Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse R01-GM-098977 und R21-AI-098122 zu CBK und KEG unterstützt. RSS wurde zum Teil durch eine Luce Foundation Fellowship und zum Teil durch eine Thayer Innovation Program-Stipendium der Thayer School of Engineering unterstützt.

Vier Hauptaktivitäten umfassen die Peptid-MHC-II-Bindungsassay: 1-Bindung: Test-Peptide konkurrieren mit markierten Kontrollpeptide für Lösungsphase Bindung von löslichen MHC-II-Proteine. Die Bindung ist über einen weiten Bereich von Test-Peptid-Konzentrationen gemessen. 2-Aufnahme: Nach der Bindungsreaktion nähert Gleichgewicht befindet, Peptid-MHC-II-Komplexe erfasst und von ungebundenem Peptid-und Protein durch konformationsabhängiger Anerkennung mit einem immobilisierten Antikörper getrennt. 3-Detektion: Eingefangen Kontrollpeptid wird quantitativ unter Verwendung der zeitaufgelösten Fluoreszenz detektiert. 4-Analyse: Spektroskopische Daten verarbeitet, aufgezeichnet und analysiert, um eine dosisabhängige Bindungseigenschaften von Testpeptid und MHC-II-Proteine ​​zu bestimmen. Bei verschiedenen Schritten in dem nachstehend beschriebenen Verfahren ist die Verwendung eines Flüssigkeitshandhabungsroboter zu empfehlen, wenn eine verfügbar ist. Gerade in einer 384-Well-Format, automatische Dosierung und Verdünnung von Flüssigkeiten minimiert Benutzerfehler, führt zu mehrkonsistente wohl gut Volumen und liefert schmaler 95%-Konfidenzintervalle für die IC 50-Werte im Vergleich zur manuellen 96-Well-Assays (Daten nicht gezeigt). Wenn ein flüssiges Handhabungsroboters nicht verfügbar ist, die Schritte mit &quot;(Flüssigkeitshandhabungsroboter)&quot; anno kann von Hand erfolgen. Ebenso, wenn möglich, eine automatisierte Plattenwäscher, die mit der 384-Well-Format kompatibel ist, wird empfohlen. Diese standardisiert effektiv die Platte Waschprozess. Wenn eine Plattenwasch nicht verfügbar ist, die Schritte mit &quot;(Plattenwasch)&quot; kommentierte kann von Hand gemacht werden. 1. Bestreichen Sie die ELISA-Platte (Tag 1) <ol><li> Verdünnen L243 Antikörper Lager (0,5 mg / ml) in Boratpuffer auf eine Arbeitskonzentration von 10 ug / ml. <ol><li> Zur Beschichtung eines einzigen 384-Well-Platte, 200 ul Lager Antikörper auf 9,8 ml Boratpuffer. (Siehe ergänzende Tabellenkalkulationsrechner für alternative Skalierung). </li></ol></li><li> Werden 25 ul der L243-Antikörper-Lösung in jede Vertiefung einer 384-Well hohe Bindungs ​​weiß ELISA-Platte. (Liquid-Handling-Roboter) </li><li> Verschließen Sie die Platte mit einer Polyesterfolie und Inkubation über Nacht bei 4 ° C Hinweis: Jeder 384-Well-ELISA-Platte können bis zu 15 Testpeptide an acht Verdünnungen für ein MHC-II-Allele sowie die positive und negative Kontrollen unterzubringen. Dies wird letztlich ergeben Dreifachmessungen. </li></ol> 2. Machen Sie den Test-Peptid-Verdünnungen (Tag 1) <ol><li> Ausgehend von einer 10 mM Stamm jeder Test Peptid in DMSO, machen den folgenden Verdünnungsreihe in Citrat-Phosphat-Puffer mit 384-Well-Polypropylenplatten (Tabelle 1). (Liquid-Handling-Roboter) Hinweis: Eine vollständige 384-Well-Polypropylenplatte erfordert drei separate ELISA-Platten. Ein Drittel einer Polypropylenplatte wird nur eine ELISA-Platte (Abb. 1) setzen. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody align="center"><tr><td rowspan="2"> Verdünnung Anzahl </td><td> Volume to aus dem Stand der Verdünnung / Lager nehmen </td><td> Volume Citratpuffer hinzufügen </td><td> Konz. der Verdünnung </td><td> Konz. in Bindungsreaktion </td><td> Konz. in neutralisierter ELISA </td></tr><tr><td> (Ul) </td><td> (Ul) </td><td> (UM) </td><td> (UM) </td><td> (UM) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0,7 </td><td> 35,1 </td><td> 195,531 </td><td> 97,765 </td><td> 48,883 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 97,765 </td><td> 48,883 </td><td> 24,441 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 7.1 </td><td> 28,7 </td><td> 19,389 </td><td> 9,695 </td><td> 4,847 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 9,695 </td><td> 4,847 </td><td> 2.424 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 7.1 </td><td> 28,7 </td><td> 1.923 </td><td> 0.961 </td><td> 0.481 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 0.961 </td><td> 0.481 </td><td> 0,24 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 7.1 </td><td> 28,7 </td><td> 0.191 </td><td> 0,095 </td><td> 0,048 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 0,095 </td><td> 0,048 </td><td> 0,024 </td></tr><tr><td colspan="6"> Entfernen und entsorgen 7,1 ul Peptidlösung von Verdünnungszahl 8. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Herstellung der Testpeptidverdünnungsreihe. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51308/51308fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51308/51308fig1.jpg" /> Abbildung 1. Platte Karte von Peptid-Bindungsassay. (A) Karte der Peptidverdünnungen in Polypropylen-384-Well-Platten. Jeder Polypropylenplatte können drei Gruppen von 15 Peptiden in Wettbewerb Bindungsreaktionen gegen einen singen aufnehmen<html> le MHC-II-Allel. (B) Nach der Bindungsreaktion Gleichgewicht nähert, ist jede Peptidgruppe übertragen werden, in dreifacher Ausfertigung an einen separaten 384-Well-ELISA-Platte, die mit anti-MHC-II-Antikörper schwemmt wurde. 3. Bereiten Sie die MHC-II-Master-Mix (Tag 1) <ol><li> Machen Sie das Reaktionspuffer <ol><li> Hinzufügen von 80 &amp;mgr; l 1 mM Pefa Block und 60 mg Octyl-β-D-glucopyranaside zu 3.920 ul Citratpuffer. (Siehe ergänzende Tabellenkalkulationsrechner für alternative Skalierung). </li></ol></li><li> Verdünnen Sie ausgewählt MHC-II-Stammlösungen bis 101 nM in Reaktionspuffer mit einem 15 ml konischen Röhrchen (Tabelle 2). Hinweis: MHC-II-Konzentration wird letztlich 50 nM in der Bindungsreaktion und 25 nM in der neutralisierten ELISA-Test. Die MHC-II-Lager Konzentrationen je nach Hersteller variieren Losnummer. (Siehe ergänzende Tabellenkalkulationsrechner). </li></ol>&quot;&gt; <tbody><tr><td> MHC-II-Allele DRB1 *: </td><td> 1501 </td></tr><tr><td> MHC II Stock Konzentration (mg / ml) </td><td> 1.3 </td></tr><tr><td> MHC II Stock Konzentration (mM) </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Vol. MHC II Stock auf Add (ml) </td><td> 14,65 </td></tr><tr><td> Vol. Reaktionspuffer auf Add (ml): </td><td> 2.885,35 </td></tr><tr><td> MHC-II-Master-Mix-Konzentration (nM) </td><td> 101 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Herstellung von MHC-II-Master-Mix. 4. Bereiten Sie die Negativ-und Positivkontrollen (Tag 1) <ol><li> In 21,5 ul Citratphosphatpuffer auf die &quot;Negativkontrolle&quot; sowie des 384-Well-Polypropylenplatte aus Schritt 2.1 (Abbildung 1A). </li><li> In 21,5 ul Citratphosphatpuffer auf die &quot;Positivkontrolle&quot; sowie des 384-Well-Polypropylenplatte. Hinweis: Die &quot;Positiontive Kontrolle &quot;wird in Abschnitt 5 abgeschlossen sein. </li><li> Entfernen 49,5 ul des MHC II-Master-Mix aus Schritt 3.2 und einer Pipette in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> In 0,5 ul Citratpuffer zu den 49,5 ul der MHC-II-Master-Mix aus Schritt 4.3. </li><li> In 21,5 ul der Konzentration eingestellt MHC-II-Master-Mix aus Schritt 4.4 in die &quot;Negativkontrolle&quot; sowie des 384-Well-Polypropylenplatte (Abbildung 1A). Hinweis: Dieses Beispiel steht für die Null-Signal negativ Kontrolle, die MHC-II-Protein, keine Kontrolle Peptid und kein Test-Peptid. </li></ol> 5. Fügen Sie die entsprechenden Control Peptide an das MHC-II-Master-Mix (Tag 1) <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> MHC-II-Allele DRB1 * </td><td> Biotinylated Control Peptide </td><td> (Reste) </td><td> Folge </td></tr><tr><td> 0101 </td><td> Grippe-HA-B </td><td> (306-318) </td><td> Biotin-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amid </td></tr><tr><td> 0301 </td><td> Myoglobin </td><td> (137-148) </td><td> Biotin-(Ahx) - (Ahx)-LFRKDIAAKYKE-OH </td></tr><tr><td> 0401 </td><td> Yar-B </td><td> (1-14) </td><td> Biotin-(Ahx) (Ahx) YARFQSQTTLKQKT-OH </td></tr><tr><td> 0701 </td><td> TetTox-B </td><td> (830-843) </td><td> Biotin-(Ahx) (Ahx) QYIKANSKFIGITE-OH </td></tr><tr><td> 1101 </td><td> Grippe-HA-B </td><td> (306-318) </td><td> Biotin-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amid </td></tr><tr><td> 1501 </td><td> MBP-B </td><td> (84-102) </td><td> Biotin-(Ahx) (Ahx) NPVVHFFKNIVTPRTPPPS-OH </td></tr></tbody></table> * Wir empfehlen die 10-mg-Maßstab für die Wirtschaft. Tabelle 3. Steuer Peptide für verschiedene MHC-II-Allele. * <ol><li> Verdünnen Sie die Kontrollpeptid (bei 400 uM in DMSO gespeichert) 1:20 frischen DMSO, um eine verdünnte Lager bei 20 uM ergeben. <ol><li> In 25 ul 400 uM Kontrollpeptid zu475 ul DMSO. Hinweis: Dies ist ein großer Überschuß, sondern ermöglicht präzises Handling von viskosen DMSO-Lösungen. </li></ol></li><li> Weiter verdünnt das Control Peptide aus Schritt 5.1 (20 mM), 1:100 in den MHC II-Master-Mix aus Schritt 3.2. <ol><li> In 28,8 ul Control Peptide in Schritt 5.2 auf die verbleibenden 2,850.5 ul der MHC-II-Master Mix verdünnt. </li></ol></li><li> In 21,5 ul der MHC-II-Master-Mix mit Kontrollpeptid (Schritt 5.2) mit der positiven Kontrolle sowie der 384-Well-Polypropylenplatte (Schritt 4.2) (Abbildung 1A). Hinweis: Dieses Beispiel stellt die High-Signal positive Kontrolle mit MHC-II-Protein-, Steuer-Peptid und kein Test-Peptid. </li></ol> 6. Stellen Sie die Bindungsreaktion (Tag 1) <ol><li> Hinzufügen des MHC II-Master-Mix, enthaltend Control Peptide (Schritt 5.2), um jede der Testpeptidverdünnungen (Schritt 2.1) im Verhältnis 1:1, um die Bindungsreaktion zu erzeugen. <ol><li> In 21,5 ul von MHC-II-Master-Mix enthält Control Peptid aus Schritt 5,2-21,5 ul jeder Testpeptid Verdünnung von Schritt 2.1. (Liquid-Handling-Roboter) </li></ol></li><li> Siegel der Bindungsreaktion mit einer Polyesterfolie und inkubieren 24.12 h in einem Nicht-CO 2-gesteuerte Brutschrank bei 37 ° C ohne Schütteln. </li></ol> 7. Neutralisieren und Transfer der Bindungsreaktion (Tag 2) <ol><li> Nehmen Sie die 384-Well-Polypropylenplatte, die die Bindungsreaktion (Schritt 6.2) aus der 37 ° C-Inkubator. </li><li> Verdünnen Sie die Bindungsreaktion 1:1 mit Neutralisierungspuffer. (Liquid-Handling-Roboter) <ol><li> In 43 ul der Neutralisationspuffer in jede Bindungsreaktion gut. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die ELISA-Platte (Schritt 1.3) von 4 ° C zu waschen und 3x mit 60 ml / Vertiefung PBS-Tween 20 0,05%. (Plattenscheibe) </li><li> Übertragungs 25 ul jeder neutralisiert Bindungsreaktion aus Schritt 7.2 in dreifachen Vertiefungen der Antikörper-beschichteten 384-Well-ELISA-Platte aus Schritt 7.3. (Fig. 1 </strong&gt;) (Liquid-Handling-Roboter) </li><li> Decken Sie die ELISA-Platte mit einer Polyesterfolie und in einem 37 ° C-Inkubator für 2,5 h oder in einer 4 ° C Kühlschrank über Nacht. </li></ol> 8. ELISA-Entwicklung (Tag 2 und 3) <ol><li> Entfernen Sie die ELISA-Platte aus Schritt 7.5, 3 x waschen mit 60 ul / Vertiefung PBS-Tween 0,05%. (Plattenscheibe) </li><li> Verdünnen Streptavidin-Europium-Stammlösung (0,1 mg / ml Streptavidin, 7 Eu 3 + / Streptavidin) 1000-fach in der DELFIA Assay Buffer. <ol><li> Für ein 384-Well-Platte, verdünnte 10 ul Streptavidin-Europium in 10 ml Assay-Puffer. </li></ol></li><li> In 25 ul der verdünnten Streptavidin-Europium in jede Vertiefung des 384-Well-ELISA-Platte aus Schritt 8.1. (Liquid-Handling-Roboter) </li><li> Die Platte mit einer Polyesterfolie und in der Dunkelheit bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Hinweis: Während der 1-stündigen Inkubation, entfernen Sie die Enhancement-Lösung aus dem Kühlschrank und auf ro beiseite 10 ml / Platte in der Dunkelheitom Temperatur. </li><li> Nach der 1-stündigen Inkubation, waschen Sie die 384-Well-ELISA-Platte aus Schritt 8.3 3x mit 60 ul / Vertiefung PBS-Tween 0,05%. (Plattenscheibe) </li><li> In 25 ul Enhancement Solution in jedes Well der 384-Well-ELISA-Platte aus Schritt 8.5. (Liquid-Handling-Roboter) </li><li> Decken Sie die 384-Well-ELISA-Platte mit einer Polyesterfolie und damit die Platte im Dunkeln bei Raumtemperatur für 10-15 min zu sitzen. </li><li> Nach 10-15 min Inkubation, lesen die Fluoreszenz des 384-Well-ELISA-Platte aus Schritt 8.7 mit einem zeitaufgelöste Fluoreszenz-Plattenlesegerät mit Europium Einstellungen (z. B. Start-Int: 200, Stopp Int. 1.000, Ex 340, Em . 615 Cutoff: Keine, PMT: Auto, Reads / Well: 50). </li></ol> 9. Datenanalyse <ol><li> Eingabe von Daten in XY-Format Graph mit 3 Wiederholungswerten in Seite-an-Seite-Spalten (X = Testpeptidkonzentration, Y = Fluoreszenzmessung). </li><li> Melden Sie verwandeln die X-Werte für alle Daten: X = log (X) </li><li> Setzen Sie die Log-transformed Daten mit dem ein-Ort-kompetitiver Bindungsmodell, um die IC 50-Wert zu extrahieren. </li><li> Beschränken Sie den unteren Wert für den durchschnittlichen negativen Steuerwert. </li><li> Weltweit passen die Top-Wert und sicherzustellen, dass die globalen Parameter Passform unterhalb oder gleich der positiven Kontrolle. </li></ol>

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Immunol. 131, 189-201 (2009).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+assessment+of+MHC+class+II+peptide+binding+predictions+and+evaluation+of+a+consensus+approach.">A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach.</a> PLoS Comput. Biol. 4, e1000048 (2008).</li><li>Sette, A., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+vaccinology:+developing+vaccines+in+the+era+of+genomics.">Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics.</a> Immunity. 33, 530-541 (2010).</li><li>Moise, L., Cousens, L., Fueyo, J., De Groot, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+genomics+and+immunoinformatics+to+produce+improved+vaccines.">Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines.</a> Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).</li><li>Sturniolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tissue-specific+and+promiscuous+HLA+ligand+databases+using+DNA+microarrays+and+virtual+HLA+class+II+matrices.">Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices.</a> Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologic+drugs+set+to+top+2012+sales.">Biologic drugs set to top 2012 sales.</a> Nat. Med. 18, 636 (2012).</li><li>Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+vaccines+in+the+era+of+genomics:+a+decade+of+reverse+vaccinology.">Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology.</a> Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).</li><li>Jiang, W., Boder, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+engineering+and+analysis+of+peptide+binding+to+class+II+MHC.">High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).</li><li>Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -. L. B., Buus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+recombinant+MHC+class+II+molecules+and+high-throughput+peptide-binding+assays.">Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays.</a> Immun. 5, 1-20 (2009).</li></ol>

Leonard ist von Moise beschäftigt und hält Aktienoptionen in EpiVax, Inc., ein privat geführtes Biotechnologie-Unternehmen in Providence, RI entfernt. Die Arbeit in diesem Forschungsbericht enthalten ist, ist frei von jeglicher Voreingenommenheit, die mit der kommerziellen Ziele des Unternehmens in Verbindung gebracht werden könnten.

Biotherapeutics haben sich als Eckpfeiler der modernen Medizin gegründet, repräsentiert vier der fünf meistverkauften Medikamente im Jahr 2012 32. Die Biopharmazie-Sektor hat ein nachhaltiges Wachstum für mehrere Jahre 6 gezeigt, und der laufenden Entwicklung neuer Wirkstoffe sowie die Entstehung von Biosimilars hat biopharmazeutischen Pipelines ausgebaut. Blick in die Zukunft, Bewertung und Minderung der Immunogenität von Proteintherapeutika wird ein integraler Bestandteil der frühen Phase B...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/51308/a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis">A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes</a>.&#160; There were typos in the Protocol section and Table 2.
Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:
Add 80 &#181;l of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-&#946;-D-glucopyranaside to 3,920 &#181;l of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
to:
Add 80 &#181;l of 1 mM Pefa Bloc and 60 &#181;g of octyl-&#946;-D-glucopyranaside to 3,920 &#181;l of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
Step 5.2&#160;in the Protocol was updated from:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
to:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 &#181;M) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
Table 2 was updated from:
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="376">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC II Allele DRB1*:</td>
			<td>1501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mg/ml)</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mM)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. MHC II Stock to Add (ml)</td>
			<td>14.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. Reaction Buffer to Add (ml):</td>
			<td>2885.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Master Mix Concentration (nM)</td>
			<td>101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="376">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC II Allele DRB1*:</td>
			<td>1501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mg/ml)</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (&#956;M)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. MHC II Stock to Add (&#956;l)</td>
			<td>14.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. Reaction Buffer to Add (&#956;l):</td>
			<td>2885.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Master Mix Concentration (nM)</td>
			<td>101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/51308/a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis">A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes</a>.&#160; There were typos in the Protocol section and Table 2.

Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Proteine ​​sind die am schnellsten wachsende Klasse von Therapeutika 6 und die rasche Expansion der Biotherapeutika-Pipelines hat immer mehr Aufmerksamkeit auf die Herausforderungen, die mit der Entwicklung und Verwendung von Protein Drogen konzentriert. Eine einzigartige Betrachtung ergibt sich aus der Tatsache, daß in einem gesunden und funktionierenden Immunsystems, alle extrazellulären Proteine ​​werden durch Antigen-präsentierende Zellen (APCs) abgetastet. Einmal durch APCs internalisiert wird ein Protein in kleine Peptidfragmente gespalten, und putativen immunogenen Segmente werden in die Nut des Klasse-II-Haupthistokompatibilitätskomplex-Proteine ​​(MHC II) geladen. Die Peptid-MHC-II-Komplexe werden dann auf der Oberfläche von APC angezeigt und wahre immunogene Peptide, genannt T-Zell-Epitope bilden ternären II-MHC-Peptid-T-Zell-Rezeptor-Komplexe mit verwandten CD4 T-Zell-Oberflächenrezeptoren 7. Diese kritische Ereignis molekularen Erkennung löst eine komplexe Signalkaskade, die in T-Zell-Aktivierung führt, die Freisetzung von Zytokins, CD4-T-Zell-vermittelten B-Zell-Reifung und letztlich die Produktion von zirkulierenden IgG-Antikörper, die zu binden und deaktivieren Sie das säumige exogene Protein. So könnte immunogene Proteine ​​durch die Identifizierung Bestand T-Zell-Epitopen und mutiert Schlüsselreste für MHC-II-Komplexbildung verantwortlich deimmunized werden. Es trägt jedoch in Kenntnis, dass T-Zell-Epitope können zahlreiche und breit während immunogene Proteine ​​verteilt sein, und die Mehrheit der Epitop-Löschen Mutationen wahrscheinlich ein unbeabsichtigter Verlust der Proteinfunktion oder Stabilität verursachen. Daher deimmunized Engineering Biotherapien kann eine komplexe und technisch anspruchsvolle Ziel sein, aber es gibt mehrere Beispiele von erfolgreichen T-Zell-Epitop-Deletion Projekte 3,5,8-12. Anders als Pfropfen-basierten &quot;Humanisierung&quot;, die weitgehend auf Antikörper-Therapeutika eingeschränkt ist, kann Epitop Löschung im Wesentlichen jedes Zielprotein unabhängig von der Sequenz, Struktur, Funktion angewendet werden, oder die Verfügbarkeit von homologouns Menschen Gerüste. Der erste Schritt zur Umsetzung eines solchen Ansatzes ist die Identifizierung von Schlüssel Peptid-Epitope innerhalb der Zielproteinsequenz eingebettet. Hoher Durchsatz biochemischen Assays unter Verwendung von synthetischen Peptiden und rekombinanten humanen MHC-II-Moleküle kann eine schnelle vorläufige Einblicke in Epitop-Erkennung und Eingrenzung 1,3-5 bieten. Diese ELISA-Assays kann eine starke Ergänzung zu anderen Protein / Impfstoff-Design-und Entwicklungstools können. Zum Beispiel, eine gut etablierte experimentelle Ansatz zur Epitop-Mapping setzt auf Zeit, Arbeit, ressourcenintensiv und Ex-vivo-Zellproliferationsassays 15. Kurz gesagt, wird die Primärsequenz eines Zielproteins zunächst in einer Gruppe von überlappenden Peptiden unterteilt häufig überlappen 15-mere mit 12 Resten zwischen benachbarten Peptiden. Das Peptid chemisch synthetisiert wird Platte und der Immunogenität jedes Peptid in einer von mehreren verschiedenen Immunoassays, die Umfangs bloo beschäftigen getestetd mononuklearen Zellen (PBMC) aus menschlichen Spendern isoliert 13,14. Um mehr Vertrauen in die Ergebnisse liefern, Peptide werden typischerweise in Replikat mit PBMC von 50 oder mehr verschiedenen Spendern getestet. In Fällen, in denen Deimmunisierung ist das ultimative Ziel ist die Arbeit noch durch die Notwendigkeit, zusätzliche Platten von mutierten Peptide produzieren und testen Sie die neuen Peptid-Panels in PBMC-Tests vor der Einführung deimmunizing keine Mutationen in das Protein voller Länge für spätere Funktionsanalyse 10 verstärkt. Während diese zellulären Assays bleibt der Goldstandard für die Bewertung der immunogenen Potential in menschlichen Patienten, kann die Effizienz eines solchen erschöpfend Ansatz Vorfilterung putativen immunogenen Epitopen unter Verwendung eines schnellen und hohen Durchsatz MHC-II-Peptid-Bindungstest verbessert werden. Ebenso können biochemische Peptid-MHC-II-Bindungsassays mit prädiktiven in silico-Methoden kombiniert werden, um radikal zu beschleunigen, die das Epitop Identifikationsprozess.Es gibt eine Vielzahl von Computerwerkzeuge für die T-Zell-Epitop-Vorhersage Beispiele schließen ProPred 16, MHCPred 17, SVRMHC 18, ARB 19, SMM ausrichten 20, 21 NetMHCIIpan sowie proprietäre Tools wie EpiMatrix von EpiVax 22. Ebenso haben Epitop Prädiktoren vor kurzem mit anderen Bioinformatik und Molekularmodellierungswerkzeuge, integrierte Protein Deimmunisierung Algorithmen entwickelt, um das Risiko, dass deimmunizing Mutationen könnten Protein-Struktur und Funktion stören 23-26 mildern ergeben kombiniert. Während mehrere Epitop Prädiktoren haben sich einigermaßen genau zu sein 27,28, Rechenergebnisse immer erfordern experimentelle Validierung. Schnelle, hohen Durchsatz und kosteneffektive experimentellen Methoden am besten geeignet sind als Vorfilter für die in silico-Epitop-Vorhersagen. In ähnlicher Weise kann Epitop Prädiktoren Antigen-Auswahl für Rückwärts vaccinolo fahrengy 29,30. Beispielsweise haben Fortschritte in der Bioinformatik gesamte Genom Bildschirme schnell in Form von ganzen Proteinen oder Peptid-Epitope aus Pathogen Proteome extrahiert identifizieren Impfstoffkandidaten ergab. Während diese grundlegende Technologie ist Neugestaltung der Entdeckung und Entwicklung von Schutz Impfstoffe, stellt es eine neue Herausforderung in Form von widerspenstig große Listen von immunogenen Impfstoff-Kandidaten. Hochdurchsatz-Peptid-MHC-II-Bindungsassays können Epitop-Auswahl führen durch die Quantifizierung Peptid-Bindungsaffinität und Bindungs ​​Promiskuität unter mehreren MHC-II-Allele. Wie bei Protein Deimmunisierung werden solche experimentellen Methoden erforderlich, um letztlich computergestützten Vorhersage von vielversprechenden Impfstoff führt zu validieren. Hier wird ein Peptid-MHC-II-Bindungsassay auf 384-Well-Format skaliert wird beschrieben. Das Protokoll ist sehr parallelisierten und reduziert Reagenzienkosten um 75% im Vergleich zum zuvor beschriebenen 96-Well-Plattenformate 1,3-5. Mit einem einzigen Liquidationd Handling-Roboter ermöglicht diese Methode ein Forscher leicht über einen Bereich von acht und vier Konzentrationen von MHC-II-Allel Arten in weniger als 48 Stunden zu analysieren etwa neunzig Testpeptide in dreifacher Ausfertigung. Dieser Artikel beschreibt die Einrichtung eines 384-Well-ELISA-Platte für die Analyse von sieben experimentellen Peptide gegen einen MHC-II-Allel, aber Tabellenkalkulation Taschenrechner werden als ergänzendes Material zur Verfügung gestellt, um so leicht zu skalieren das Experiment auf eine beliebige Anzahl von gewünschten Peptide und / oder MHC II-Molekülen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:587px;">Sodium Tetraborate Decahydrate</td>
			<td style="width:357px;">Sigma</td>
			<td style="width:217px;">221732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Citric Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Trizma HCl</td>
			<td>OmniPur</td>
			<td>9310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">100% DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Octyl-&#946;-D-Glucopyranaside</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>29836-26-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Pefa Bloc SCF</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1158591600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Dulbecco&#8217;s 10X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">DELFIA Assay Buffer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>4002-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">DELFIA Enhancement Buffer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>4001-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Europium Labelled Streptavidin</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1244-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">L243 anti-HLA-DR antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>307602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Biotinylated tracer peptides</td>
			<td>21st Century Biochemicals</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Test peptides (1-4mg, 85% purity)</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated)</td>
			<td>Benaroya Research Institute*</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">384-well white EIA/RIA plate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>460372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Polypropylene 384-well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Film, AxySeal, 80 &#181;m, ELISA Applicator&#160;</td>
			<td>Axygen Asicentific</td>
			<td>PCR-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">MilliQ Water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Epimotion Liquid Handler (or similar)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Select TS Plate Washer (or similar)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="98" style="height:99px;width:1161px;">*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory. See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high throughput mhc ii binding assay for quantitative analysis of peptide epitopes

Biochemischen Assays mit rekombinanten menschlichen MHC-II-Moleküle können schnelle, quantitative Einsichten in immunogenes Epitop Identifizierung, Deletion oder Design 1,2 bereitzustellen. Hier wird ein Peptid-MHC-II-Bindungsassay auf 384-Well-Format skaliert. Die abgespeckte Protokoll reduziert Reagenzienkosten um 75% und höheren Durchsatz als zuvor beschriebenen 96-Loch-Protokolle 1,3-5. Genauer gesagt, der experimentelle Aufbau ermöglicht robuste und reproduzierbare Analyse von bis zu 15 Peptide gegen einen MHC-II-Allel pro 384-Well-ELISA-Platte. Mit einem einzigen Liquid-Handling-Roboter ermöglicht diese Methode ein Forscher auf etwa neunzig Testpeptide in dreifacher Ausfertigung über einen Bereich von acht und vier Konzentrationen von MHC-II-Allel Arten in weniger als 48 Stunden zu analysieren. Andere arbeiten in den Bereichen Protein Deimmunisierung oder Impfstoff-Design und Entwicklung kann das Protokoll zu finden, die in die Erleichterung ihrer eigenen Arbeit zu sein. Insbesondere die Schritt-für-Schritt-Anweisungen und die visuellen FormatJupiters sollte damit andere Benutzer schnell und einfach diese Methodik zu etablieren in ihren eigenen Labors.

Die reife Peptidsequenz von Enterobacter cloacae P99 beta-Lactamase (BLA) (Genbank ID # X07274.1) wurde mit ProPred 16 mutmaßliche Peptid Bindemittel MHC II-Allel DRB1 * 1501 (Tabelle 4) analysiert. ProPred identifiziert 117 Nonamer Peptide mit einer obligatorischen P1 Ankerrest (dh ein M, L, I, V, W, Y oder W an Position 1, die für MHC-II erforderlich ist verbindlich 31). Bei einer Schwelle von 5%, Peptide nur mit Werten größer oder gleich 2,6 sind wahrschein...

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A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemischen Assays mit rekombinanten menschlichen MHC-II-Moleküle können schnelle, quantitative Einsichten in immunogenes Epitop Identifizierung, Deletion oder Design zu schaffen. Hier wird ein Peptid-MHC-II-Bindungsassay auf 384-Well-Platten skaliert wird beschrieben. Diese kostengünstige Format ist auf den Gebieten der Protein-und Impfstoff Deimmunisierung Design und Entwicklung beweisen.

Ein hoher Durchsatz MHC II-Bindungsassay für die quantitative Analyse von Peptid-Epitope

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

14.8K Aufrufe.  Dartmouth College.  Biochemischen Assays mit rekombinanten menschlichen MHC-II-Moleküle können schnelle, quantitative Einsichten in immunogenes Epitop Identifizierung, Deletion oder Design zu schaffen. Hier wird ein Peptid-MHC-II-Bindungsassay auf 384-Well-Platten skaliert wird beschrieben. Diese kostengünstige Format ist auf den Gebieten der Protein-und Impfstoff Deimmunisierung Design und Entwicklung beweisen. 

Serie: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method relies on the highly specific interaction between peptide loaded MHC and the corresponding T-cell receptor.  While the affinity of a single MHC/peptide molecule is low, cross-linking MHC/peptide complexes with streptavidin increases the avidity of the interaction, enabling their use as staining reagents.  Because of the relatively low frequencies of CD4+ T cells (~1 in 300,000 for a single specificity) this assay utilizes an in vitro amplification step to increase its threshold of detection.  Mononuclear cells are purified from peripheral blood by Ficoll underlay.  CD4+ cells are then separated by negative selection using biotinylated antibody cocktail and anti-biotin labeled magnetic beads.  Using adherent cells from the CD4- cell fraction as antigen presenting cells, CD4+ T cells are expanded in media by adding an antigenic peptide and IL-2.  The expanded cells are stained with the corresponding class II tetramer by incubating at 37 C for one hour and subsequently stained using surface antibodies such as anti-CD4, anti-CD3, and anti-CD25.  After labeling, the cells can be directly analyzed by flow cytometry.  The tetramer positive cells typically form a distinct population among the expanded CD4+ cells.  Tetramer positive cells are usually CD25+ and often CD4 high.  Because the level of background tetramer staining can vary, positive staining results should always be compared to the staining of the same cells with an irrelevant tetramer.  Multiple variations of this basic assay are possible.  Tetramer positive cells may be sorted for further phenotypic analysis, inclusion in ELISPOT or proliferation assays, or other secondary assays.  Several groups have also demonstrated co-staining using tetramers and either anti-cytokine or anti-FoxP3 antibodies.  

This procedure demonstrates the purification and in vitro expansion of antigen specific CD4+ T cells from whole peripheral blood and their visualization using MHC class II tetramers. Tetramers permit the direct visualization of T cells with a single antigen specificity and defined MHC class II restriction.

Visualizing Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen mit MHC Klasse II Tetramere

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

Forschung

Biologie

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

High-Throughput-Assay Verzuckerung für Lignocellulose-Materialien

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

A Quantitative Analysis Fitness-Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

Hochdurchsatz-Screening mit einem Funktionshomemade Dual-Luciferase Assay-Schein

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluorescence Komplementierung: A High Throughput Quantitative Methode zur Protein-Protein Interaction Study

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analyse - ein hoher Durchsatz, Echtzeit-PCR-Assay für Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

Hochdurchsatz-<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energieumsatz-Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...