Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health Grant R35 GM118177 PND unterstützt.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die hier beschriebenen Methoden bieten eine bequeme Möglichkeit, Bevölkerung und einzelne Zelle Verhalten um Strömung Scheren zu beurteilen. Wichtig ist, während frühere Studien Lokalisierung von leading und lagging Rand Markierungen während der Migration analysiert, ermöglicht das derzeitige Konzept Untersuchung der unmittelbaren Auswirkungen durch die Anwendung der Schubfluss akut. Mit dieser Methode haben wir gezeigt, dass in der Tat, die erste Reaktion der Zellen fließen Scherung Zellwanderung nicht erforderlich ist. Rasche und vorübergehende Reaktion auf den ersten scher Fluss Reiz vorausgeht stattdessen die gerichtete Migration gesehen mit längerer Exposition, fließen, ähnlich wie die erste globale Reaktion gesehen mit einem Lockstoffgradient Verlauf zu scheren.
Die biochemischen und mikroskopische Ansätze Ertragsdaten ergänzen, obwohl jede Methode vor- und Nachteile hat. Stimulation gefolgt von Zelle Lysis und Immunoblotting PKBs, KrsB und ERK, z. B. eine Grundgesamtheit von Zellen analysiert und somit im Durchschnitt Zell-Zell-Variante, im Gegensatz zu einem Assay, der einzelne Zelle Verhalten untersucht. Jedoch tendenziell bevölkerungsbezogene Assays Maske subtile Veränderungen in Zelle Verhalten, das durch die Analyse von einzelner Zellen leicht beobachtet werden kann. Darüber hinaus wird der biochemische Test hier beschrieben nur mit Aggregation-kompetente Zellen, aus Gründen, die später diskutiert werden. Im Gegensatz dazu der Mikroskopie-basierten Test der Relokalisierung der RBD, RalGDS, PH-Crac, KalkΔcoilund PTEN, z. B. zwischen Hirnrinde und Zellflüssigkeit ist effektiv für vegetative und Aggregation-kompetente Zellen und somit für Beobachtungen Zellen mit unterschiedlichem Grad der Polarisierung breit anwendbar sind. Was macht die beiden Ansätze ergänzen, ist die Tatsache, dass sie verschiedene Sätze von verfügbaren führenden/rückständigen Rand Marker, erweitert damit die Berichterstattung über die Signal Transduktion und Aktin Zytoskelett Netze getestet mit der Schere Flow Test prüfen.
Es ist unklar, warum vegetative Zellen, die sehr robust in Mikroskopie-basierte Tests reagieren, nicht auf die Stimulation, gefolgt von Zelle Lysis und Immunoblotting reagieren. Eine Möglichkeit ist, dass die Höhe der Querkraft auf Zellen angewendet, wenn die Platte gedreht wird die Kraft durch die Zellen in einem Strömungsraum erlebt nicht übereinstimmt. Entwickelten Zellen, im Gegensatz dazu könnte haben eine niedrigere Schwelle für Aktivierung und somit unter beiden Bedingungen reagieren. Es ist unwahrscheinlich, dass Biosensoren, die deren Tätigkeit wird durch die biochemischen Assays gemessen nicht angegeben werden oder nicht in den vegetativen Zellen aktiviert sind, da Stimulation des vegetativen Zellen mit Folsäure zu robusten Aktivierung von PKBR1/PKBA und ERK2 führt (Daten nicht angezeigt). Darüber hinaus zeigen die vegetative Zellen klare Einstellung des PH-Crac, die PIP3 Ansammlung widerspiegelt, in der Mikroskopie-basierte Test. Da PKBA Einstellung auch von PIP3 hängt, scheint es unwahrscheinlich, dass PKBA nicht auf akute mechanische Stimulation reagieren würde, es sei denn, die Bedingungen in der biochemischen Test nicht optimal, wie oben erwähnt sind. Dies bleibt eine Fläche von aktiven Untersuchung.
Die biochemische Analyse der Chemotaxis Regulierungsbehörden verpflichtet das Vorhandensein von Koffein während des Experiments. Ursprünglich wurde Koffein hinzugefügt, um zu verhindern, dass Zelle zu Zelle Signalisierung durch Sekretion von cAMP. Es scheint jedoch, dass Koffein eine andere Rolle neben Hemmung der Adenylyl Cyclase (ACA hat) da ACA-Null Zellen noch Koffein für Phosphorylierung des PKBR1 als Reaktion erforderlichen auf akute mechanische Stimulation. Koffein hat zuvor gezeigt, TorC2 Aktivität26zu blockieren. Es ist möglich, dass die Hemmung der TorC2 einige basale Motilität der Zellen blockiert und dadurch gesenkt, die basale Aktivierung von PKBR1 und anderen Komponenten der Signal Transduktion und Aktin-Zytoskelett-Netzwerke. Niedrige basaler Aktivität galt für die Beobachtung der Reaktion auf die Strömung zu scheren. In der Tat, wenn Zellen während der Entwicklung zu früheren Zeitpunkten erhoben wurden, angezeigt sie erhöhte basale Aktivität und eine reduzierte Schubfluss induzierte Reaktion. Interessanterweise ist es bekannt, dass vegetative Zellen proportional mehr PKBA Aktivität und weniger PKBR1 im Vergleich zu Zellen31 entwickelten. Es ist möglich, dass der basalen Zustand in den vegetativen und Aggregation-kompetente Zellen etwas anders geregelt ist, zum das Ausbleiben einer Reaktion des vegetativen Zellen in der biochemischen Test. Seltsamerweise, wenn Zellen zu späteren Zeitpunkten der Entwicklung gesammelt wurden, hatten sie auch eine reduzierte Antwort, wahrscheinlich wegen des starken Einflusses der Polarität auf die Lokalisierung und Aktivierung der verschiedenen Chemotaxis Regulierungsbehörden in diesem Assay untersucht.
Stimulation der Zellen in einer Mikroskopie-Kammer ergab, dass die Stärke und die Dauer der Anregung zur maximalen Antwort22beitragen. Das heißt, eine maximale Reaktion erreicht werden sogar mit einer niedrigen Querkraft wenn es für einen längeren Zeitraum angewendet wird (10 s oder 2 s). Diese Beobachtung erklärt, warum Zellen eine erste globale Antwort haben, wenn sie zuerst auf einen kontinuierlichen, aber schwach, Stimulus, die ausgesetzt sind Scherung strömungsinduzierte Migration führt. Mit dem aktuellen Gerät konnten wir nicht niedrig genug Schubfluss untersuchen das untere Ende des Bereichs zu generieren.
Vielleicht ist die wichtigste Implikation der Studienergebnisse mit akuten mechanische Stimulation, dass mechanische und chemische Reize erscheinen, in gemeinsamen Signaltransduktion und Aktin-Zytoskelett-Netze einzuspeisen. Obwohl wir zeigten, dass die beiden Reize integrieren mit Bulk-Puffer-Zusatz für die mechanische Stimulation, soll zukünftige Studien ein System zu entwickeln, wo Lockstoffgradient schnell in den durchströmten Kanal lieferbar wäre wesentlich vielseitiger und leistungsfähige Methode zur Integration von mechanischen und chemischen Reizen zu beurteilen. Leider ist Lockstoffgradient Zusatz mit dem aktuellen zweizeilige Setup verbunden mit einem zweiten Schub Fluss Stimulus, denn der Lockstoffgradient hat in Anwesenheit von Strom geliefert werden. Eine brauchbare Alternative möglicherweise Laser stimuliert Freisetzung von einer Lockstoffgradient aus einem Käfig Vorläufer, wie erfolgreich für Lager von Westendorf Et al.gezeigt wurde. 32. in die Zukunft, es wäre auch interessant, Integration von anderen Stimuli zu untersuchen, z. B. Scheren fließen und Variable elektrische Felder oder Scherkräfte Strömung und Variable Substrat Steifigkeit. Das letzte Beispiel ist interessant, weil es zwei Arten von mechanischen Stimulation beinhaltet zwar die ersten Signalempfang unterscheiden könnte. Bestätigt, dass alle Reize, die gerichtete Migration führen das gleiche Signal Transduction Netzwerk zu teilen und unterscheiden sich nur in wie der Reiz wahrgenommen wird erläutert, wie Zellen in komplexen Umgebungen navigieren können. Zu guter Letzt haben wir bereits gezeigt, dass akute Stimulation mit Schubfluss zur Ausbreitung der menschlichen Neutrophilen-ähnliche Zellen22 führt. Zukünftige Arbeit prüft weitere Lokalisierung und Aktivierung der verschiedenen Komponenten der Signal Transduktion und Aktin Zytoskelett Netzwerke mit mechanischer Reize in Säugetierzellen.

Migration von eukaryotischen Zellen ist durch unterschiedliche chemische und physikalische Hinweise in der Umgebung, einschließlich Steigungen von löslichen oder Substrat gebunden Chemoattractants, variabler Steifigkeit der Substrate, elektrische Felder oder Schubfluss vorgespannt. Zwar gab es viele Fortschritte in unserem Verständnis der molekularen Mechanismen fahren Chemotaxis, weniger ist bekannt über andere Arten von gerichtete Migration und wie diese vielfältigen Signale auf zellulärer Ebene zu einer einheitlichen produzieren integriert sind wandernde Antwort.
Migration in Richtung einer zunehmenden Konzentration von einem Lockstoffgradient umfasst drei Verhaltens Komponenten gerichtet: Motilität, direktionale sensing und Polarität1. Motilität bezieht sich auf zufällige Bewegung der Zellen durch Pseudopod Vorsprung erreicht. Gerichtete Sensorik ist die Fähigkeit einer Zelle, die Ursache für eine Lockstoffgradient zu ermitteln, die auftreten können, auch in Zellen immobilisiert. Polarität bezieht sich auf die stabiler asymmetrische Verteilung der intrazellulären Komponenten zwischen den führenden und rückständigen Rand einer Zelle, führt zu erhöhten Persistenz in Bewegung.
Zelluläre Reaktion auf eine Lockstoffgradient hängt von der Aktivität von vier konzeptionell definierte Regulationsnetzwerke: Rezeptor / G Protein, Signaltransduktion, Aktin-Zytoskelett und Polarität1. Lockstoffgradient Bindung an den G-Protein-gekoppelten Rezeptor überträgt das Signal über Heterotrimeric G Proteine α und βγ auf die nachgeschalteten Signaltransduktion Netzwerk, das die Richtungs-Signal verstärkt. Mehrere Wege innerhalb des Netzwerks Signal Transduction parallel agieren und fließen in das Aktin Zytoskelett Netzwerk Bias Aktin-Polymerisation und konsequente Pseudopod Vorsprung, in die Richtung des Farbverlaufs. Unter wichtige Regulatoren der Chemotaxis sind Ras GTPase, TorC2, Phosphoinositide 3-Kinase (PI3K), Phosphatase und tensin Homolog (PTEN) und Guanylyl Cyclase. Feedback-Mechanismen innerhalb des Signal-Transduktion-Netzwerks und zwischen der Signaltransduktion und Aktin-Zytoskelett-Netzwerke weiter verstärken die Reaktion. Schließlich, das schlecht definierte Polarität Netzwerk erhält Eingaben aus dem Aktin-Zytoskelett und weitere Vorurteile Signal Transduction Netzwerk zur Förderung der anhaltenden Migration in die Richtung des Farbverlaufs.
Ein Großteil unserer mechanistisches Verständnis der Chemotaxis wurde aufgrund der Entwicklung von Eindringmittel getaggt Biosensoren für verschiedene Komponenten des regulatorischen Netzwerken ermöglicht. Viele Chemotaxis Regulatoren haben eine asymmetrische Verteilung der regulatorischen Molekül selbst oder seine Tätigkeit. Z. B. Biosensoren, die erkennen aktiviert Versionen von kleinen GTPases Ras und Rap1-Ras-bindende Domänen von Raf1 (bezeichnet als RBD hier) und RalGDS, bzw. – zu lokalisieren, an der Vorderkante der Chemotaxing Zelle2,3. In ähnlicher Weise PI3K und seine Produkt Phosphatidylinositol (3,4,5)-Trisphosphate (PIP3), anerkannt durch eine Pleckstrin Homologie (PH) Domäne zeigen auch Lokalisierung an der Vorderseite der Zelle4,5. Im Gegensatz dazu eine 3-Phosphatase PTEN, wandelt die PIP3 zurück zu Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphate, lokalisiert an den rückständigen Rand der Zelle6. Wichtig ist, ändern Sie diese Biosensoren ihrer Lokalisation in Reaktion auf die globale Stimulation mit einem Lockstoffgradient. Vorderkante Marker, die cytosolische oder relocalize an den Spitzen der Vorsprünge in eine ruhende Zelle zum Kortex, während Rand Marker, hinkt die kortikalen Lokalisierung und Fehlen von den Spitzen der Vorsprünge in eine ruhende Zellen werden nach der cytosolischen die Stimulation. Analyse der Biosensor Verteilung in Reaktion auf die globale Stimulation mit einem Lockstoffgradient minimiert den Beitrag der Motilität und Polarität, die oft die Beobachtungen zu verwirren. Global oder gleichmäßige Stimulation eine Zellsuspension mit einem Lockstoffgradient ist auch als Werkzeug zur bevölkerungsweite Veränderungen in Protein-Aktivierung, oft röntgenologisch Protein Phosphorylierung7,8,9 . Diese biochemischen Assay dient vor allem zeitliche Informationen zu während Mikroskopie verwendet wird, um zeitliche und räumliche Informationen über das Verhalten der verschiedenen Komponenten des regulatorischen Netzwerken zu sammeln.
Das Signal Transduction Netzwerk enthält Merkmale eines erregbar System10,11. Reaktionen auf supra-Schwelle chemotaktische Reize sind "verdeutlichen" und feuerfeste Perioden anzeigen. Antworten sind auch stochastisch ausgelöst und oszillierenden Verhalten zeigen können. Signal-Transduktion Ereignisse sind in Regionen des Cortex lokalisiert, die wie Wellen12,13,14,15zu propagieren. Vorne, zurück, Marker zu rekrutieren oder distanziert, die aktiven Zonen der propagierende Wellen. Aufgrund der feuerfesten Region hinter der aktiven Zone vernichten die entgegengesetzt gerichteten Wellen treffen. Die verbreitende Signal Transduction Wellen unterliegen die zelluläre Vorsprünge, die Zelle Migration10vermitteln.
Viele der genannten Informationen über Chemotaxis kam aus den Studien auf die soziale Amöbe Dictyostelium Discoideum, obwohl ähnliche Regulationsmechanismen auch auf Neutrophilen und andere Säugetier-Zelle Arten16 anwendbar sind . Dictyostelium ist ein gut etabliertes Modellorganismus, der hat eine robuste chemotaktische Reaktion während der Hungersnot, wenn Tausende von einzelnen Zellen in einer Aggregation Mitte, schließlich bildet eine vielzellige Fruchtkörper mit Sporen migrieren. Chemotaxis ist auch während der einzelligen Wachstumsphase dieses Organismus zur Ortung von bakteriellen Nahrungsmittelquellen wichtig. Wichtig ist, ist die Migration von Einzelzellen Dictyostelium bemerkenswert ähnlich wie die Migration von Säugetieren Neutrophile oder metastatischen Krebszellen, die sehr schnelle amöboiden Typ Migration zu unterziehen. In der Tat sind sowohl die allgemeine Topologie der regulatorischen Netzwerke, sowie viele der einzelnen Transduktion Signalwege beteiligt Chemotaxis zwischen Dictyostelium und Säugetieren Leukozyten17konserviert. Darüber hinaus nutzen andere Zellen, wie Fibroblasten, Rezeptor-Tyrosin-Kinasen (RTK) anstelle von GPCRs; jedoch kann RTKs in ähnliche Netze einspeisen.
Im Gegensatz zur Chemotaxis fehlt gründliches Verständnis der Signalisierung Mechanismen, die verschiedenen Verkehrsträger gerichtete Migration zu fahren. In ähnlicher Weise auf Zellen in einem Lockstoffgradient Verlauf migrieren mehrere Studien haben berichtet Aktivierung und/oder Lokalisierung von typischen Vorderkante Markierungen, einschließlich Aktin-Polymerisation, PIP3 und/oder extrazelluläre Signal-regulierte Kinase (ERK) 1/2, bei der Vorderseite der Zellen gerichtet Migration als Reaktion auf Flow oder Änderungen in elektrischen Feldern18,19,20,21zu scheren. Führte jedoch in diesen Studien Dauerbelastung auf den Stimulus auch Zellwanderung, lassen offen die Frage, ob beispielsweise die Vorderkante Marker speziell in Reaktion auf einen Reiz zu lokalisieren, oder wenn sie einfach an der Vorderkante zu lokalisieren aufgrund erhöhten Anzahl von Scheinfüßchen an der Vorderseite des eine wandernde Zelle.
Wir entwickelten Assays, die uns erlauben, die Reaktion der Zellen auf akute mechanische Störung geliefert als Schubfluss sowohl auf Bevölkerungsebene sowie Einzelzellen22zu beobachten. Ähnlich wie bei globalen Stimulation mit einem Lockstoffgradient, akute stimulaTion mit Schubfluss ermöglicht die Studie eine zelluläre Reaktion auf einen mechanischen Reiz ohne verwirrende Beitrag von Motilität oder Polarität. Kombinieren diese mikroskopische und biochemische Tests mit genetischen oder pharmakologische Störungen ermöglicht es uns, erfahren über wie mechanische Reize wahrgenommen werden und übermittelt werden. Darüber hinaus bietet dieser Ansatz auch eine neuartige Methode zur Erschließung des Systems unterhalb des Lockstoffgradient-Rezeptors in Ermangelung eines Lockstoffgradient, damit das Signal Transduktion und Aktin Zytoskelett Netzwerke aus dem Rezeptor/G zu isolieren Protein-Netzwerk.
Mit den Techniken, die wir kürzlich beschriebenen demonstrierte, dass akute Scherbeanspruchung führt zu Aktivierung mehrerer Komponenten der chemotaktische Signal Transduction und Aktin Zytoskelett Netzwerke22. Durch die Anwendung des akute mechanischen Reizes in unterschiedlichen Abständen, haben wir bewiesen, dass in ähnlicher Weise zu Chemoattractants, Reaktion auf mechanische Reize auch bietet eine erregbare Systems, einschließlich das verdeutlichen Verhalten die Reaktion unter Ausstellungen Bedingungen und das Vorhandensein von einer Refraktärzeit zu sättigen. Durch die Kombination von mechanischen und chemischen Stimulation haben wir schließlich gezeigt, dass die beiden Reize teilen Signal Transduction und Aktin Zytoskelett Netzwerke, die wahrscheinlich für die Integration von mehreren reizen, Bias Zellwanderung ermöglichen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-1</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose peptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0120-17-6</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media (step 1.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-550-445</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S373-500</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P386-500</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN10040525</td>
			<td>Use to prepare HL-5 media (step 1.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone (Bacto)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0118-17-0</td>
			<td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-100</td>
			<td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M65-500</td>
			<td>Use to prepare DB Buffer (step 1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td>Use to prepare DB Buffer (step 1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O1728-500</td>
			<td>Use to prepare caffeine (step 1.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-680-1100MG</td>
			<td>Use to prepare cAMP (step 1.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7876</td>
			<td>Use to prepare folic acid (step 1.7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-500</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610610</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610404</td>
			<td>Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S299-100</td>
			<td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-994-911</td>
			<td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate decahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S390-500</td>
			<td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latrunculin A</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T119-0100</td>
			<td>Use to prepare Latrunculin A (step 1.9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>3450029</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene fluoride membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620177</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2060</td>
			<td>Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4370</td>
			<td>Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA934-100UL</td>
			<td>Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1705060</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>PI46430</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PI20278</td>
			<td>Use for immunoblotting (step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K. aerogenes strain (non-pathogenic)</td>
			<td>Dicty Stock Center (dictybase.org)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>Use to prepare SM plates (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td>Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772A</td>
			<td>Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene cup (5 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13915-985</td>
			<td>Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic unit with pump (ibidi Pump System)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td>Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide with a channel (&#956;-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80316</td>
			<td>Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10978</td>
			<td>Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10964</td>
			<td>Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Line for the drain (1.6 mm ID tubing)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10842</td>
			<td>Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40&#215;/1.25&#8211;0.75 oil objective (or a comparable alternative)</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>DM 16000</td>
			<td>An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252000021D and 5192000027</td>
			<td>Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (Femtotip; 1 &#956;m outside diameter, 0.5 &#956;m inside diameter )</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000035</td>
			<td>Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956.003</td>
			<td>Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-472</td>
			<td>Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-338</td>
			<td>Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software (Fiji)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Migration analysis software (Tracking Tool PRO)</td>
			<td>Gradientech</td>
			<td>http://gradientech.se/tracking-tool-pro/</td>
			<td>Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of dictyostelium discoideum response to acute mechanical stimulation

Chemotaxis oder Migration eine Steigung von einem Lockstoffgradient ist die am besten verstanden gerichtete Migration. Studien über soziale Amöbe Dictyostelium Discoideum ergab, dass ein komplexes Signal Transduction Netzwerk von parallelen Bahnen die Reaktion auf Chemoattractants verstärkt und zu voreingenommen Aktin-Polymerisation und Vorwölbung des Pseudopod in führt der Richtung eines Verlaufs. Im Gegensatz dazu sind die molekulare Mechanismen fahren andere Arten von gerichtete Migration, z. B. durch Einwirkung von Strom oder elektrische Felder, Scheren nicht bekannt. Viele Regulatoren der Chemotaxis Lokalisierung am führenden oder rückständigen Rand einer wandernden Zelle aufweisen, sowie vorübergehende Änderungen in Lokalisierung oder Aktivierung nach globalen Stimulation mit einer Lockstoffgradient zu zeigen. Um zu verstehen, die molekularen Mechanismen der anderen Arten von gerichtete Migration entwickelten wir eine Methode, die Untersuchung der zellulären Reaktion auf akute mechanische Stimulation basierend auf kurze (2 bis 5 s) Exposition, Flow zu scheren ermöglichen. Diese Stimulation kann in einem Kanal geliefert werden, während der Bildgebung Zellen Eindringmittel beschriftet Biosensoren untersuchen einzelne Zelle Verhalten zum Ausdruck zu bringen. Darüber hinaus kann Zellpopulation angeregt werden, in einen Teller, lysiert, und Immunoblotted mit Antikörpern, die aktive Versionen der interessierenden Proteine erkennen. Durch die Kombination beider Assays, kann man eine Vielzahl von Molekülen, die durch Veränderungen der subzellulären Lokalisierung und/oder Phosphorylierung aktiviert untersuchen. Mit dieser Methode haben wir festgestellt, dass akute mechanische Stimulation Aktivierung der chemotaktische Signal Transduction und Aktin Zytoskelett Netze auslöst. Die Möglichkeit zu prüfen, zelluläre Reaktionen auf akute mechanische Stimulation ist wichtig für das Verständnis der auslösenden Ereignisse notwendig für Scherung strömungsinduzierte Motilität. Dieser Ansatz bietet auch eine Tool für das Studium der chemotaktische Signal Transduction Netzwerk ohne verwirrende Einfluss des Lockstoffgradient-Rezeptors.

Zeitliche Reaktion der Chemotaxis Regulierungsbehörden auf akute mechanische stimulation
Um die Reaktion von D. Discoideum Zellen auf mechanische Stimulation zu beurteilen, wurden anhaftende Aggregation-kompetente Zellen einen kurzen Impuls von Schubfluss ausgesetzt. Zusammenfassung-kompetente D. Discoideum Zellen absondern, Lager, das von benachbarten Zellen zu spüren. Um den Beitrag der Zell-Zell-Signalisierung zu überwinden, wurden Zellen mit Koffein, behandelt die Adenylyl-Cyclase in D. Discoideum hemmt und verhindert so das cAMP Sekretion28. In der Tat Zellen vorbehandelt mit Koffein hatte sehr niedrigen basalen Aktivität der PKBR1 und ERK2 und zeigte einen robusten Anstieg der Phosphorylierung der wichtigsten Rückstände dieser Kinasen nach 5 s Stimulation mit Schubfluss (Abbildung 1A). Die Reaktion war vergänglich und Spitzen um 10-15 s für PKBR1 und rund 30 s für ERK2, ähnlich wie zuvor veröffentlichten Ergebnisse für die Aktivierung dieser Proteine mit einem Lockstoffgradient-7.
Obwohl es schwer ist zu beurteilen die Effizienz der Reaktion angesichts der niedrigen basalen, Vorstudien, die zur Entwicklung des Assays, führte im Vergleich Stimulation mit Schubfluss allein (oder mit einem Fahrzeug) zu scheren fließen in Anwesenheit von einem Lockstoffgradient Lager (Abb. 1 b). Diese Analyse zeigen keinen Anstieg in der Antwort am Lager, was darauf hindeutet, dass die Antwort von Signal Transduction Netzwerk Fluss Scherung gesättigt ist. Obwohl in diesem Assay cAMP nicht Phosphorylierung des PKBR1 zu erhöhen, kann der Zellen als Reaktion auf Lockstoffgradient beobachtet werden, mit einem standard Stimulation Protokoll wo sind Aggregation-kompetente Zellen in Suspension gehalten mit cAMP stimuliert und lysiert an verschiedenen Zeitpunkten nach Stimulation. Wie in Abbildung 1gezeigt, ist unter diesen Bedingungen ein vorübergehender Anstieg der PKBR1 Phosphorylierung Reaktion auf Lockstoffgradient, aber nicht Fahrzeug. Die Peak-Reaktion wird beobachtet, um 30 s in diesem Assay weil die Temperatur während des Tests die Zellsuspension ~ 9 ° C, im Vergleich zu mechanischen Stimulation Assay beschriebenen26~ 22 ° C.
Räumlich-zeitliche Reaktion des leading und lagging Rand Markierungen auf akute mechanische stimulation
Da die Bevölkerung Assay oben nur zeitliche Informationen über das Verhalten der Chemotaxis Regulierungsbehörden vorsieht, wurden Zellen auch auf einen kurzen mechanischen Reiz ausgesetzt, während mit einem Mikroskop beobachtet werden. Dieser Test kann durchgeführt werden, entweder mit Aggregation-kompetente oder vegetativen D. Discoideum Zellen mit dem Ausdruck verschiedener Eindringmittel beschriftet Biosensoren deren Lokalisierung in Zellen stimuliert mit einer Lockstoffgradient definiert wurde. Zwei führende Marker, PH-Domäne von Crac und KalkΔcoil, die von PIP3 oder neu polymerisiert Aktin rekrutiert werden, zeigte beide meist cytosolischen Lokalisierung in ruhende Zellen als bereits berichtet (Abbildung 2A, ergänzende Movie 1 )4,29. In Zellen, die basal aktiv waren, konnten diese Biosensoren auch an den Spitzen der die Scheinfüßchen gesehen werden. Anschluss an Stimulation mit Schubfluss für 2 s, der Biosensoren schnell deren zum Kortex mit einem Maximum bei ca. 6 bis 10 s, und kehrte nach dem Zytosol von ~ 30 s. Im Gegensatz dazu lokalisiert rückständigen Rand Marker PTEN an der Rinde vor Stimulation (Abbildung 2A). Nach einem kurzen Impuls mit Schubfluss cytosolischen PTEN Intensität erhöht, wenn auch mit langsameren Dynamik als für die Vorderkante Biosensoren. Eine Änderung der Biosensor Lokalisierung aus dem Zytosol der Kortex und umgekehrt, eine Änderung in der cytosolischen Intensität ermöglicht einfachen Quantifizierung der Antwort gilt als.
Das beobachtete Verhalten von Biosensoren in Reaktion auf akute mechanische Stimulation steht im Einklang mit leading und lagging Kante Lokalisierung Dynamik in Reaktion auf die Stimulation mit einheitlichen Lockstoffgradient. Dieses Verhalten war nicht nur für die drei Biosensoren gezeigt. Wie zuvor veröffentlichte, ähnliche Veränderungen bei der Lokalisierung auch für Vorderkante Marker RBD und RalGDS beobachtet wurden, aktiviert erkennen Ras und Rap1, beziehungsweise, sowie für einen weiteren rückständigen Rand Marker CynA22,30.
Ein ähnlicher Assay kann zur Beurteilung der Auswirkungen von verschiedenen Inhibitoren durch eine einfache Änderung des experimentellen Aufbaus aus einem einzigen Eingabezeile doppelt. Mit dieser Methode, können die Zellen zunächst Kontrolle Bedingungen ausgesetzt, und wechselte dann in den Puffer, der den gewünschten Test-Agents enthält. Z. B. Zugabe von Aktin-depolymerizing Droge LatA blockiert die Reaktion der RBD, sowie KalkΔcoil, akute mechanische Stimulation (Abb. 2 b).
Globale Antwort vorausgeht Zellwanderung unter längerer Stimulation mit Schubfluss
Der hier beschriebene Ansatz könnte auch Auswirkungen der Scherströmung auf D. Discoideum Migration studieren angepasst. In der Tat, wenn die Strömung nicht nach 2 abgeschaltet war s aber blieb für die Dauer des Experiments, vegetative Zellen zeigte Migration gegen die Strömung (Abbildung 3zusätzliche Movie 2) gerichtet. Anzumerken ist, dass der Schubfluss notwendig, eine wandernde Reaktion auslösen niedriger als der Druck, die in der Regel verwendet wurde war, um eine globale Antwort mit akuten Stimulation in den vegetativen Zellen zu erreichen (z. B. wie in Abbildung 2 b). Jedoch auch bei den niedrigeren Druck angezeigt Zellen eine starke einheitliche Reaktion an einer Veränderung in KalkΔcoil Lokalisierung, die vor eine Änderung in der Position der Zelle selbst. Diese Experimente zeigten somit deutlich, dass (1) die globale Reaktion nicht von der Bewegung der Zelle hängt, und (2) die globale Antwort gerichtete Migration vorausgeht.
Alternative Ansätze des Testens Reaktion auf akute mechanische stimulation
Obwohl die Verwendung von einem Durchströmungsraum deutliche Vorteile für die Untersuchung der Reaktion auf akute mechanische Stimulation hat, validiert wir auch zwei zusätzliche Tests zum Testen der Reaktion einzelner Zellen auf akute mechanische Stimulation. Wie in Abbildung 4dargestellt, KalkΔcoil schnell und vorübergehend wieder lokalisiert von der Zellflüssigkeit zum Kortex wenn Zellen durch Bolus Zugabe des Puffers geliefert entweder mit einer Mikropipette (Abbildung 4A) oder manuell mit Masse angeregt wurden Puffer zusätzlich mit einer Pipette (Abbildung 4 b). Es sei darauf hingewiesen, dass ein klarer Nachteil beider dieser Tests ist, dass der genaue Betrag der Querkraft an der Zelle geliefert unbekannt ist und kann nicht leicht variiert werden. Allerdings bietet Masse Puffer Ergänzung für Situationen wo Umschalten zwischen mechanische und chemische Reize gewünscht wird, eine solide Alternative auf die Stimulation in den Flow-Gerät.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56411/56411fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Vertreter ergibt sich auf akute mechanische oder chemische Stimulation für biochemische Bewertung der Antwort von D. Discoideum Zellen. Aggregation-kompetente Zellen wurden auf mechanische oder chemische Reize ausgesetzt., zu den angegebenen Zeitpunkten lysiert und Immunoblotted mit Antikörpern, die erkennen phosphoryliert, PKBR1 oder ERK2. (A) anhaftende Zellen wurden angeregt, auf einem Orbitalschüttler für 5 s. Die Membran war voller Flecken mit Coomassie Brilliant Blue (CBB), gleiche Protein laden zu zeigen. (B) anhaftende Zellen wurden angeregt durch manuelle Bewegung der Platte in gewissem Sinne kreuzweise für ca. 5 s folgenden chemischen Stimulation durch Zugabe von 1 µM cAMP oder Puffer (Fahrzeug) oder ohne chemische Stimulation (-). Die zwei Immunoblots zeigen das Ausmaß der Variation in der basalen Aktivierung der PKBR1 zum Zeitpunkt 0 gesehen. PKBA Aktivierung konnte gelegentlich auch durch diese Technik nachgewiesen werden, wie im unteren Fensterbereich dargestellt. (C) Suspendierung Zellen wurden mit 1 µM cAMP oder Puffer (Fahrzeug) angeregt. Teil (A) Diese Abbildung wurde von Artemenko Et al.modifiziert. (2016) 22. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56411/56411fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56411/56411fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Vertreter ergibt sich für akute mechanische Stimulation und live Imaging einzelner Zellen am Mikroskop. (A) Aggregation-zuständigen D. Discoideum Zellen mit dem Ausdruck ihrer RFP-Tags KalkΔcoil, oder PH-Crac GFP-Tags oder PTEN wurden angeregt mit unidirektionalen Laminar-Flow bei 15 dyn/cm2 für 2 bis 5 S. Bilder waren alle 3 gesammelt s . Repräsentative Zellen zeigen Translokation der Biosensoren in Reaktion auf mechanische Stimulation werden angezeigt. Ansammlung von jeder Biosensor an der Rinde wurde als die Umkehrung der mittlere zytoplasmatischen Intensität mal 0 normalisiert quantifiziert. Die durchschnittliche Antwort von 18 (Kalk-Δcoil), 20 (PH-Crac) oder 6 (PTEN) Zellen wird angezeigt. Werte sind ± se. (B) vegetativen Zellen mit dem Ausdruck RFP-Tags KalkΔcoilbedeuten - RFP und GFP-Tags RBD wurden behandelt mit Fahrzeug oder 5 µM LatA mindestens 15 min lang und dann stimuliert mit unidirektionalen Laminar-Flow bei 41 dyn/cm2 für 2 s. Bilder gesammelt wurden alle 3 s. RBD-GFP und KalkΔcoil- RFP Ansammlung an der Rinde wurde wie in (A) quantifiziert. Werte sind Mittelwert ± SE. Die Anzahl der Zellen analysiert ist neben jede Bedingung angegeben. Maßstabsleiste = 10 µm. Diese Zahl wurde von Artemenko Et Al. modifiziert (2016) 22. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56411/56411fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56411/56411fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Vertreter ergibt sich für die Antwort von D. Discoideum Zellen auf längere Stimulation mit Strom. (A) vegetativen Zellen mit dem Ausdruck RFP-Tags KalkΔcoil wurden kontinuierliche unidirektional Laminar-Flow bei 15 dyn/cm2 ausgesetzt und alle 3 S. Titel 11 Zellen abgebildet werden (B) gezeigt. Maßstabsleiste = 10 µm. Diese Zahl wurde von Artemenko Et Al. modifiziert (2016) 22. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56411/56411fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56411/56411fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Vertreter ergibt sich für alternative Ansätze zur Reaktion auf akute mechanische Stimulation testen. (A) Vegetative D. Discoideum Zellen mit dem Ausdruck ihrer RFP-Tags KalkΔcoil einer Mikropipette (*) basaler Freigabe Testpuffer mit einer langsamen Rate ausgesetzt waren. Ein kurzer Anstieg der Durchfluss wurde durch schnelle Lieferung eines Bolus Testpuffer zum Zeitpunkt 0 erreicht. Bilder wurden gesammelt, jeder 3 s. (B) Vegetative D. Discoideum Zellen mit dem Ausdruck RFP-Tags KalkΔcoil vernickelt als einen kleinen Tropfen in einer Mikroskopie-Kammer wurden mechanisch stimuliert durch Zugabe von eine große Menge an Puffer, um die Kammer. Bilder gesammelt wurden alle 3 s. Skala bar = 10 µm. Teil (A) Diese Abbildung wurde geändert von Artemenko Et Al. (2016) 22. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56411/56411fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergänzende Film 1: Akute mechanische Stimulation löst schnelle und flüchtige Translokation von Kalk-Δcoil- RFP oder PH-Crac-GFP aus dem Zytosol der Kortex in Aggregation-kompetente D. Discoideum Zellen mit dem Ausdruck dieser Biosensors. Unidirektionale Laminar-Flow war eingeschaltet für 5 s zum Zeitpunkt 0 und Zellen 3 s Abständen abgebildet waren. Wiedergabegeschwindigkeit ist 5 Bilder/s. Sehen Sie zwei Beispiele für jede Zelllinie. Maßstabsleiste = 10 µm. Dieser Film Figur 2A entspricht und von Artemenko Et Al. geändert wurde (2016) 22. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56411/Suppl_Mov_1_060417.avi">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Movie 2: Kontinuierliche mechanische Stimulation löst schnelle und flüchtige Translokation von Kalk-Δcoil- Ausschreibung aus dem Zytosol der Kortex vor der Migration der Zellen gegen die Fließrichtung. Vegetative Zellen, die mit dem Ausdruck KalkΔcoilwurden - RFP ausgesetzt kontinuierliche Schubspannung bei 15 dyn/cm2 ab zum Zeitpunkt 0 und 3 s Abständen abgebildet. Wiedergabegeschwindigkeit ist 10 Frames/s. Skala bar = 10 µm. Dieser Film entspricht Abbildung 3 und wurde zuvor in Artemenko Et Al. veröffentlicht (2016) 22. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56411/Suppl_Mov_2_060417.avi">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

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Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Bewertung von Dictyostelium Discoideum Reaktion auf akute mechanische Stimulation

Hier beschreiben wir Methoden zur Bewertung der zelluläre Reaktion auf akute mechanische Stimulation. In der Mikroskopie-basierten Test untersuchen wir Lokalisierung von Eindringmittel beschriftet Biosensoren nach kurzer Stimulation mit Schubfluss. Wir testen auch biochemisch Aktivierung verschiedener Proteine des Interesses in Reaktion auf akute mechanische Stimulation.

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

6.9K Aufrufe.  SUNY Oswego. Hier beschreiben wir Methoden zur Bewertung der zelluläre Reaktion auf akute mechanische Stimulation. In der Mikroskopie-basierten Test untersuchen wir Lokalisierung von Eindringmittel beschriftet Biosensoren nach kurzer Stimulation mit Schubfluss. Wir testen auch biochemisch Aktivierung verschiedener Proteine des Interesses in Reaktion auf akute mechanische Stimulation.

Serie: Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Mechanical Stimulation of Stem Cells Using Cyclic Uniaxial Strain

The role of mechanical forces in the development and maintenance of biological tissues is well documented, including several mechanically regulated phenomena such as bone remodeling, muscular hypertrophy, and smooth muscle cell plasticity. However, the forces involved are often extremely complex and difficult to monitor and control in vivo. To better investigate the effects of mechanical forces on cells, we have developed an in vitro method for applying uniaxial cyclic tensile strain to adherent cells cultured on elastic membranes. This method utilizes a custom-designed bioreactor with a motorized cam-rotor system to apply the desired force. Here we present a step-by-step video protocol demonstrating how to assemble the various components of each "stretch chamber", including, in this case, a silicone membrane with micropatterned topography to orient the cells with the direction of the strain. We also describe procedures for sterilizing the chambers, seeding cells onto the membrane, latching the chamber into the bioreactor, and adjusting the mechanical parameters (i.e. magnitude and rate of strain). The procedures outlined in this particular protocol are specific for seeding human mesenchymal stem cells onto silicone membranes with 10 &micro;m wide channels oriented parallel to the direction of strain. However, the methods and materials presented in this system are flexible enough to accommodate a number of variations on this theme: strain rate, magnitude, duration, cell type, membrane topography, membrane coating, etc. can all be tailored to the desired application or outcome. This is a robust method for investigating the effects of uniaxial tensile strain applied to cells in vitro.

It is widely understood that mechanical forces in the body can influence cell differentiation and proliferation. Here we present a video protocol demonstrating the use of a custom-built bioreactor for delivering uniaxial cyclic tensile strain to stem cells cultured on flexible micropatterned substrates.

Mechanische Stimulation von Stammzellen unter Verwendung cyclischer uniaxiale Dehnung

The role of mechanical forces in the development and maintenance of biological tissues is well documented, including several mechanically regulated ...

Forschung

Biologie

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Mit der optokinetischen Reaktion auf visuelle Funktion des Zebrafisch-Studie

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to investigate cells behavior at sub-cellular level with high spatial and temporal resolution was developed. Thus, an atomic force microscope (AFM) was integrated with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and fast-spinning disk (FSD) confocal microscopy. The integrated system is broadly applicable across a wide range of molecular dynamic studies in any adherent live cells, allowing direct optical imaging of cell responses to mechanical stimulation in real-time. Significant rearrangement of the actin filaments and focal adhesions was shown due to local mechanical stimulation at the apical cell surface that induced changes into the cellular structure throughout the cell body. These innovative techniques will provide new information for understanding live cell restructuring and dynamics in response to mechanical force. A detailed protocol and a representative data set that show live cell response to mechanical stimulation are presented.

This paper aims to instruct the reader in the operation of an integrated atomic force-optical imaging microscope for mechanical stimulation of live cells in culture. A step-by-step protocol is presented. A representative data set that shows live cell response to mechanical stimulation is presented.

Live Cell Reaktion auf mechanische Stimulation von Integrated Optical und Atomic Force Microscopy Studium

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Intravenöse Mikroinjektionen mit Zebrabärblingembryonen zu Acute Kidney Injury Study

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Imaging G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-vermittelten Signaltransduktion, die Steuerung der Chemotaxis Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy this deficiency, several medical interventions have been developed. One such method is to resurface the damaged area with tissue-engineered cartilage; however, the engineered tissue typically lacks the biochemical properties and durability of native cartilage, questioning its long-term survivability. This limits the application of cartilage tissue engineering to the repair of small focal defects, relying on the surrounding tissue to protect the implanted material. To improve the properties of the developed tissue, mechanical stimulation is a popular method utilized to enhance the synthesis of cartilaginous extracellular matrix as well as the resultant mechanical properties of the engineered tissue. Mechanical stimulation applies forces to the tissue constructs analogous to those experienced in vivo. This is based on the premise that the mechanical environment, in part, regulates the development and maintenance of native tissue1,2. The most commonly applied form of mechanical stimulation in cartilage tissue engineering is dynamic compression at physiologic strains of approximately 5-20% at a frequency of 1 Hz1,3. Several studies have investigated the effects of dynamic compression and have shown it to have a positive effect on chondrocyte metabolism and biosynthesis, ultimately affecting the functional properties of the developed tissue4-8. In this paper, we illustrate the method to mechanically stimulate chondrocyte-agarose hydrogel constructs under dynamic compression and analyze changes in biosynthesis through biochemical and radioisotope assays. This method can also be readily modified to assess any potentially induced changes in cellular response as a result of mechanical stimuli.

The biosynthesis of cartilaginous extracellular matrix by chondrocytes can be affected by application of mechanical stimuli. This method describes the technique of applying dynamic compressive strains to chondrocytes encapsulated in 3D constructs and the evaluation of induced changes in chondrocyte metabolism.

Mechanische Stimulation der Chondrozyten-Agarose Hydrogele

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the brain, liver, retina, cochlea and vasculature. In experimental settings, intercellular Ca2+-waves can be elicited by applying a mechanical stimulus to a single cell. This leads to the release of the intracellular signaling molecules IP3 and Ca2+ that initiate the propagation of the Ca2+-wave concentrically from the mechanically stimulated cell to the neighboring cells. The main molecular pathways that control intercellular Ca2+-wave propagation are provided by gap junction channels through the direct transfer of IP3 and by hemichannels through the release of ATP. Identification and characterization of the properties and regulation of different connexin and pannexin isoforms as gap junction channels and hemichannels are allowed by the quantification of the spread of the intercellular Ca2+-wave, siRNA, and the use of inhibitors of gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-wave in monolayers of primary corneal endothelial cells loaded with Fluo4-AM in response to a controlled and localized mechanical stimulus provoked by an acute, short-lasting deformation of the cell as a result of touching the cell membrane with a micromanipulator-controlled glass micropipette with a tip diameter of less than 1 &mu;m. We also describe the isolation of primary bovine corneal endothelial cells and its use as model system to assess Cx43-hemichannel activity as the driven force for intercellular Ca2+-waves through the release of ATP. Finally, we discuss the use, advantages, limitations and alternatives of this method in the context of gap junction channel and hemichannel research.

Intercellular Ca2+-waves are driven by gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-waves in cell monolayers in response to a local single-cell mechanical stimulus and its application to investigate the properties and regulation of gap junction channels and hemichannels.

Mechanische Stimulation induzierte Calcium Wellenausbreitung in Zellmonoschichten: Das Beispiel Bovine Endothelzellen

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular development program, during which single cells chemotax towards aggregation centers1-4. This process is dependent on the release of cyclic adenosine monophosphate (cAMP)5. cAMP is produced in waves through the concerted action of adenylate cyclase and phosphodiesterases, and binds to G protein-coupled cAMP receptors6,7. A widely used assay to analyze the mechanisms involved in the developmental cycle of the lower eukaryote Dictyostelium discoideum is based on the observation of cell aggregation in submerged conditions8,9. This protocol describes the analysis of the role of coronin A in the developmental cycle by starvation in tissue-culture plates submerged in balanced salt solution (BSS)10. Coronin A is a member of the widely conserved protein family of coronins that have been implicated in a wide variety of activities11,12. Dictyostelium cells lacking coronin A are unable to form multicellular aggregates, and this defect can be rescued by supplying pulses of cAMP, suggesting that coronin A acts upstream of the cAMP cascade10. The techniques described in these studies provide robust tools to investigate functions of proteins during the initial stages of the developmental cycle of Dictyostelium discoideum upstream of the cAMP cascade. Therefore, utilizing this aggregation assay may allow the further study of coronin A function and advance our understanding of coronin biology.

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

Die Untersuchung der Funktion von Coronin A in der frühen Starvation Reaktion von<em&gt; Dictyostelium discoideum</em&gt; Durch Aggregationstests

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

Analyse Zelloberflächenhaftung Remodeling in Reaktion auf mechanische Spannung Mit Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...