Supported by NIH award R01 DK093525 (GFG). We greatly appreciate the scientific review and grammatical editing of the manuscript by Dr. Amber Shaffer (University of Pittsburgh) and thank Michael Burcham for assistance in preparation of figures.

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde überprüft und von der University of Pittsburgh Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. Herstellung von modifiziertem Krebs-Lösung und Test-Arzneimittel Aliquots <ol><li> Make 6 L modifizierte Krebs-Lösung, die (in mM) enthält: 117,9 NaCl, 4,7 KCl, 25 NaHCO 3, 1,3 NaH 2 PO 4, 1,2 MgSO 4, 2,5 CaCl 2, 11.1 D-Glucose, 2 Natriumbutyrat 20 Natriumacetat , 0,004 Nifedipin (spontane Muskelkontraktionen blockieren) und 0,003 Indometacin (die Synthese von endogenem Prostaglandin blockieren). Verwenden eiskalt und warmen Krebs Lösungen für Gewebedissektion und Einzelfaser-Aufnahme auf. </li><li> Bereiten keine chemischen Lösungen (zB, IS, Capsaicin, ATP) in Aliquots bei gewünschten Konzentrationen. </li></ol> 2. Dissektion der Kolorektums-Nervengewebe <ol><li> Betäuben und euthanize männliche Mäuse (6 - 8 Wochen alt, 20 - 30 g) inein CO 2 Kammer mit einer Strömungsgeschwindigkeit, die mit 10 verdrängt - 30% des Kammervolumens pro Minute bis Mäusen atmen aufhören vollständig wie durch das Fehlen von Brustbewegung angegeben. </li><li> Unmittelbar nach Euthanasie, exsanguinate durch Aufschneiden der Thoraxkammer, Perforation des rechten Vorhofs und das Eintauchen der Maus Karkasse in einem großen Volumen (~ 500 ml) eiskaltem Krebs (4 ° C) Lösung geblasen mit Carbogen (95% O 2 und 5% CO 2). </li><li> Alle inneren Organe, sondern auch die Dickdarm-und Beckenorgane vorsichtig entfernen. Transekt mit der Maus in die Hälfte über dem Wirbelsegment T12 leicht über dem Zwerchfell und übertragen Sie die Schwanz Hälfte zu einer Dissektion Kammer, eiskalt, sprudelte Krebs-Lösung. </li><li> Unter einem Stereomikroskop, entfernen Sie die Blase und die Fortpflanzungsorgane durch Durchtrennung an ihren Verbindungsstellen an der Harnröhre, und entfernen Sie den absteigenden / Bauchaorta, bis sie in gemeinsamen Beckenarterien gabelt. Befreien Sie den PN oder die LSN von ihren surrounding Gewebe stumpf und folgen Sie den Nerv von außerhalb des Beckenkamm bis zu seiner ventralen Einstieg in die L6 und S1 Wirbelsäule (PN) oder T13 und L1 Wirbelsäule (für LSN). </li><li> Schneiden Sie die Symphyse und rechts und links Pfannen Gelenke, und entfernen Sie das Darmbein. Sorgfältig kostenlos entweder die PN oder LSN aus dem beigefügten Muskels und des Bindegewebes aus der Nähe des colorectal, bis wo der Nerv in die Wirbelsäule. </li><li> Sorgfältig Resektion des Darmbein, um den distalen Kolorektums aussetzen. Präparieren Sie die distale Kolorektums mit dem angebrachten PN oder LSN im Kontinuum. </li><li> Übertragen Sie die Kolorektums mit dem Nerv in das Bad Fach der Gewebekammer angebracht. Überschüssiges Bindegewebe durch weitere Dissektion, und öffnen Sie die Kolorektums Längsrichtung entlang des Anti mesenterialen Grenze. </li><li> Mit Schleimhautseite nach oben, stecken Sie die mesenterialen Rand des Kolorektums neben dem Aufnahmeraum in die Silikonbasis der chamber und befestigen Sie den antimesenteriale Länge des Kolorektums an einen Rake von Haken mit einem Kraftstellglied verbunden (in Abbildung 1 veranschaulicht und in 2A fotografiert). </li><li> Erweitere PN oder LSN in die Aufnahmefach, das zu dem Bad Raum durch eine Mausloch und dem Gate verbunden ist. Legen Sie vorsichtig den Nervenstamm auf einen kleinen Glasspiegel im Aufnahmeraum, der eine hydrophile Oberfläche für den Mut, zu halten bietet. Superfuse das Baderaum mit warmem (30 bis 32 ° C), mit Sauerstoff angereicherte Krebs-Lösung und füllt die Aufnahmefach mit Mineralöl. </li></ol> 3. Einzelfaser-Aufnahme und Lokalisierung der rezeptiven Feld <ol><li> Schieben Sie vorsichtig die Epineurium (Nervenscheide) der PN oder LSN unter dem Stereomikroskop bei hoher Vergrößerung (50 - 60X). Mit einer feinen Pinzette, necken den Nervenstamm in 5-8 Nervenbündel von ~ 100 &amp; mgr; m Dicke. </li><li> Legen Sie die Platin-Iridium-ReferenzElektrode in Kontakt mit dem Krebs-Lösung in das Gewebe Kammer. Sequentielles Platzieren der einzelnen Nervenbündel auf die Aufzeichnungselektrode aus dem gleichen Material hergestellt. </li><li> Mit einem weichen Pinsel, um APs von den Dick Afferenzen durch sanft streichelte oben und unten der kolorektalen Oberfläche hervorrufen. Suchen Sie den Nervenbündels (n), die den Doppelpunkt durch nachweisbare AP (Aktionspotential) Aufnahmen innervieren. HINWEIS: Die PN und LSN auch die Harnblase und andere Beckenorgane innervieren. </li><li> Verwenden Sie ein Paar 30 G Nadelspitzen weiter zu spalten die Nervenbündels in feine Faszikel Filamente ~ 10 &amp; mgr; m Dicke und legen Sie einen individuellen Filament auf die Aufzeichnungselektrode. </li><li> Legen Sie die rund Spitze konzentrischen Elektrode senkrecht zur Schleimhautoberfläche zu afferenten Enden am Überschwellenreizstärke (10 mA Stärke, 0,5 ms Dauer @ 0,3 Hz), die eine mm Radius von aktuellen Ausbreitung ~ 2 produziert elektrisch erregt. Bewegen Sie den Elektroden systematisch (~ 1,5 mm Schritten) Entlang der Länge und Breite des abgeflachten colorectum empfänglich Digungen lokalisieren. </li><li> Wenn ein afferenten Ende ist aufgeregt, stellen Sie die Elektrodenposition, um den Ort der Aktivierung (rezeptiven Feld, HF), die minimale Reizstärke (Reizschwelle) erfordert genau zu bestimmen. Entsorgen Enden mit einer Reizschwelle&gt; 3 mA 19. </li><li> Berechnen der Leitungsgeschwindigkeit (CV) von 1) der Abstand zwischen der Stimulationselektrode an dem Empfangsfeld (RF) und der Aufzeichnungsstelle, und 2) die Leitungsverzögerung (zB, 2B) zwischen dem Reizartefakt und dem Einsetzen des Aktionspotentials . CV (m / sec) = Abstand (mm) / Leitungsverzögerung (msec). </li></ol> 4. Funktions Einstufung mechanosensitiven Colorectal Afferenzen <ol><li> Nach dem Auffinden eines RF durch elektrische Stimulation, gelten die folgenden drei mechanische Reize an den HF: <ol><li> Führen Sie die Sondierung Reiz, indem Sie die Spitze eines calibrated von Frey-like Nylonmonofilament (0,4 und 1 g Kraft), die senkrecht auf die RF auf der abgeflachten Kolorektums. </li><li> Führen Sie den Reiz von streichelte sanft streichelte den kolorektalen Schleimhaut mit einer feinen Nylonfaden Strang (10 mg Kraft), eine kleine Oberflächenscherspannung an der RF zu erzeugen. </li><li> Führen Sie die Umfangsdehnung mit Hilfe eines computergesteuerten Kraftantrieb, die eine rampenförmige Strecke Kraft liefert (0-170 mN bei 5 mN / sec) in Umfangsrichtung entlang der Anti mesenterialen Rand des Kolorektums über den Rechen des in Schritt 2.8 beschrieben Haken . </li></ol></li><li> Bewerte Afferenzen als Serosa (reagieren nur auf stumpf Sondieren), Schleimhaut (reagieren auf Schleimhaut streicheln und stumpf Sondieren), muskulös (zum Umfangsdehnung reagieren und stumpf Sondieren) Muskel / Schleimhaut (zum Umfangsdehnung, Schleimhaut Streicheln reagieren und stumpf Sondieren), oder MIA (nicht in Reaktion auf jede der drei mechanischen Reizen). </li><li> Für mesenterialen Afferenzen (nur indie LSN Innervation), die schwierig sind, um selektiv durch elektrische Stimulation zu aktivieren, suchen ihre rezeptiven Enden durch mechanische Streicheln / Sondierung des Mesenteriums. </li><li> Für Stretch-sensitive Afferenzen (Muskel-und Muskel-Schleimhaut), bestimmen die Ansprechschwelle, die als die Kraft, die die erste AP während der geneigte Strecke erinnert definiert ist. </li><li> Für serösen Afferenzen, notieren ihre Antworten auf aufsteigend Ebenen der punktförmige Sondieren des rezeptiven Feldes durch die computergesteuerte Kraftstellglied angetrieben. </li></ol> 5. Chemische Anwendung / Modulation der Empfang Endings <ol><li> Zeichnen Sie eine Baseline-Reaktion auf einen mechanischen Reiz (dh Reaktion auf geneigten Strecke, punktförmige Sondieren oder Schleimhaut Streicheln). </li><li> Bestreichen Sie die Unterkante eines Schlauchstück (Messing oder Edelstahl, 10 mm Höhe und 4 x 4 mm 2 quadratisch oder 4-5 mm Durchmesser) mit Vaseline und legen Sie es über dem rezeptiven Feld auf der Kolorektums. </li><li> Entfernendie Krebs-Lösung im Inneren des Schlauchs, und setzen die aufnahme Endung für 3 - 5 min zu 170 ul der Lösung, die die Chemikalie (n) zu prüfen. </li><li> Beobachten Sie die Reaktion des afferenten bei der chemischen Anwendung (einige Afferenzen sind chemosensitiven). </li><li> Entfernen Sie die chemische Lösung und die Schläuche, die Wirkung der chemischen beenden. In 4 - 6 min, testen die afferenten Reaktion auf denselben mechanischen Stimulus, wie in der Grundreaktion. </li><li> Wenden Sie die mechanischen Reiz wieder nach ausreichenden Zeitraum Auswaschen (&gt; 15 min). </li></ol> 6. Aufnahme und Diskriminierende AP Spikes <ol><li> Digitalisieren der elektrischen Signale von Axonen bei 20 kHz aufgenommen und speichern Sie die Daten auf einen Computer. Überwachen Sie die Signal online durch eine Audio-Überwachung. </li><li> Analysieren Sie die AP Spitzen off-line und diskriminieren einzelne Einheiten basierend auf der Hauptkomponentenanalyse einzelner Dorn 25 Wellenformen. HINWEIS: Ein Datensatz sollte nicht mehr th enthaltenein zwei leicht unterscheidbar aktiven Einheiten. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die hier beschriebene in vitro-Nerven Kolorektums Vorbereitung hat sich als leistungsfähiges Konzept für neuronale Kodierung Funktionen einzelner kolorektalen Afferenzen, die schön ergänzt andere nicht-funktionale Ansätze (zB Zell-, Molekular- und histologische Untersuchungen) auf viszeralen sensorischen Neuronen (studieren siehe Bewertung 27 für Details). Neuronalen Mechanismen Beitrag zur Nozizeption und langfristig colorectal Überempfindlichkeit festgestellt worden sind und pharmak...

Schmerzüberempfindlichkeit sind die vorherrschenden Beschwerden von Patienten mit funktionellen gastrointestinalen Störungen einschließlich Reizdarmsyndrom (IBS), die in Abwesenheit des sichtbaren pathobiologischen Ursache oder Gewebeschäden vorliegen. Zum Beispiel weisen IBS-Patienten Überempfindlichkeit, einschließlich erhöhter Antworten auf rektale Ballon Spannungsgefühl und erhöhte Empfindlichkeit während des normalen Darmfunktion sowie Überempfindlichkeit der somatischen Weisung (dh Druckschmerz im Bauchbereich) 1. Da Targeting kolorektalen Afferenzen hat sich als wirksam bei der Linderung von Schmerzen und Überempfindlichkeit in IBS-Patienten (zB intrarektale Einträufeln von Lokalanästhetika 2,3; orale Aufnahme des Guanylatzyklase-C-Agonisten linaclotide 4-6) sein, ein besseres Verständnis der afferenten Innervation Kolorektum ist wichtig. Visceral Afferenzen, darunter Dickdarm- AfferenzenIn der Lage sind zu reagieren, um chemische / Nähr- und thermischen Behandlungsformen (zum Beispiel 7-9). Allerdings viszerale Afferenzen Reaktion auf mechanische Reize (dh mechanosensitive Afferenzen) waren die am besten untersuchte, weil mechanische Reize (zB Lumen Blähungen, Dehnung) sind diejenigen, die in der Regel führen zu bewussten Empfindungen, einschließlich Beschwerden und Schmerzen 10-16. Darüber hinaus werden die Eingeweide auch mechanisch unempfindlich Afferenzen (MIAs) innerviert, allgemein als stille oder Schlaf Nozizeptoren 17. Unter normalen physiologischen Bedingungen, müssen MIAs nicht auf mechanische Reize reagieren und haben eine sehr hohe Ansprechschwellen 18, sondern kann aktiv werden und erwerben Mechanosensitivität in pathophysiologischen Bedingungen und dazu beitragen, Überempfindlichkeit. Unter Verwendung der in vitro Herstellung und hier beschriebene Protokoll, entwickelt und verwendet ein elektrisches Stimulus-Strategie in See wir<html> rch für aufnahmeEnden und ermöglicht unvoreingenommene Identifizierung der beiden mechanosensitive und MIA Enden in der Kolorektums 19. Das kolorektale Innervation aus Lenden splanchnischen (LSN) und Beckennerv (PN) Wege abgeleitet und enthält kolorektalen Afferenzen, die in fünf mechanosensitive Klassen (seröse, Schleimhäute, muskulös, Muskel-Schleimhaut, mesenterialen) und eine MIA-Klasse 20 eingestuft werden können. Mit dieser In-vitro-Vorbereitung, fanden wir, dass kolorektalen MIAs erworben Mechanosensitivität (Sensibilisierung) nach kurzzeitiger ihres rezeptiven Felder zu einer entzündlichen Suppe (IS), die 71% der MIAs in der PN-Bahn und 23% der MIAs im LSN Weg sensibilisiert 19. Wir haben auch dokumentiert Langzeitsensibilisierung (bis 28 Tage) von MIA in Zusammenhang mit langanhaltenden Verhaltens viszerale Hypersensitivität (dh in Mäusen intrakolische Behandlungen mit Zymosan 21 oder 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) 22) . jove_content &quot;&gt; Unter mechanosensitive Afferenzen, muskulös und Muskel-Schleimhaut-Afferenzen sind die einzigen Klassen, die tonisch kodieren Umfangsdehnung des colorectal (dh sind Stretch-und Kleinschreibung) und dienstbar die Kodierung der schädlichen kolorektale Dehnung 23,24. Mit Hilfe eines computergesteuerten Kraftaktuator wir mit einem Standard, homogene und reproduzierbare gefahren Dehnung in der Umfangsrichtung des abgeflachten kolorektales Gewebe und weiter kategorisiert dehnungsempfindlichen Afferenzen als Niedrigschwellenwert und hohem Schwellenwert 23. Darüber hinaus den Zeitverlauf der Sensibilisierung von Dehnungs sensitive Afferenzen nach intrakolische Zymosan 21 oder TNBS 22 Behandlung entspricht der Beginn, Ausdauer, und / oder Wiederherstellung von Verhaltens viszerale Hypersensitivität, was auf eine Rolle von Dehnungsempfindlichen Dick Afferenzen in viszeralen Schmerzen und Überempfindlichkeit.

<table><tbody><tr><td>Leica MZ16 stereo microscope</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica IC D camera</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>World Precision instruments, Inc.</td><td>SYS-DAM80</td><td>Low-noise differential amplifier</td></tr><tr><td>Two-compartment tissue chamber</td><td>Custom made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power1401</td><td>Cambridge Electronic Design Limited</td><td>Power1401</td><td>Data acquisition, analog signal input/out</td></tr><tr><td>Spike2 v5.02</td><td>Cambridge Electronic Design Limited</td><td></td><td>Software package that works with the Power1401</td></tr><tr><td>Audio monitor</td><td>Natus</td><td>Am 8</td><td></td></tr><tr><td>Square pulse stimulator</td><td>Natus</td><td>S48</td><td>To deliver electrical stimuli</td></tr><tr><td>Photoelectric isolation unit</td><td>Natus</td><td>PSIU6</td><td>Stimulus isolation to reduce noise</td></tr><tr><td>Concentric bipolar microelectrode</td><td>FHC Inc.</td><td>CBFFG75</td><td>To deliver electrical stimuli</td></tr><tr><td>Dual-mode lever system</td><td>Aurora Scientific Inc.</td><td>Series 300C</td><td>To deliver mechanical stimuli</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Forceps with fine tips</td></tr></tbody></table>

in vitro functional characterization of mouse colorectal afferent endings

Dieses Video zeigt im Detail ein in vitro-Einzelfaser elektrophysiologische Ableitung Protokoll mit einer Maus Kolorektums-Nerven Vorbereitung. Der Ansatz ermöglicht unvoreingenommene Identifizierung und funktionelle Charakterisierung einzelner kolorektalen Afferenzen. Extrazelluläre Ableitungen von propagierten Aktionspotentiale (APs), die von einem oder wenigen afferenten stammen (dh Einzelfaser) rezeptiven Felder (RFS) in Kolorektum aus gehänselt Nervenfaser Faszikel gemacht. Die Kolorektums ist entweder mit dem Becken (PN) oder Lenden splanchnischen (LSN) Nerven befestigt und in Längsrichtung geöffnet entfernt. Das Gewebe wird in einer Aufnahmekammer gebracht, fixiert flach und mit Sauerstoff angereichertem Krebs-Lösung perfundiert. Brenn elektrischen Stimulation verwendet, um die kolorektale afferenten Endungen, die durch drei verschiedene mechanische Stimuli getestet lokalisieren (blunt Sondieren, Schleimhaut Streichen und Umfangsdehnung) funktionell zu kategorisieren Afferenzen in fünf mechanosensitive Klassen. Endings Reaktion auf keine dieser mechanische Reize werden als mechanisch unempfindlich Afferenzen (MIAs) kategorisiert. Sowohl mechanosensitive und MIAs kann Sensibilisierung (dh, verbesserte Reaktion, reduziert Schwelle und / oder Erwerb von Mechanosensitivität) bewertet werden, indem die lokale Exposition des RFs Chemikalien (zB entzündliche Suppe (IS), Capsaicin, Adenosintriphosphat (ATP)). Wir beschreiben die Geräte und Kolorektums-Nerven Aufnahme Vorbereitung, Ernte Kolorektums mit angeschlossenem PN oder LSN, die Identifizierung von RFs im Kolorektums, Einzelfaser-Aufnahme von Nervenfaszikel und lokalisierte Anwendung von Chemikalien auf die RF. Außerdem werden Probleme der Herstellung und Anwendung von standardisierten mechanischen Stimulation ebenfalls diskutiert.

Der Aufbau ist in Abbildung 1 dargestellt ist. Es umfasst eine maßgeschneiderte Gewebekammer, die die colorectum in einem Silikon-Bad ausgekleideten Kammer und der beigefügten Nerv in einem zusammenhängenden Mineralöl gefüllten Abteil untergebracht ist. Die Zwei-Kammer-Kammer wurde aus einem massiven Block aus Acrylkunststoff mit einer CNC-Maschine bearbeitet; der Boden der beiden Kompartimenten wurde anschließend mit festen Silikon ausgekleidet, um einfach Stift nach unten des kolorektalen Gewebe...

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In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

In-vitro-Funktionelle Charakterisierung von Maus Colorectal Afferente Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

in-vitro-functional-characterization-mouse-colorectal-afferent

Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

9.5K Aufrufe.  University of Pittsburgh. This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation. 

Serie: In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

Flexible Colonoscopy in Mice to Evaluate the Severity of Colitis and Colorectal Tumors Using a Validated Endoscopic Scoring System

The use of modern endoscopy for research purposes has greatly facilitated our understanding of gastrointestinal pathologies. In particular, experimental endoscopy has been highly useful for studies that require repeated assessments in a single laboratory animal, such as those evaluating mechanisms of chronic inflammatory bowel disease and the progression of colorectal cancer. However, the methods used across studies are highly variable. At least three endoscopic scoring systems have been published for murine colitis and published protocols for the assessment of colorectal tumors fail to address the presence of concomitant colonic inflammation. This study develops and validates a reproducible endoscopic scoring system that integrates evaluation of both inflammation and tumors simultaneously. This novel scoring system has three major components: 1) assessment of the extent and severity of colorectal inflammation (based on perianal findings, transparency of the wall, mucosal bleeding, and focal lesions), 2) quantitative recording of tumor lesions (grid map and bar graph), and 3) numerical sorting of clinical cases by their pathological and research relevance based on decimal units with assigned categories of observed lesions and endoscopic complications (decimal identifiers). The video and manuscript presented herein were prepared, following IACUC-approved protocols, to allow investigators to score their own experimental mice using a well-validated and highly reproducible endoscopic methodology, with the system option to differentiate distal from proximal endoscopic colitis (D-PECS).

Over the past few years, new generation endoscopes have emerged as important diagnostic research aids for evaluating murine colitis and colorectal tumors. We present herein a detailed protocol for endoscopic assessment of inflammation and colorectal tumors in mice, as well as a novel scoring system that uses decimal identifiers to document the endoscopic severity of colitis and colorectal tumors.

Flexible Koloskopie in der Maus, um die Schwere der Colitis und kolorektalen Tumoren auswerten mit einem validierten Endoskopische Scoring System

The use of modern endoscopy for research purposes has greatly facilitated our understanding of gastrointestinal pathologies. In particular, experimental ...

Forschung

Medizin

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

Ein<em&gt; In-vitro</em&gt; Vorbereitung von isolierten Neuronen und Glia Enteric vom Plexus myentericus der erwachsenen Maus

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Neurowissenschaften

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The technique is very cost-effective and easily undertaken with materials commonly found in most electrophysiology laboratories, or easily purchased. The dissection is simple and fast, with the mechanical displacement provided by a generic electroceramic wafer controlled by proprietary software. The same software also records and analyses the electroneurogram output. The recording of the evoked nerve activity is through a commercial differential amplifier connected to fire-polished standard glass microelectrodes. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the stimulation and the recording conditions to optimize recording quality. The system is suitable for assaying the electrophysiological and optical properties of lanceolate terminals of palisade endings of hair follicles, as well as the outcomes from their pharmacological and/or genetic manipulation. An example of combining electrical recording with mechanical stimulation and labeling with a styryl pyridinium vital dye is given.

A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

Kombinierte Aufnahme von Mechanisch Stimulated Afferent Output und Nervenendigung Kennzeichnung Maus Haarfollikel Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the different organ systems from the periphery towards the central nervous system. As such, the increased activity or &#39;sensitization&#39; of mesenteric afferent nerves has been allocated an important role in the pathophysiology of visceral hypersensitivity and abdominal pain syndromes.
Mesenteric afferent nerve activity can be measured in vitro in an isolated intestinal segment that is mounted in a purpose-built organ bath and from which the splanchnic nerve is isolated, allowing researchers to directly assess nerve activity adjacent to the gastrointestinal segment. Activity can be recorded at baseline in standardized conditions, during distension of the segment or following the addition of pharmacological compounds delivered intraluminally or serosally. This technique allows the researcher to easily study the effect of drugs targeting the peripheral nervous system in control specimens; besides, it provides crucial information on how neuronal activity is altered during disease. It should be noted however that measuring afferent neuronal firing activity only constitutes one relay station in the complex neuronal signaling cascade, and researchers should bear in mind not to overlook neuronal activity at other levels (e.g., dorsal root ganglia, spinal cord or central nervous system) in order to fully elucidate the complex neuronal physiology in health and disease.
Commonly used applications include the study of neuronal activity in response to the administration of lipopolysaccharide, and the study of afferent nerve activity in animal models of irritable bowel syndrome. In a more translational approach, the isolated mouse intestinal segment can be exposed to colonic supernatants from IBS patients. Furthermore, a modification of this technique has been recently shown to be applicable in human colonic specimens.

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

Mesenteric afferent nerves convey information from the gastrointestinal tract towards the brain regarding normal homeostasis as well as pathophysiology. Gastrointestinal afferent nerve activity can be assessed by mounting isolated intestinal segments with attached afferent nerves into an organ bath, isolating the nerve, and assessing basal as well as stimulated activity.

In - vitro - Aufnahme von Mesenteriale afferenten Nervenaktivität in Maus - Jejunal und Kolon - Segmente

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory bowel diseases and diabetes. Here, we describe a protocol for the in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferents in rats. The colorectum, with the intact pelvic ganglion (PG) attached, is removed from the rat; superfused with carbogenated Krebs solution in the recording chamber; and cannulated at the oral and anal ends to allow for distension. A fine nerve bundle emanating from the PG is identified, and the multiunit afferent nerve activity is recorded using a suction electrode. Distension of the colonic segment elicits gradual increases in multiunit discharge. A principal component analysis is conducted to differentiate the low-threshold, the high-threshold, and the wide-dynamic range afferent fibers. Chemical sensitivity of colonic afferents can be studied through the bath or intraluminal administration of test compounds. This protocol can be modified for application to other species, such as mice and guinea pigs, and to study the differences in the electrophysiological properties of thoracolumbar/hypogastric and lumbosacral/pelvic afferents of the descending colon in normal and pathological conditions.

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Abnormal sensory function underlies visceral pain and other symptoms of functional and inflammatory bowel diseases. A protocol for the electrophysiological recording of the colonic afferent nerves in an ex vivo rat colorectum preparation is presented here.

In-vitro- Charakterisierung der elektrophysiologischen Eigenschaften des Kolon afferenten Fasern in Ratten

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

Advanced Imaging of Dorsal Root Ganglion Neurons for Sensory Modality Research

In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the protocol for in vivo calcium imaging of the exposed DRG in response to various visceral and somatic stimuli. Pirt-GCaMP6s mice or C57BL6 mice intrathecally injected with AAV viruses packaged with GCaMP6s were utilized to capture Ca2+ transients. The amplitude of these transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. Afferent fibers originate from internal organs, with primary neuronal cell bodies in spinal or vagal ganglia. Studies on visceral nociception and acupuncture analgesia can potentially be conducted on primary sensory neurons using advanced imaging technologies like in vivo calcium imaging, allowing for the recording of neuronal activity ensembles in the intact animal during stimulation or intervention. The responses of DRG neuron ensembles to somatic and visceral stimuli applied to their corresponding receptive fields were recorded. This technique illustrates how neuronal populations react to various types of somatic and visceral stimuli. It is possible to comprehensively compare neuronal ensemble responses to different stimuli, which is a particularly valuable approach in research on visceral pain and segmental mechanisms of somatic stimulation, such as acupuncture.

The present protocol outlines in vivo calcium imaging for measuring the responses of ensembles of lumbar-6 DRG neurons to somatic and visceral stimuli. Thorough comparisons can be made among neurons responding to different stimuli. This protocol is valuable for investigating mechanisms of visceral pain and somatic stimulation, such as acupuncture.

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the ...

Functional Assessment of Intestinal Tight Junction Barrier and Ion Permeability in Native Tissue by Ussing Chamber Technique

The Ussing chamber technique was first invented by the Danish scientist Hans Ussing in 1951 to study the transcellular transport of sodium across frog skin. Since then, this technique has been applied to many different tissues to study the physiological parameters of transport across membranes. The Ussing chamber method is preferable to other methods because native tissue can be used, making it more applicable to what is happening in vivo. However, because native tissue is used, throughput is low, time is limited, and tissue preparation requires skill and training. These chambers have been used to study specific transporter proteins in various tissues, understand disease pathophysiology such as in Cystic Fibrosis, study drug transport and uptake, and especially contributed to the understanding of nutrient transport in the intestine. Given the whole epithelial transport process of a tissue, not only transepithelial pathways, but also paracellular pathways are important. Tight junctions are a key determinant of tissue specific paracellular permeability across the intestine. In this article, the Ussing chamber technique will be used to assess paracellular permselectivity of ions by measuring transepithelial conductance and dilution potentials.

Intestinal epithelium confers not only nutrient absorption but protection against noxious substances. The apical-most epithelial intercellular junction, i.e., the tight junction, regulates paracellular solute and ion permeability. Here, a protocol for the preparation of mucosal sheets and assessment of the ion selectivity of tight junctions using Ussing chamber technique is described.

Funktionelle Beurteilung der intestinalen Tight-Junction-Barriere und der Ionenpermeabilität im heimischen Gewebe durch Ussing-Chamber-Technik

The Ussing chamber technique was first invented by the Danish scientist Hans Ussing in 1951 to study the transcellular transport of sodium across frog ...

Biologie

Generation of Mouse Proximal Colon Loop Model: A Surgical Procedure to Generate Proximal Colon Loop and Measure Intestinal Permeability by Detection of Fluorescent Markers in Serum Following Intraluminal Injection

Source: Boerner, K. et al. <a href="https://www.jove.com/v/62093">Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model.</a> J. Vis. Exp. (2021).
In this video, we describe a surgical procedure to generate mouse proximal colon loop or pcLoop segment followed by intraluminal injection of fluorescent markers into the segment to study the intestinal epithelial permeability.

Generierung eines proximalen Dickdarmschleifenmodells der Maus: ein chirurgisches Verfahren zur Erzeugung einer proximalen Dickdarmschleife und zur Messung der intestinalen Permeabilität durch Nachweis von Fluoreszenzmarkern im Serum nach intraluminaler Injektion

Source: Boerner, K. et al. Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Rodent Models

Adult

Electrophysiological Recording from Colonic Afferent Nerves in an Ex Vivo Rat Colon

Source: Meng, Y. et al., <a href="https://app.jove.com/v/56090">In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates a method to record the activity of colonic afferent nerves in an ex-vivo rat colon, cannulated at both ends and infused with saline to increase intraluminal pressure. As pressure increases, the nerve signal rises, indicating its stimulation.

Elektrophysiologische Aufzeichnung von zuvorkommenden Nervus des Dickdarms in einem ex vivo Dickdarm der Ratte

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Neuroscience

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in an Ex Vivo Mouse Jejunum Segment

In this procedure, using a micromanipulator, lower the tip of the suction electrode into the organ bath. Then, gently aspirate some Krebs solution from the organ bath so that the tip of the electrode is submerged in the Krebs solution. Ensure that the Krebs solution covers the wire electrode inside the suction electrode.
Next, position the tip of the suction electrode immediately next to the transected afferent nerve strand, and draw the transected nerve strand into the capillary over its entire length. Maneuver the tip of the electrode towards the adipose tissue, and aspirate it into the glass capillary with the plunger, thereby mechanically sealing the nerve in the capillary from the contents of the organ bath.
To verify the recording of afferent nerve activity, perform a ramp distension-induced increase in afferent firing by closing the output port to lead to a gradual rise in pressure in the intestinal segment. Only perform the desired experimental protocol when three consecutive ramp distensions yield a reproducible multi-unit discharge.

In-vitro-Funktionelle Charakterisierung von Maus Colorectal Afferente Endings

Zusammenfassung

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