td>Hot plate</td></tr><tr><td>Hellas</td><td>Bungard Elektronik</td><td>40000</td><td>Exposure unit</td></tr><tr><td>Tetra30-LF-PC</td><td>Diener</td><td>-</td><td>Plasma unit</td></tr><tr><td>Univex 500</td><td>Leybold</td><td>-</td><td>Physical vapor deposition unit</td></tr><tr><td>Shaker S4</td><td>ELMI</td><td>-</td><td>Orbital shaker</td></tr><tr><td>Sonorex Super 10 P</td><td>Bandelin</td><td>783</td><td>Sonic bath</td></tr><tr><td>6221 DC and AC</td><td>Keithley</td><td>-</td><td>Current source</td></tr><tr><td>HRL 350</td><td>Ozatec</td><td>-</td><td>Laminator unit</td></tr><tr><td>Vaccum pen</td><td>EFD</td><td>-</td><td>Vacuum pen</td></tr></tbody></table>

dry film photoresist-based electrochemical microfluidic biosensor platform: device fabrication, on-chip assay preparation, and system operation

Negli ultimi anni, la diagnostica di biomarcatore è diventato uno strumento indispensabile per la diagnosi della malattia umana, soprattutto per la diagnostica point-of-care. Una piattaforma facile da usare e a basso costo sensore altamente è voluta per misurare vari tipi di analiti (ad es., biomarcatori, ormoni e farmaci) quantitativamente e in particolare. Per questo motivo, film secco photoresist tecnologia - abilitazione a buon mercato, fabbricazione di alto-rendimento e facile - utilizzata per fabbricare il biosensore microfluidici presentato qui. A seconda l'analisi biologica utilizzata in seguito, la piattaforma versatile è in grado di rilevare vari tipi di biomolecole. Per la fabbricazione del dispositivo, elettrodi di platino sono strutturati su una lamina flessibile poliimmide (PI) nel passaggio processo solo pulito. La lamina di PI funge da substrato per gli elettrodi, che sono isolati con un photoresist a base epossidica. Il canale di microfluidica viene generato successivamente dallo sviluppo di laminazione di fogli di photoresist (DFR) di film secco sul wafer PI. Utilizzando una barriera idrofoba arresto nel canale, il canale è suddiviso in due aree specifiche: una sezione di immobilizzazione per l'analisi enzima-collegata e una cella di misura elettrochimica per la lettura del segnale amperometrico.
L'immobilizzazione di analisi biologica su chip viene eseguita per l'adsorbimento di biomolecole alla superficie del canale. L'enzima ossidasi di glucosio è usato come un trasduttore per la generazione di segnale elettrochimico. In presenza di substrato, glucosio, perossido di idrogeno è prodotto, che è stata rilevata all'elettrodo di lavoro platino. La tecnica stop-flow è applicata per ottenere amplificazione del segnale con rilevamento rapido. Biomolecole differenti può essere misurata quantitativamente mediante il sistema introdotto microfluidica, dà un'indicazione dei vari tipi di malattie, o, per quanto riguarda farmaci terapeutici monitoraggio, facilitando una terapia personalizzata.

Progettazione e fabbricazione della piattaforma microfluidica biosensore:
La fabbricazione dei chip microfluidici biosensore è realizzata a livello di wafer da tecniche fotolitografiche standard impiegando strati multipli di DFR. Questa strategia di fabbricazione si basa sulla laminazione degli strati sviluppati di DFRs su un substrato di platino-fantasia di PI, formando i canali microfluidici. Un breve riassunto raffiguranti le f...

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Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Film secco basati su Photoresist biosensore elettrochimico Microfluidic Platform: Fabbricazione di dispositivi, saggio su chip preparazione e funzionamento del sistema

Una piattaforma di biosensore microfluidica è stata progettata e fabbricato con tecnologia photoresist film asciutto low-cost per la quantificazione rapida e sensibile di vari analiti. Questo sistema monouso consente la lettura elettrochimica di on-chip-immobilizzata analisi enzima-collegata mediante la tecnica della stop-flow.

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

dry-film-photoresist-based-electrochemical-microfluidic-biosensor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.7K Views.  University of Freiburg. Una piattaforma di biosensore microfluidica è stata progettata e fabbricato con tecnologia photoresist film asciutto low-cost per la quantificazione rapida e sensibile di vari analiti. Questo sistema monouso consente la lettura elettrochimica di on-chip-immobilizzata analisi enzima-collegata mediante la tecnica della stop-flow.

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Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Methods for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over orientation and immobilization density are highly desirable for biosensor and microarray applications. In this Study, we use a highly efficient covalent bioorthogonal [4+2] cycloaddition reaction between trans-cyclooctene (TCO) and 1,2,4,5-tetrazine (Tz) to enable the microfluidic immobilization of TCO/Tz-derivatized molecules. We monitor the process in real-time under continuous flow conditions using surface plasmon resonance (SPR). To enable reversible immobilization and extend the experimental range of the sensor surface, we combine a non-covalent antigen-antibody capture component with the cycloaddition reaction. By alternately presenting TCO or Tz moieties to the sensor surface, multiple capture-cycloaddition processes are now possible on one sensor surface for on-chip assembly and interaction studies of a variety of multi-component structures. We illustrate this method with two different immobilization experiments on a biosensor chip; a small molecule, AP1497 that binds FK506-binding protein 12 (FKBP12); and the same small molecule as part of an immobilized and in situ-functionalized nanoparticle.

We present a method for rapid, reversible immobilization of small molecules and functionalized nanoparticle assemblies for Surface Plasmon Resonance (SPR) studies, using sequential on-chip bioorthogonal cycloaddition chemistry and antibody-antigen capture.

Microfluidic On-chip Capture-cicloaddizione Reazione di immobilizzare reversibilmente piccole molecole o strutture multi-componenti per applicazioni Biosensor

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

Ricerca

Chimica

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme goccia microfluidica

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Bioingegneria

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment 1,2 . These materials are desirable because they possess highly controllable dimensional and material characteristics, are biocompatible and promote cell adhesion, can be modified through topographic patterning or by chemically altering the surface, and can be used as a depot for biologically active molecules for drug delivery related applications 3-8 . In addition, silk films are relatively straightforward to custom design, can be designed to dissolve within minutes or degrade over years in vitro or in vivo, and are produce with the added benefit of being transparent in nature and therefore highly suitable for imaging applications 9-13. The culture system methodology presented here represents a scalable approach for rapid assessments of cell-silk film surface interactions. Of particular interest is the use of surface patterned silk films to study differences in cell proliferation and responses of cells for alignment 12,14 . The seeded cultures were cultured on both micro-patterned and flat silk film substrates, and then assessed through time-lapse phase-contrast imaging, scanning electron microscopy, and biochemical assessment of metabolic activity and nucleic acid content. In summary, the silk film in vitro culture system offers a customizable experimental setup suitable to the study of cell-surface interactions on a biomaterial substrate, which can then be optimized and then translated to in vivo models. Observations using the culture system presented here are currently being used to aid in applications ranging from basic cell interactions to medical device design, and thus are relevant to a broad range of biomedical fields.

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk films are a novel class of biomaterials readily customizable for an array of biomedical applications. The presented silk film culture system is highly adaptable to a variety of in vitro analyses. This system represents a biomaterial design platform offering in vitro optimization before direct translation to in vivo models.

Seta Film per la cultura del sistema In vitro Analisi e Progettazione Biomaterial

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Un chip microfluidica per la Versatile analisi chimica di singole cellule

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Un Biochip elettrochimica Microfluidic-based per la libera-Label Ibridazione DNA Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

Microfluidica digitale per trattamento automatizzato di proteomica

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Biologia

Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation

For the successful implementation of microfluidic reaction systems, such as PCR and electrophoresis, the movement of small liquid volumes is essential. In conventional lab-on-a-chip-platforms, solvents and samples are passed through defined microfluidic channels with complex flow control installations. The droplet actuation platform presented here is a promising alternative. With it, it is possible to move a liquid drop (microreactor) on a planar surface of a reaction platform (lab-in-a-drop). The actuation of microreactors on the hydrophobic surface of the platform is based on the use of magnetic forces acting on the outer shell of the liquid drops which is made of a thin layer of superhydrophobic magnetite particles. The hydrophobic surface of the platform is needed to avoid any contact between the liquid core and the surface to allow a smooth movement of the microreactor. On the platform, one or more microreactors with volumes of 10 &#181;L can be positioned and moved simultaneously. The platform itself consists of a 3 x 3 matrix of electrical double coils which accommodate either neodymium or iron cores. The magnetic field gradients are automatically controlled. By variation of the magnetic field gradients, the microreactors' magnetic hydrophobic shell can be manipulated automatically to move the microreactor or open the shell reversibly. Reactions of substrates and corresponding enzymes can be initiated by merging the microreactors or bringing them into contact with surface immobilized catalysts.

Lab-in-a-drop reaction systems allow the versatile implementation of complex reactions in a microfluidic scale. An automated actuation platform consisting of a 3 x 3 matrix of electromagnetic coils was developed and successfully used to merge two 10 &#181;L microreactors and thereby initiate an enzymatic reaction in the resulting liquid marbles.

Acquose goccioline utilizzate come microreattori enzimatica e loro attuazione elettromagnetica

For the successful implementation of microfluidic reaction systems, such as PCR and electrophoresis, the movement of small liquid volumes is essential. In ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

Piattaforma microfluidica con multiplex di rilevamento elettronico per spaziale monitoraggio di particelle

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits the dielectric properties of thin insulator films to enhance the charge density and hence boost the electrowetting effect. The presence of charges results in an electrically induced spreading of the droplet which permits purposeful manipulation across a hydrophobic surface. Here, we demonstrate EWOD-based protocol for sample processing and detection of four categories of antigens, using an automated surface actuation platform, via two variations of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) methods. The ELISA is performed on magnetic beads with immobilized primary antibodies which can be selected to target a specific antigen. An antibody conjugated to HRP binds to the antigen and is mixed with H2O2/Luminol for quantification of the captured pathogens. Assay completion times of between 6 and 10 min were achieved, whilst minuscule volumes of reagents were utilized.

Electrowetting-based digital microfluidic is a technique that utilizes a voltage-driven change in the apparent contact angle of a microliter-volume droplet to facilitate its manipulation. Combining this with functionalized magnetic beads enables the integration of multiple laboratory unit operations for sample preparation and identification of pathogens using Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Piattaforma di microfluidica digitale basata su Electrowetting per l'analisi automatizzata di Immunosorbent legata all'enzima

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

Mechano-Node-Pore Sensing: A Rapid, Label-Free Platform for Multi-Parameter Single-Cell Viscoelastic Measurements

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer metastasis. Conventional methods for measuring these properties, such as atomic force microscopy (AFM) and micropipette aspiration (MA), capture rich information, reflecting a cell's full viscoelastic response; however, these methods are limited by very low throughput. High-throughput approaches, such as real-time deformability cytometry (RT-DC), can only measure limited mechanical information, as they are often restricted to single-parameter readouts that only reflect a cell's elastic properties. In contrast to these methods, mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) is a flexible, label-free microfluidic platform that bridges the gap in achieving multi-parameter viscoelastic measurements of a cell with moderate throughput. A direct current (DC) measurement is used to monitor cells as they transit a microfluidic channel, tracking their size and velocity before, during, and after they are forced through a narrow constriction. This information (i.e., size and velocity) is used to quantify each cell's transverse deformation, resistance to deformation, and recovery from deformation. In general, this electronics-based microfluidic platform provides multiple viscoelastic cell properties, and thus a more complete picture of a cell's mechanical state. Because it requires minimal sample preparation, utilizes a straightforward electronic measurement (in contrast to a high-speed camera), and takes advantage of standard soft lithography fabrication, the implementation of this platform is simple, accessible, and adaptable to downstream analysis. This platform's flexibility, utility, and sensitivity have provided unique mechanical information on a diverse range of cells, with the potential for many more applications in basic science and clinical diagnostics.

Presented here is a method to mechanically phenotype single cells using an electronics-based microfluidic platform called mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). This platform maintains moderate throughput of 1-10 cells/s while measuring both the elastic and viscous biophysical properties of cells.

Rilevamento meccano-nodo-pore: una piattaforma rapida e senza etichette per misure viscoelastiche monocellulari multiparametriche

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer ...

Film secco basati su Photoresist biosensore elettrochimico Microfluidic Platform: Fabbricazione di dispositivi, saggio su chip preparazione e funzionamento del sistema

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