Dieses Protokoll ist wichtig, weil es einfach durchzuführen und in Reichweite jedes Labors ist. Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung von HLA- oder MHC-Typ-I- oder Typ-II-Peptiden aus menschlichen oder Mausproben. Diese Methode kann wissenschaftliche Fragestellungen aus allen Forschungsbereichen des Immunsystems adressieren, sei es bei Krebs, Virologie oder Autoimmunerkrankungen.
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um für jeden zugänglich zu sein, der in einem Forschungslabor arbeitet. Folgen Sie einfach den Schritten. Beginnen Sie mit der Aktivierung der Sepharose-Cyanogenbromidperlen, indem Sie 80 Milligramm pro Probe wiegen und sie in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführen.
Fügen Sie fünf Milliliter Ein-Millimol-Salzsäure hinzu. Fünfmal auf und ab pipettieren, um die Rückgewinnung der getrockneten Kügelchen zu erleichtern, und dann das konische Rohr mit zusätzlichen 8,5 Millilitern Ein-Millimol-Salzsäure füllen. Drehen Sie die Perlen bei 20 U / min für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit einem Rotatorgerät.
Die Perlen bei 200x G für zwei Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand durch Ansaugen entfernen. Fügen Sie der Perlenpalette 500 Mikroliter Kupplungspuffer hinzu, übertragen Sie die Perlensuspension in ein neues Zwei-Milliliter-Zentrifugenrohr und legen Sie sie beiseite. Um die Antikörper an diese Kügelchen zu koppeln, fügen Sie zwei Milligramm des ausgewählten Antikörpers in ein neues, zwei Milliliter schweres Mikrozentrifugenröhrchen hinzu und addieren sie das Volumen mit einer Kopplungspufferlösung auf einen Milliliter, um eine Endkonzentration von zwei Milligramm pro Milliliter zu erhalten.
Übertragen Sie die zuvor hergestellte Perlenlösung und fügen Sie sie der Antikörperlösung hinzu. Drehen Sie dann das Mikrozentrifugenrohr bei 20 U / min für 120 Minuten mit einer Rotatorvorrichtung, zentrifugieren Sie die Perlen und entfernen Sie dann den Überstand wie zuvor beschrieben. Beginnen Sie nun mit dem Blockieren und Waschen der Kügelchen, indem Sie zuerst einen Milliliter 0,2-molares Glycin in das Mikrozentrifugenröhrchen mit den Antikörper-gekoppelten Kügelchen geben und mit 20 U / min für 60 Minuten bei Raumtemperatur mit einem Rotatorgerät rotieren.
Nach dem Zentrifugieren und Entfernen des Überstandes waschen Sie die Perlen mit einem Milliliter PBS, entfernen den Überstand durch Zentrifugation und lagern die Perlen in einem Milliliter PBS bei vier Grad Celsius bis zum Gebrauch. Um MHC-Peptide der Klasse I oder II zu isolieren, tauen Sie eine gefrorene Palette von 100 Millionen Zellen auf, indem Sie den Boden der Röhre mit einer Handfläche erwärmen. Fügen Sie 500 Mikroliter PBS zur Palette hinzu und pipettieren Sie auf und ab, bis die Suspension homogen ist.
Die Suspension wird in ein neues, zwei Milliliter schweres Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und ein gleiches Volumen Zelllysepuffer zugegeben. Drehen Sie mit 10 U / min für 60 Minuten bei vier Grad Celsius mit einer Rotatorvorrichtung. Zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 18.000x G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius mit Vollbremse und übertragen Sie den Überstand in ein neues, zwei Milliliter großes Mikrozentrifugenrohr.
Gewinnen Sie die Antikörper-gekoppelten Kügelchen durch Zentrifugation und Entfernen des Überstandes zurück. Übertragen Sie dann den Zelllysat-Überstand auf die Antikörper-gekoppelten Kügelchen und inkubieren Sie bei 10 U / min für 14 bis 18 Stunden über Nacht bei vier Grad Celsius mit einem Rotator-Gerät. Entfernen Sie am zweiten Tag den unteren Deckel der Polypropylensäule, legen Sie die Säule auf das Polypropylen-Säulengestell und installieren Sie einen leeren Behälter darunter, um den Durchfluss zu sammeln.
Spülen Sie nun die Polypropylensäule mit 10 Millilitern Puffer A ab und lassen Sie sie durch Schwerkraft abtropfen. Wenn die Fließgeschwindigkeit der flüssigen Elution zu langsam ist, schneiden Sie die untere Spitze der Polypropylensäule weiter ab. Messen und sammeln Sie das Gemisch aus Perlen und Lysat und übertragen Sie es in die Polypropylensäule.
Lassen Sie das flüssige Gemisch durch Schwerkraft eluieren. Optional können Sie 20 Mikroliter Aliquot für das Western Blotting sammeln und einfrieren. Waschen Sie nun die in der Polypropylensäule zurückgehaltenen Perlen, indem Sie 10 Milliliter Puffer A hinzufügen und durch Schwerkraft eluieren lassen.
Entfernen Sie die Polypropylensäule aus dem Rack und legen Sie sie auf die Oberseite eines neuen Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohrs, wobei Sie die Säule und das Rohr zusammen mit der Hand halten. Fügen Sie 300 Mikroliter 1% TFA zur Polypropylensäule hinzu und mischen Sie die Perlen, indem Sie fünfmal auf und ab gehen. Dann übertragen Sie das Eluat in ein neues, zwei Milliliter schweres Mikrozentrifugenröhrchen.
Um die MHC-Peptide zu entsalzen und zu eluieren, fügen Sie 200 Mikroliter Methanol auf die C-18-Säule und zentrifugieren Sie bei 1. 546x G für drei Minuten, um den Durchfluss zu verwerfen. Fügen Sie 200 Mikroliter 80% Acetonitril in 0,1% TFA auf die C-18-Säule hinzu und zentrifugieren Sie erneut, um den Durchfluss zu verwerfen. Fügen Sie dann 200 Mikroliter mit 0,1% TFA hinzu und verwerfen Sie den Durchfluss durch Zentrifugation.
Laden Sie schließlich 200 Mikroliter der MHC-Peptidkomplexe auf die C-18-Säule, verwerfen Sie den Durchfluss durch Zentrifugation und wiederholen Sie ihn, bis das gesamte Volumen geladen ist. Als nächstes fügen Sie 200 Mikroliter mit 0,1% TFA hinzu, zentrifugieren Sie, um den Durchfluss zu verwerfen, übertragen Sie die C-18-Säule in ein neues, zwei Milliliter schweres Mikrozentrifugenröhrchen und eluieren Sie MHC-Peptide, indem Sie 150 Mikroliter 28% Acetonitril in 0,1% TFA hinzufügen. Nach der Zentrifugation wird der Durchfluss in einem neuen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen aufgefangen.
Wiederholen Sie den Elutionsprozess zweimal für ein Gesamtvolumen von 450 Mikrolitern und frieren Sie bei minus 20 Grad Celsius ein, bis er von LC-MS-MS analysiert wird. Verwenden Sie diese gereinigten Peptide zur Identifizierung von MHC-Peptiden der Klassen I und II in einem Massenspektrometer. Die Bindungseffizienz von Kügelchen wurde durch eine signifikante Abnahme der Signalfärbeintensität von leichten und schweren Ketten veranschaulicht, wenn Perlen kovalent an die CNBr-Kügelchen gebunden sind, verglichen mit dem Antikörper vor der Kopplung.
Die Isolierung von MHC-Peptidkomplexen nach saurer Elution wurde durch das starke Nachweissignal der MHC-Peptidkomplexe mittels Schwerketten-Anti-HAL-ABC-Antikörpern bestätigt. Die intra- und interindividuelle Reproduzierbarkeit der Ergebnisse unter Verwendung des aktuellen Protokolls wurde ebenfalls geschätzt. Der durchschnittliche Variationskoeffizient für die Anzahl der peptide, die über drei verschiedene biologische Replikate nachgewiesen wurden, war klein, der zwischen 1,9 und 11% variierte. Die Identität der Peptide variierte jedoch erheblich, und der Anteil der Reproduzierbar nachgewiesenen Peptide über drei biologische Replikate reichte von 39% bis 63% Die erzeugten Heatmaps zeigten eine vorhergesagte MHC-Bindungsstärke der identifizierten Peptide.
Für die MHC-MHC-Peptide der Klassen I und II der Maus betrugen die prädikierten starken oder schwachen Bindemittel 89 bzw. 87%. Für humane HLA-Peptide der Klassen I und II betrugen die prädikierten starken oder schwachen Bindemittel 97 bzw. 70%. Die Peptidbindungsmotive der Maus und des Humanen für LHC-Peptide der Klassen I und II wurden ebenfalls erzeugt.
Vor der Optimierung dieses Protokolls war die Isolierung von murinen MHC-Peptiden der Klassen I und II recht schwieriger. Dieses optimierte Protokoll wird die Isolierung von murinen MHC-Klasse-I- und -II-Peptiden aus In-vivo-Mausmodellen erleichtern, die beispielsweise routinemäßig für die Validierung vieler verschiedener, krankheitsbezogener Studien verwendet werden.
