Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.

1. Proteinproben und Buffer Vorbereitung <ol><li> Probenvorbereitung: Reinigung der Proteine ​​von Interesse und sicherzustellen, dass alle Aggregate entfernt werden, durch Injizieren des Proteins vor dem Experiment auf eine Gelfiltrationssäule oder durch Ultrazentrifugation (üblicherweise 10 Minuten bei 100.000 xg genügt). HINWEIS: Obwohl wünschenswert, hochreinen Proteinpräparate sind kein Muss. SPR wurde erfolgreich mit weniger-als-perfekte Reinigungen und sogar mit Gesamtextrakt 8,9 verwendet. </li><li> Buffer Zubereitung: <ol><li> Bereiten des Puffers des Experiments (als &quot;Laufpuffer&quot; oder RB). Für das hier beschriebene Protokoll verwendet 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl und 0,05% (w / v) DDM (n-Dodecyl β-D-maltosid). Denken Sie daran, dass die Wahl der Pufferzusammensetzung kann leicht nach dem untersuchten System geändert werden. </li><li> Filter alle Puffer und Proteinproben mit 0,22 um-Filter. Vergewissern Sie sich vorher, dass die Filter Protein-kompatibel. Im allgemeinen enthalten kurzem vermarktet SPR Plattformen einen Inline-de-gasser; wenn dies nicht der Fall ist, de-Gas die Puffer vor der Verwendung. </li><li> Dialyse über Nacht in verdünnter oder die Proben vor dem RB-Puffer zu Fehlanpassungen zu vermeiden. Dialyse (oder jede andere Methode der Pufferaustausch) empfiehlt sich insbesondere bei der Verwendung von Chemikalien von hoher Viskosität (zum Beispiel Saccharose, Glycerin, DMSO). Vor dem Anschluss des RB-Flasche zum Pumpeneinlaß beiseite stellen 10 ml des RB in einem separaten Röhrchen. </li></ol></li><li> Konzentrierten Ligand Lager in RB auf eine Endkonzentration von ~ 20 &amp; mgr; g / ml. Als Faustregel gilt, für eine stabile Liganden Immobilisierung nutzen niedrigen Ligandenkonzentrationen mit mehr Injektionen bei niedrigen Strömungs, im Gegensatz zu hohen Konzentrationen, hohe Strömungs und kürzere Injektionen. </li><li> Verdünne den Analyten in der RB auf die gewünschte Konzentration. In der Regel testen die Konzentrationsbereich für ein System von unbekannten Affinität von 10 um bis 10 nM in zehnfacher Verdünnung. Beginnen Sie immermit den niedrigeren Konzentrationen ersten. </li></ol> 2. Sensor Chip <ol><li> Chip-Auswahl: Mit einem Nitrilotriessigsäure (NTA) gekoppelt Chip geeignet für die Aufnahme von Proteinen mit einem Oligo-Histidin-Tag. </li><li> Chip-Nutzung: <ol><li> Bei Verwendung einer neuen Chip, nehmen Sie den Chip aus dem Mantel, spülen Sie vorsichtig mit doppelt destilliertem Wasser (DDW), trocknen sorgfältig verbleibenden Flüssigkeiten mit empfindlichen Scheibenwischer, und sicherstellen, dass die Goldschichtoberfläche nicht zu berühren. Setzen Sie den Chip in die Scheide in der richtigen Ausrichtung (die Einfügung ist glatt, wenn der Chip richtig platziert ist). </li><li> Bei Wiederverwendung einen Chip, nehmen Sie die gespeicherten Chip aus dem Puffer, gründlich mit DDW und trocken leise, wie oben angegeben, und legen Sie in die ursprüngliche Hülle. HINWEIS: Die Akkumulation unspezifischer Junk Materials auf dem Chip kann seine Lebensfähigkeit beeinträchtigen. Dies kann durch den Vergleich der EVU vor der Liganden Immobilisierung und nach Abstreifen überwacht werden. Obwohl viele Messungen könnengetan mit der gleichen NiNTA Chip, die Frage der seine Langlebigkeit ist kein &#39;eindeutig&#39; und variiert stark zwischen verschiedenen Chips. </li></ol></li><li> Chip-Docking: Öffnen Sie den Sensorchip Tür und setzen Sie den Chip in der Scheide. Bei Verwendung einer neuen Chip, um die Seriennummer Eingang des Chips Verwendungsdatensatz zu halten. Schließen Sie die Tür und drücken Sie &quot;Dock-Chip&quot;. </li></ol> 3. Temperatureinstellungen <ol><li> Gesetzt den Chip Zelltemperatur auf 25 ° C (oder der bevorzugten Experiment Temperatur). </li><li> Optional: Legen Sie die Proben Raum auf 7 ° C, um die Proteine ​​während des gesamten Experiments stabil zu halten. </li></ol> 4. Lösungen für die Be-und Abisolieren Bereiten Sie die folgenden Lösungen zum Laden und Abziehen: 0,5 mM NiCl 2 in RB, 350 mM EDTA in RB (das Waschmittel zu EDTA-Lösung bis zu einer Endkonzentration wie in RB), 0,25% SDS in H 2 O und 100 mM HCl in H 2 O. Bei der Verwendung von Mikrozentrifugen Badewannees und nicht bezeichnet Rohre SPR, vergessen Sie nicht, schneiden Sie die Kappen der Rohre. 5. Minister die SPR Instrument mit RB 6. Starten Sie einen neuen Run <ol><li> Die Durchflussrate, die während des Experiments verwendet werden. Um die hier beschriebenen Ergebnisse zu erzielen setzen die Strömung auf 50 ml / min. HINWEIS: Dieser Parameter kann während des Experiments geändert werden. </li><li> Definieren Sie die Fließwege und Bezugs Subtraktion. Um die hier beschriebenen setzen die Pfade Fc = 1 und Fc = 2, Subtraktion Fc = 2-1 Ergebnisse zu erzielen. HINWEIS: Das Programm wird in Echtzeit angezeigt werden die Subtraktion der beiden Messzellen. Beachten Sie, dass dieser Parameter nicht während des Experiments geändert werden. </li><li> Wählen Sie den geeigneten Probenträger (kann das Probenvolumen Verbrauch beeinflussen). </li><li> Speichern Sie die Ergebnisdatei. </li></ol> 7. Experiment Cycles Jeder Versuch wird von Zyklen besteht, halten eine klare Aufzeichnung der Injektionen in ea getanch-Zyklus, und trennen Sie die Liganden &#39;Laden, leere Injektion des Puffers und den Analyten Injektion in verschiedenen Zyklen. <ol><li> Zyklus 1: Chip Vorbereitung und Nickelbeladung <ol><li> Stellen Sie sicher, der Fluss und Wegen eingestellt werden gemäß Schritt 6.1 und 6.2. </li><li> Injizieren Sie 350 mM EDTA für 1 min abzuwaschen Reste. </li><li> Stellen Strom bis 10 ml / min. </li><li> Injizieren 0,5 mM NiCl 2 für 2 min. HINWEIS: Nun ist die Chip Harz durch Nickelionen beschichtet. </li></ol></li><li> Zyklus 2: Liganden Immobilisierung <ol><li> Set Flow bis 15 ml / min, Flusspfad Fc = 2. </li><li> Injizieren Ligand A bis zum Erreichen RU Werte 10-20fache seines Molekulargewichts sind. Legen Sie zum Beispiel einen Liganden von 50 kDa bis 500-1.000 EVU. Halten Sie eine Aufzeichnung des RU-Wert erreicht. </li><li> Set Flow bis 15 ml / min, Flusspfad Fc = 1. </li><li> Injizieren Ligand B (Kontrolle) bis zu der gleichen RU Wert wie der Ligand A. Überwachen Sie die Subtraktion Sensogramm (Fc = 2-1) Online, um die Kontrolle derInjektionslänge. </li><li> Set Strom auf 50 ml / min, Flusspfad Fc = 1 und Fc = 2, waschen Sie das System für 5-20 Minuten, bis die Grundlinie (Fc = 2-1) stabilisiert. </li></ol></li><li> Zyklus 3: Leer Injektion. Diese Injektion wird für leere Subtraktion dienen somit alle Komponenten, die mit dem Analyten injiziert werden, mit Ausnahme des Analyten selbst. HINWEIS: Injektionslänge kann in Abhängigkeit von der Zeit bis zum Gleichgewichtszustand (Signal Plateaus) erreichen dauert variieren. <ol><li> Set Flow bis 15 ml / min, Flusspfad Fc = 1 und Fc = 2, Fc = 2-1 Subtraktion. </li><li> Legen Sie die &#39;warten&#39; Befehl für 30 Sekunden (im Folgenden als &quot;warten&quot; genannt) (eine stabile Basislinie haben). </li><li> Injizieren Sie 15 Sek RB. HINWEIS: Die Dauer der Einspritzung zwischen verschiedenen Systemen variieren, abhängig von ihrer Vorgleichgewicht kinetischen Konstanten (meist k a). </li><li> Warten 120-600 sec, um die Dissoziationsphase aufzuzeichnen. HINWEIS: Die Länge dieser Schritt ist je nach der <em&gt; k d: Je langsamer die Dissoziation der längere dieser Schritt sein muss. Für sehr langsam dissoziierende Komplexe (k d &lt;10 -4 s -1), warten Sie 10-15 Minuten und gehen dann an die Oberfläche Regeneration (siehe später). </li></ol></li><li> Zyklus 4: Analyt Injektion <ol><li> Copy / die genauen Bedingungen in der Referenzeinspritz (Zyklus 3), so dass diese zwei Injektionen kann später abgezogen werden verwendet, einfügen. Ändern Sie die Position der Steckplätze im Rack von dem Halten der Kontroll-Lösung, eine, die den Analyten-Lösung hält. Wählen Sie eine Konzentration, die über dem erwarteten K D leicht ist. Wenn keine Vorkenntnisse vorhanden ist, wählen Sie 1 uM als guter Ausgangspunkt. </li></ol></li><li> Zyklus 5: Pufferinjektion <ol><li> Taktgeber 3. </li></ol></li><li> Zyklus 6: Analyt Injektion <ol><li> Taktgeber 4. </li></ol></li><li> Zyklus 7: Chip abzustreifen <ol><li> Stellen Strom auf 50 ml / min. &lt;/ Li&gt; <li> Injizieren 350 mM EDTA für 1 min. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal. Verwenden Sie nicht eine einzige Injektion von 3 min, da dies die Chip beschädigen. </li><li> Injizieren von 0,25% SDS für 1 min. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal. Verwenden Sie nicht eine einzige Injektion von 3 min, da dies die Chip beschädigen. </li><li> Falls der Ausgangspegel nicht erreicht ist, zu injizieren 100 mM HCl für 1 min als zusätzliches Stripping-Schritt. </li><li> Legen Sie die &quot;End-Run&quot; Befehl, den Standby-Modus schaltet. </li></ol></li><li> Chip-Speicher <ol><li> Docken Sie den Sensorchip und nehmen Sie es aus dem Gerät. </li><li> Nehmen Sie den Sensor heraus aus der Scheide, berühren nicht die Oberfläche gründlich mit DDW, und in einen 50-ml-Röhrchen mit RB. Lagerung bei 4 ° C. </li></ol></li></ol> 8. Datenanalyse mit Ausgewiesene Auswertesoftware <ol><li> Führen Sie folgende Schritte, um die von SPR vor Ableitung der kinetischen Parameter erhalten Rohdaten verarbeiten. <ol><li> Mit der Auswertesoftware, offendie Ergebnisdatei, wählen Zyklen 3-6 Fc = 2-1 (Referenz abgezogen Daten). </li><li> Achsenverschiebung: <ol><li> Display-Zyklen 3-6. </li><li> Null der Y-Achsen-Wert von der Grundlinie (der ersten 30 sec Wartezeit bei jedem Zyklus), um alle vier Kurven. </li></ol></li><li> Richten Sie die X-Achse der vier Kurven. Wählen ausgeprägten Funktionen (zB Spikes von Injektions Start oder das Ende), um perfekt richten Sie die vier Kurven entlang der X-Achse. Stellen Sie die Zeit des Beginns der Analyt (oder Steuerspeicher) auf Null gesetzt. </li></ol></li><li> Referenz Subtraktion <ol><li> Subtrahieren Sie die Hintergrundantwort durch Subtraktion Kurve der Zyklus 3 von Kurve der Zyklus 4 und Kurve des Zyklus 5 von Kurve Zyklus 6. Verwenden Sie die Kurve Subtraktion, die in der Y-Achse zu finden ist verschiebt Menü. HINWEIS: Es ist wichtig, diesen Schritt, da es keine nicht-spezifischen Komponenten (die nicht mit dem Analyten), die die Oberfläche Brechungsindex beeinflusst haben könnten annulliert durchzuführen. <ol><li> Speichern Sie die abgezogen Kurven in ter Blatt des Projekts unter einem anderen Namen. </li></ol></li><li> Beziehen sich auf diese Kurven als &quot;doppelt abgezogen Kurven&quot;: die erste Subtraktion ist 2-1 Subtraktion beider Einspritzungen durchgeführt wird, und das zweite ist die Subtraktion einer Kurve von einem anderen. HINWEIS: Eine solche Doppel Referenzierung ist der Goldstandard in der SPR-Experimente. </li><li> Überlagern die Kurven subtrahiert, indem Achsenverschiebung, wie vorstehend erläutert. </li></ol></li><li> Bestimmung der Kinetik-Konstanten und Modellanpassung <ol><li> Die Durchführung einer kinetischen Experiment <ol><li> Spritzen Sie eine Reihe von 6-7 Analytkonzentrationen, um eine zuverlässige Daten zur kinetischen Konstanten Bestimmung haben. Wählen Analytkonzentrationen von 10-fach über den 10-fach unter der geschätzten K D, in 2-3-fach-Verdünnungen. Fügen Sie die &quot;Null&quot; Konzentration, später für Doppelreferenz Subtraktion verwendet (siehe oben). Führen Injektionen in dreifacher Ausführung und in zufälliger Reihenfolge. </li><li> Ausrichtenund subtrahieren Sie alle Kurven in Bezug auf die Y-Achse und X-Achse, bevor Modellanpassung. </li></ol></li><li> Modellanpassung <ol><li> Wählen Sie einen geeigneten Analyseprogramm. HINWEIS: Die meisten verfügbaren passend Programme bieten mehrere Modelle, die für die Montage und die Bestimmung der kinetischen Konstanten angewendet werden können. </li><li> Anwenden das einfachste Modell (Langmuir) unter der Annahme einer reversiblen 1: 1-Wechselwirkung zwischen dem Analyten und den Liganden für den Einbau. Es sei denn, überzeugende Daten aus anderen experimentellen Methoden für die Existenz einer komplexen Interaktion, immer den einfachen Langmuir-Modell. </li></ol></li></ol></li></ol>

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All authors declare that they have no competing financial interests.

SPR ist ein hochempfindliches Verfahren, um molekulare Wechselwirkungen zu untersuchen, und ist oft der einzige Ansatz, der Echtzeit-Überwachung von vorübergehenden (noch wichtiger) Wechselwirkungen liefert. Ein Beispiel ist die vorübergehende Wechselwirkung hierin dargestellt, die nicht durch ein anderes Verfahren (Pull-down-Assays, Liposomen Sedimentation Assays 6) festgestellt werden konnte. Darüber hinaus, während andere Verfahren sind begrenzt, um Messungen Gleichgewicht (ob quantitativ oder qualita...

Protein-Protein-Interaktionen (PPI); die Bildung und Dissoziation von Proteinkomplexen, sind Schlüsselereignisse in vielen biologischen Prozessen (zum Beispiel der Replikation, Transkription, Translation, Signalisierung, Zell-Zell-Kommunikation). Semi-quantitative Studien der PPI sind oft unter Verwendung von Pull-Down-oder Immunpräzipitation Experimente. Jedoch sind diese (und ähnliche) Techniken im Bereich von Affinitäten, die gemessen werden kann (niedrigen mikromolaren und höhere Affinität) durch die Waschschritte, die bei einem solchen Verfahren sind beschränkt. Solche &quot;Endpunkt&quot; Techniken nicht identifizieren kann vorübergehend oder geringe Affinität Wechselwirkungen, die häufig von großem biologischen Konsequenzen sind. Zusätzlich wird die zeitliche Auflösung solcher Ansätze äußerst beschränkt, üblicherweise um Größenordnungen langsamer als die Raten der Reaktion. SPR überwindet diese Mängel durch seine erhöhte Sensibilität und überlegene Zeitauflösung 1,2. SPR ist eine markierungsfreie Methode, und als solchemolekulare Wechselwirkung gemessen werden kann (solange die Massenänderung festgestellt werden kann). Neben PPI wurde extensiv verwendet, um Protein-Ligand, Protein-Arzneistoff (oder kleines Molekül), Protein-DNA und Protein-RNA-Interaktionen 3-5 charakterisieren. Die Ergebnisse werden aufgezeichnet und in Echtzeit, was eine schnelle Abänderung der Versuchsbedingungen und Versuchs flexible Bauweise ermöglicht. Das physikalische Prinzip hinter SPR basierte Instrumente besteht in der Verwendung eines optischen Systems, das eine Änderung des Brechungsindex misst auf der Sensoroberfläche auf Masse ändert 2. Einer der Wechselwirkungspartner (hiernach Liganden) auf einer Polymermatrix-Chip und das zweite Molekül (nachstehend Analyt) wird über der Oberfläche floß immobilisiert. Analyt-Bindung an den Liganden verändert die Masse auf der Chipoberfläche. Diese Massenänderung ist direkt und proportional zu Änderungen des Brechungsindex der Oberfläche bezogen. Die Ergebnisse werden in Echtzeit aufgezeichnet undals Reaktionseinheiten (RU) als eine Funktion der Zeit dargestellt. Eine solche Handlung ist eine Sensogramm bezeichnet (zB Abbildung 1). Da SPR folgt die komplette zeitliche Verlauf der Wechselwirkung werden Vorgleichgewicht Geschwindigkeitskonstanten abgeleitet sind, zusätzlich zu den Affinitäten Gleichgewicht. Wie unten beschrieben, die Vor-Gleichgewichtsverhalten eines Systems hält viele Informationen und bietet eine ganz andere Perspektive als Gleichgewicht allein. Nachdem das System kalibriert ist, sind Versuche sehr schnell und benötigen nur geringe Mengen an Proteinmaterial (Mikrogramm Mengen Nanogramm). Sammeln des kompletten kinetischen Daten von einem gegebenen System kann in Tagen erreicht. Die hohe Empfindlichkeit von SPR-Messungen liefert, die nicht durch ein anderes Verfahren 6 sind möglich. Ist diese hohe Empfindlichkeit jedoch ein &quot;zweischneidiges Schwert&quot;, da es eine der Hauptquellen für falsch positive Daten sein. Jeder Faktor, der den Brechungsindex beeinflusst wird aufgezeichnet und auf der Sensogramm. Als solche apsprechende Kontrollen müssen genutzt werden, um falsch-positive zu beseitigen, und die Unterstützung von komplementären Ansätzen wird dringend empfohlen. Abbildung 1 zeigt den Verlauf einer SPR-Experiment unter Verwendung einer NTA-beschichteten Sensorchip. Die Sensogramm in Tafel A zeigt die Injektion von der Nickelionen über die NTA-Matrix (unsubtrahierter Daten) und Platten BD die Daten anzeigen nach Abzug des aus der negativen Kontrollzell abgeleiteten Signals. Rote und blaue Pfeile zeigen Einspritzbeginn und das Ende auf. Immobilisieren des Liganden auf den Chip schrittweise verändert, bis die Masse Einspritzung beendet. Das nach Beendigung der Einspritzung von Ligand beobachtet stabiles Plateau spiegelt die stabile Assoziation des Liganden an der Oberfläche (1B, Zyklus 2). Sobald eine stabile Basislinie erreicht ist ein Puffer gegenüber dem Liganden und der Referenzzelle (1B, Zyklus 3) .Dieses Injektion dient als &quot;Blindkontrolle&quot; eingespritzt, und werdenwährend der Analyse abgezogen. Nach der Injektion werden kleinere Änderungen aufgezeichnet, was eine Strömung von Masse durch den Chip. Dann in einem separaten Kreislauf (Abbildung 1B, Zyklus 4), der Analyt eingespritzt wird; Die schrittweise Erhöhung der RU stellt Verband des Analyten an den Liganden. Die Bindungsstellen allmählich besetzt, bis ein Gleichgewicht erreicht wird. Sobald Einspritzung endet, ein Rückgang der EVU spiegelt Dissoziation des Komplexes. Aus solchen Sensogramme Pre-Gleichgewicht und Gleichgewicht Geschwindigkeitskonstanten abgeleitet werden können (siehe unten). Abbildung 1 zeigt eine transiente Interaktion zwischen dem Liganden und Analyten. Wenn die Interaktion ist stabiler, ist der Rückgang der EVU-Ebene langsamer, was auf einen geringeren k d. Hier beschreiben wir eine SPR-Experiment am Charakterisieren der Wechselwirkung zwischen einem Membrantransporter (solubilisiertem) und seine funktionellen Partner seinen zugehörigen Substrat-Bindungsprotein 6,7 gerichtet. Die gewählte model-System ist ein ATP-Bindungs-Cassette (ABC) Transporter, ModBC-A von Archeaglobus fulgidus. Dieses System wurde für die sehr gut reproduzierbare Ergebnisse &quot;on / off&quot; Raten ausgewählt, hohem Signal-Rausch-Verhältnis und klassisch. Darüber hinaus sind Homologen ABC-Transporter zur Verfügung als wichtige negative Kontrollen dienen. Der Transporter, ModBC (Ligand A) von der Membran mit Reinigungsmittel, gereinigt und auf den Chip immobilisiert extrahiert. Seine löslichen Interaktionspartner, ModA ist der Analyt. Als Negativkontrolle Ligand wird eine andere ABC-Transporter RbsBC verwendet (&quot;Ligand B&quot;).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="601">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biacore T200</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9750-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sensor Chip NTA&#160;</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">14100532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">BIAevaluation</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Biacore T200 Software&#160;</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Nickel chloride</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N6136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sodium tungstate dihydrate</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T2629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Bio-Lab LTD.</td>
			<td style="width:119px;">19030591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Trizma base</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:209px;">Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:209px;">n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside (DDM)</td>
			<td style="width:107px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Sodium dodecyl sulfate solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">05030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Kimwipes KIMTECH</td>
			<td style="width:107px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:107px;">GADOT</td>
			<td style="width:119px;">7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon (NY) Membrane Filter</td>
			<td style="width:107px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">25007--47------N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">ModBC ABC transporter</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">RbsBC ABC transporter</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">ModA Substrate Binding Protein</td>
			<td style="width:107px;">Lewinson lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time measurements of membrane protein:receptor interactions using surface plasmon resonance (spr)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

In dem hier beschriebenen System wird eine NiNTA Chip verwendet, um die His-markierte Membrantransporter 6,7 immobilisieren. Wobei ein Homodimer ist jedes Transporters doppelt markiert, die Verbesserung seiner Bindung zum NiNTA-Chip. Nach Nickelbeladung, Liganden A (der Transporter von Interesse) auf Fc = 2 immobilisiert, bis ~ 3500 RU (Protokoll Zyklus 2, 2A black label). Dann werden mit dem gleichen Strömungs und Einspritzdauer, Ligand B (Kontrollliganden) an Fc = 1 eingespritzt wird, zun?...

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Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Oberflächenplasmonresonanz (SPR) ist eine markierungsfreie Verfahren zur Detektion biomolekularer Wechselwirkungen in Echtzeit. Hierin wird ein Protokoll für ein Membranprotein: Rezeptor-Interaktion Experiment beschrieben, bei der Diskussion der Vor- und Nachteile der Technik.

Echtzeit-Messungen von Membranprotein: Rezeptor-Wechselwirkungen Mit Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

22.5K Aufrufe.  The Technion-Israel Institute of Technology.  Oberflächenplasmonresonanz (SPR) ist eine markierungsfreie Verfahren zur Detektion biomolekularer Wechselwirkungen in Echtzeit. Hierin wird ein Protokoll für ein Membranprotein: Rezeptor-Interaktion Experiment beschrieben, bei der Diskussion der Vor- und Nachteile der Technik. 

Serie: Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

Automated System für Single Molecule Fluorescence Messungen der Oberflächen-immobilisierten Biomoleküle

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Forschung

Biologie

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitative Real-Time PCR unter Verwendung der Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Profiling von Pre-micro RNAs und microRNAs mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Bestimmung genetischer Expressionsprofile in C. elegans Verwenden Microarray-und Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Echtzeit-Überwachung von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen mit Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

Avidität-basierte extrazelluläre Wechselwirkung Screening (AVEXIS) für die Erkennung von Scalable Low-Affinität extrazellulären Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

Real-time Analyse von Retinol Transport durch die Membran-Rezeptor von Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Echtzeit-Imaging von Plant Cell Oberflächen Dynamics mit variabler Winkel Epifluoreszenzmikroskopie

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Protokolle für Problematische Pflanze, Oomycete und Pilzproben

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...