The authors have no Acknowledgements.

1. Zellpräparation <ol><li> Wachsende Zellen <ol><li> Wachsen D. discoideum Zellen in AX - Medium bei 23 ° C unter Licht in Gewebekulturplatten. Vermeiden Sie Zellen in hoher Dichte über 75% Konfluenz zu halten. Hinweis: Für eine optimale Reaktion auf Hitzestress, müssen Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase zu sein und nicht die stationäre Phase erreicht haben sollte. </li><li> Am Tag vor der Bildgebung, aufgeteilt Zellen in niedrige Fluoreszenzmedium (LFM) bis 1 x 10 4 Zellen / ml. HINWEIS: Dieser Schritt ist notwendig, durch die AX Medium verursachte Hintergrundfluoreszenz zu verringern. Die Inkubationszeit kann auf ein Minimum von 2 Stunden reduziert werden. Doch in AX-Medium aufgenommen Bläschen können noch einige Hintergrundsignal nach 2 h erzeugen. </li></ol></li><li> Vorbereitung Zellen für die Mikroskopie <ol><li> Vor Bildgebung, Ernten der Zellen aus dem Gewebeplatte in LFM und übertragen eine ausreichende Anzahl von Zellen in Glasbodenschalen. HINWEIS: In der Regel,1 x 10 5 Zellen / ml reicht; Wenn jedoch die Versuchsaufbau lange Abbildungsperioden (mehr als 8 h) erfordert, müssen die Zellzahlen sorgfältig eingestellt werden, wie D. discoideum Zellen werden dem Entwicklungszyklus übergehen und beginnen zu streamen und zu aggregieren , wenn die Zellzahlen hoch sind , während Nährstoffe niedrig sind. </li><li> Lassen Sie die Zellen für 20 min absetzen. Entfernen Sie nicht abgesetzten Zellen durch vorsichtiges das verwendete Medium durch frisches Medium ersetzt. </li></ol></li></ol> 2. Imaging HINWEIS: sowie in der konfokalen Mikroskopie-Setups Das Protokoll kann auf Weitfeld-Systemen verwendet werden. Die Verwendung eines temperaturgesteuerten Inkubation Box in denen die Ziele und den Mikroskoptisch ist hilfreich, aber nicht unbedingt notwendig für die Temperaturregelung. Die Temperatur der Inkubation Kasten wird auf die höchste Temperatur in dem Experiment verwendet gesetzt, beispielsweise auf 40 ° C , wenn Wärmespannung durchgeführt wird. Andernfalls wird die Temperatur auf 25 eingestellt6; C. Temperaturänderungen sollten im Voraus erfolgen, damit das System anzupassen, wie Veränderungen in der Temperatur während der Abbildung des Fokus beeinflussen können. HINWEIS: Während der Bilderzeugung wird die Temperatur gesteuert, um eine Kühlkammer verwendet wird. Die Standardtemperatur für die Bildgebung nicht gestressten Zellen beträgt 23 ° C. Für die Wärmebelastungsbedingungen wird die Temperatur entsprechend auf das gewünschte Niveau erhöht. Das Piezoelement in der Kühlkammer kann sehr schnell auf die Temperaturverschiebung reagieren. Allerdings wird der Fokus der Bilder leicht ändern (es auf bis zu 20 &amp; mgr; m in Abhängigkeit von der Temperaturverschiebung kann abweichen). Somit manuelle Refokussierung wird innerhalb der ersten Minuten der Bildaufnahme erforderlich ist, es sei denn, das verwendete Mikroskop mit einem Hardware-Autofokus ausgestattet ist. <ol><li> Bildaufnahme unter unbelasteten Bedingungen <ol><li> Bildzellen unter unbelasteten Bedingungen bei 23 ° C, mindestens 6 Sichtfelder (FOVs) erwerben. HINWEIS: Nicht-Spannungszustand kann visualized entweder durch eine kurze Time-Lapse (5-30 min) oder dem Erwerb von repräsentativen Standbilder aufnehmen. Für jede Bedingung oder Zelllinie ein Minimum von 6 Sichtfelder (FOVs) erwerben. HINWEIS: Sollten einzelne Zellen von Interesse sind, positionieren Sie die entsprechenden Zellen in der Mitte des FOV und eine 3 x 3 Fliesenserie mit dem FOV notieren Sie die Zellen von Interesse in der Mitte enthält , D.. discoideum Zellen sind frei beweglich und kann aus dem FOV migrieren. Jedoch erhöht die 3 x 3 Fliesenserie den Bereich möglicherweise durch die Zelle von Interesse untersucht und es bleibt nachvollziehbar für Zeitraffer-Perioden von ~ 6 Stunden. </li><li> Erwerben z-Stapel von höchstens 7 &amp; mgr; m in 1 bis 0,25 &amp; mgr; m vor, um das gesamte Volumen der Zelle zu erfassen. </li><li> Erwerben Bild eines Referenzhellfeld die Gesamtzahl der Zellen zu beurteilen. </li></ol></li><li> Bildaufnahme für Hitzestress <ol><li> Die Temperatur der Kühlkammer auf 30 ° C gemäß den Anweisungen des Herstellers. &lt;/ Li&gt; <li> Nachdem die Temperaturanzeige den gewünschten Wert ein, neu auszurichten manuell im Hellfeldkanal und überprüfen Sie alle aufgezeichneten FOVs vor dem Start des Zeitraffer erreicht hat. </li><li> Starten Sie eine Zeitraffer 4 Stunden von Hitzestress mit einem Zeitintervall von 5-10 Minuten zwischen den Zeitpunkten. Überprüfen Sie die korrekte während der Erfassung der ersten beiden Zeitpunkte zu konzentrieren. </li></ol></li><li> Bildaufnahme während der Wiederherstellung <ol><li> Nach dem Hitzestress zu reduzieren für die Temperaturanzeige auf 23 ° C, warten, bis die Temperatur wieder manuell anzupassen und neu auszurichten. </li><li> Nehmen Sie Zeitrafferfilme in der Erholungsphase für 8-10 Stunden in 10-20 Minuten Zeitintervallen. Überprüfen Sie die korrekte während der Erfassung des ersten Zeitpunkt zu konzentrieren. </li></ol></li></ol> 3. Bildanalyse ANMERKUNG: Um die Anzahl der Zellen beherbergen cytosolischen Foci, Beurteilung der Gesamtzahl der Zellen und die Anzahl der Zellen mit cytosolischen Foci in jedem Zeit quantifizierenRahmen. Aufgrund der Schwierigkeit von Zellen aus Hellfeld- Bilder Segmentieren, muss die Quantifizierung manuell durchgeführt werden. Im Folgenden wird die Datenanalyse für die freie Bildverarbeitungspaket beschrieben ((http://fiji.sc/Fiji). Es erfordert das Plugin &quot;Zellzähler&quot; (http://fiji.sc/Cell_Counter). <ol><li> Beurteilung der Gesamtzahl der Zellen <ol><li> Legen Sie das Hellfeld-Bildstapel (XYT), indem Sie auf &quot;Datei&quot; und &quot;Öffnen&quot;. </li><li> Öffnen Sie die &quot;Zellzähler&quot; Plugin ( &quot;Plugins&quot; - &quot;Zellzähler&quot;). Laden Sie das Bild Stapel von &quot;initialisieren&quot; klicken. </li><li> Wählen Sie die geeignete Art von Zählern durch Ankreuzen des entsprechenden Kästchens. Hinweis: Verwenden Sie Typ 1 als Zähler für die Gesamtzahl der Zellen und Typ 2 als Zähler für Zellen, die mit zytosolischen Brennpunkte. Zählen Sie alle Zellen. </li><li> Speichern Sie die Markierungen, indem Sie auf &quot;Save Markers&quot;. </li></ol></li><li> Die Beurteilung der Anzahl der Zellen mit zytosolischen Brennpunkte <ol> &lt;li&gt; Legen Sie das Fluoreszenzbild Hyperstack (XZYT) ( &quot;Datei&quot; - &quot;Open&quot;) und eine maximale Intensitätsprojektion der &quot;Z-Projector&quot; (Bild / Stacks) mit machen. </li><li> Öffnen Sie die &quot;Zellzähler&quot; Plugin. Legen Sie das resultierende Bildstapel (XYT), indem Sie auf &quot;initialisieren&quot;. </li><li> Legen Sie die Markierungen, indem Sie auf &quot;Load Marker&quot;. ACHTUNG: Die Dateinamen des Referenzbildes und der Fluoreszenz-Stack müssen identisch sein. Benennen Sie gegebenenfalls entsprechend vor dem Bildstapel initialisiert. </li><li> Wählen Sie den entsprechenden Marker-Typ (siehe 3.1.3) und Zellen mit zytosolischen Brennpunkten zählen. Die bestehenden Marker können als Richtlinien für die Lage einzelner Zellen verwendet werden. </li><li> Rufen Sie die Anzahl der Zählungen pro Scheibe durch einen Klick auf &quot;Ergebnisse&quot; und die Zählungen an anderer Stelle für weitere Berechnungen zu speichern. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Das hier beschriebene Protokoll kann das Verhalten eines bestimmten Proteins von Interesse in Reaktion auf die wärmeinduzierten Belastungen Studie verwendet werden. Temperaturerhöhung auf 30 ° C wurde berichtet Wärmebelastungsantwort auszulösen , und unter diesen Bedingungen die Lebensfähigkeit von D. discoideum ist deutlich reduziert. Änderungen Das Protokoll kann modifiziert werden, um das Verhalten verschiedener Proteine ​​unter den gleichen Belastungsbedingungen zu vergleichen. Dazu verschiedene Proteine ​​mit dem gleichen Fluoreszenzmarker exprimierenden Zellen werden in Multi-Well-Platten transferiert, wie vier Kammerschalen (Abschnitt 1.3.1). Das Protokoll kann auch auf Zellen co-exprimierenden Proteine ​​mit verschiedenen Markern, wie GFP oder RFP angewendet werden. Dies kann beispielsweise verwendet, um das Verhalten verschiedener Komponenten der Proteinqualitätskontrolle (PQC) System überwachen. Zellen, die GFP-markierten Aggregation Marker und andere RFP-markierte PCQ Komponenten exprimieren, können unter Verwendung von Multi-Well beobachtet werdenKlöpper für die Bildgebung. Dies gewährleistet den gleichen Belastungsbedingungen (Geschwindigkeit der Temperaturzunahme / abnahme, der Dauer der Temperaturerhöhung / Verringerung) und ermöglicht eine vergleichende Studien. Darüber hinaus kann das Protokoll verwendet werden, um den Einfluss des PQC System auf der Wärmebelastungsantwort zu untersuchen. Die Aktivität der Komponenten kann durch Ändern Expressionsniveaus unter Verwendung von genetischen Werkzeugen wie knock-out oder Überexpression oder durch Verwendung von handelsüblichen spezifische Inhibitoren 6 moduliert werden. Das Proteasom kann durch Zugabe von MG132 (100 uM) oder Lactacystin (10 uM) zu dem Wachstumsmedium inhibiert werden. Das Chaperon Hsp90 kann verhindert werden, indem Geldanamycin (6 uM) oder Radicicol (10 &amp; mgr; M). Das Chaperon Hsp70 kann mit VER-155088 gehemmt werden, obwohl wir nicht die Wirksamkeit der Hemmung in unserer experimentellen Einstellungen bestätigen konnten bisher. Inhibitoren sollten 14 Stunden einen Tag vor der Bildgebung und die Zellen werden inkubiert werden. Criti<html> cal Schritte im Rahmen des Protokolls Der entscheidende Schritt für die Beurteilung der wärmeinduzierte Störung ist der Zustand der Zellen vor dem Bildgebungsexperiment. Studien in Hefe zeigten , dass Zellen Resistenz gegen eine Vielzahl von Umwelteinflüssen während der stationären Phase 13 erwerben. Wir beobachteten auch minimale Reaktion auf angelegte Wärme Stress , wenn D. discoideum Zellen hatten stationäre Phase erreicht vor der Bildgebung. Um daher eine konstante Zellzahl aufrechterhalten &lt;5 x 10 5 Zellen / ml ist kritisch. Darüber hinaus können hohe Zellzahlen Übergang vom vegetativen Zyklus von D. induzieren discoideum auf den Entwicklungszyklus, so auslösenden Verhungern Wege, die zu einer anderen Antwort führen könnte Stress zu erwärmen. Bei hohen Zellzahlen in der Erholungsphase nach der Hitzebelastung erreicht werden, Streaming und Aggregation - Zellen können mit der Datenanalyse stören , da die Zellen aus dem Fokus zu bewegen (siehe Abbildung 4). Inhalt &quot;&gt; Einschränkung der Technik Der Verlust des Fokus ist der Engpass des Protokolls. Bei Temperaturänderungen kann die Brennebene drastisch Verschiebung, die in einer Zeitperiode manuelle Refokussierung erfordert unmittelbar nach der Änderung der Temperatur. Der Sprung in der Fokus kann manchmal zu extrem sein durch Software Autofokus zu überwinden, insbesondere, wenn die Zeit zwischen den Zeitpunkten hoch ist. Wenn jedoch das verwendete Mikroskop mit einem Hardware-Autofokus ausgestattet ist, kann dieser Engpass umgangen werden. Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende Methoden Im Vergleich zu bestehenden Aufbauten wie beispielsweise die Verwendung von klimatisierten Räumen, temperaturgesteuerte Inkubation Kästen in denen die Ziele und die Mikroskoptisch oder temperaturgesteuerten Bühnen und objektive Krägen stellt die Verwendung einer Kühlkammer, die eine genauere Steuerung der Umgebungs Temperatur. Das Peltier-Element in der Kühlkammer kann eine konstante und gleichmäßige tem aufrechtzuerhaltenperatur während des gesamten Versuchsaufbau. In der klassischen Setups können lokale Temperaturunterschiede zu unterschiedlichen Beobachtungs Ergebnissen führen. Darüber hinaus kann es schnell und rasch auf induzierte Änderungen in der Temperatur reagieren, während klassische Setups sehr langsam induzierte Temperaturänderungen anzupassen, insbesondere um die Temperatur zu senken. Das Peltier-Element in der Kühlkammer kann auch einen breiteren Temperaturbereich (15-40 ° C) als die klassischen Konfigurationen umfassen, mit dem Erreichen Temperaturen, wie 15 ° C oder 40 ° C ist sehr schwierig. Dictyostelium discoideum ist besonders empfindlich gegenüber Phototoxizität. Frühere Studien Ascorbat als Fänger verwendet Phototoxizität zu reduzieren. Jedoch erfordern lange Bildgebungszeiten zusätzliche Ergänzung. Außerdem wird die Verwendung von Ascorbat auf Studien beschränkt, in dem der Mechanismus von Interesse nicht durch die Antioxidansergänzung beeinflusst wird. Wir schlagen vor, dass temperaturgesteuerte Bildgebung kann alternativ ca. verwendet werdenoach Phototoxizität zu minimieren und könnte unter Zugabe von Ascorbat kombiniert werden, um die Toxizität zu verringern. Phototoxische Effekte können durch die Bereitstellung einer konstanten und gleichförmigen Temperatur von 23 ° C unter Verwendung einer Kühlkammer minimiert werden. Die Zellen mit Temperaturkontrolle abgebildet zeigen weniger Anzeichen von Phototoxizität, wie Zellabrundung, für einen längeren Zeitraum. Dies ermöglicht auch Bildgebung mit höheren Intensitäten, kleinere Zeitintervalle oder mehr Sichtfelder (FOVs). Allgemeine Anwendung Hitzestress bei höheren Temperaturen wurde eine unterschiedliche Wärmestressantwort 14 auszulösen gezeigt. Daher könnte eine andere Antwort induzieren, die Temperatur auf 34 ° C oder 37 ° C erhöht. Neben der Temperaturbelastung angelegt wird, kann die Dauer eines bestimmten Belastungssituation modifiziert werden, um die unmittelbare Reaktion oder langfristige Anpassung an Stress studieren zu beheizen. In der Regel kann das beschriebene Protokoll seinauf ein breites Spektrum von Anwendungen erweitert. Da die präzise Temperaturregelung erheblich phototoxische Effekte reduziert, kann das Protokoll in den Einstellungen verwendet werden , die eine hohe Belichtungszeiten erfordern und / oder höhere Anregungslichtintensitäten, beispielsweise für Proteine mit einem niedrigen Expressionsniveau zu visualisieren, oder in Kombination mit kurzen Zeitintervallen zwischen Bildgebung, zum Beispiel während Zeitraffer-Bildgebung. Es kann auch für die Abbildung der gesamten Zelle, zB Mikrotubuli, da diese Einstellungen erfordern eine hohe Anzahl von optischen z-Abschnitte Spanning Objekte vorteilhaft sein.

Dictyostelium discoideum sind Einzelgänger Boden lebenden Amöben , die auf Bakterien und anderen Mikroorganismen ernähren, die durch Phagozytose aufgenommen werden. Es hat eine einzigartige und bemerkenswerte Lebenszyklus , die einen großen Bereich der Forschung seit seiner Entdeckung 1 gewesen ist. Das frühe Interesse an der vielzelligen Entwicklung 2 und die molekularen Grundlagen der Chemotaxis 3 wurde bald durch Studien ergänzt mit Schwerpunkt auf der Zellbeweglichkeit, Zellpolarität, angeborene Immunität. Zusätzlich D. discoideum wurde als Modellsystem für die biomedizinische Forschung 4,5 eingeführt. Vor kurzem haben wir D. discoideum als ein neues System , das Protein Qualitätskontrolle (PQC) System 6,7 zu studieren. Seine Proteom ist in aggregationsanfälligen Prion-ähnliche Proteine angereichert, die 8 eine Herausforderung für die Proteinqualitätskontrolle darstellt. Um zu untersuchen , ob D. discoideum hat spezielle molekulare Mechanismen entwickelt , seine zur Steuerung hoch aggregation anfällige Proteom, untersuchten wir das Verhalten der Aggregation neigende Proteine ​​Marker sowohl unter normalen Wachstumsbedingungen und bei Stress. Stressbedingungen, wie Wärmebeanspruchung kann die Rate der Protein misfolding 9 zu erhöhen verwendet werden. Deshalb haben wir versucht, ein System, wo wir Temperaturänderungen auslösen können und gleichzeitig das Verhalten von Markerproteinen folgen. Zu diesem Zweck kombiniert, wir Abbildung lebender Zellen mit Peltier-gesteuerte Erwärmung eine thermische Stufe Einsatz (Kühlkammer) verwendet wird. Diese Methode erlaubt uns eine konstante und gleichmäßige Temperatur sowie zur Aufrechterhaltung einer schnellen, aber dennoch präzise Temperaturänderung zu induzieren. Bildgebung lebender Zellen verwendet , um eine Vielzahl von biologischen Prozessen in D. zu studieren discoideum. Allerdings steht dieser Ansatz zwei wichtige Einschränkungen. Zunächst werden die Zellen, die eine hohe Beweglichkeit anzuzeigen und neigen aus dem Sichtfeld zu wandern, wodurch einzelne Zellen verfolgen, erfordert oft Bildgebung einer großen Fläche. Die Mobilitätszelle kannvon Agar - Overlay 10 jedoch verringert werden, sind diese Bedingungen für langfristige Bildgebung aufgrund einer Abnahme der Lebensfähigkeit nicht geeignet. Zweitens D. discoideum Zellen zeigen eine besonders hohe Empfindlichkeit gegenüber Phototoxizität, die 11 in Zellabrundung und mitotischen Arrest führt. Vorherige Protokolle adressiert dieses Problem durch Zugabe von Ascorbat als Radikalfänger und Reduzierung der Belichtungszeiten 12. Letzteres kann kritisch sein, wenn das Protein von Interesse auf einem niedrigen Niveau exprimiert wird, und zeigt ein schwaches Fluoreszenzsignal. Die Autoren schlagen auch vor, entweder durch Abbilden in einem klimatisierten Raum oder durch Verwendung von temperaturgesteuerte Inkubation Kästen, um eine konstante Temperatur von 21 ° C zu schaffen , die das Ziel und den Mikroskoptisch 12 abzudecken. Hier beschreiben wir ein Verfahren mit verbesserter Temperatursteuerung durch eine Kühlkammer unter Verwendung von auf 23 ° C eingestellt. Während der Abbildung unserer Set-up eine deutliche Steigerung der Beständigkeit gegen Phototoxizität. Eserlaubt die Verwendung von höheren Belichtungszeiten und höhere Anregungslichtintensitäten. Dies ist von besonderer Bedeutung während des Zeitraffer-Bildgebung, da die Zeitintervalle sorgfältig ausgewogen gegen die Anzahl der Positionen abgebildet werden müssen und der Belichtungszeit verwendet. Die Möglichkeit, die Anzahl der abgebildeten Positionen zu erhöhen, ermöglicht auch die Abdeckung eines breiten Abbildungsbereich und erleichtert die Verfolgung einzelner Zellen über einen längeren Zeitraum.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="587">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AX Medium</td>
			<td style="width:85px;">ForMedium</td>
			<td style="width:119px;">AXM0102</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LoFlo medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>LF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MG132</td>
			<td style="width:85px;">Sigma</td>
			<td>C2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lactacystin</td>
			<td style="width:85px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L6785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Geldanamycin</td>
			<td style="width:85px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-200617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Radicicol</td>
			<td style="width:85px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-200620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MatTek disch 35 mm</td>
			<td style="width:85px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td>glass bottom imaging dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CellViell cell culture dish</td>
			<td style="width:85px;">Greiner</td>
			<td align="right" style="width:119px;">627870</td>
			<td>4-compartments glass bottom imaging dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thermal Stage Heater/Cooler Insert</td>
			<td style="width:85px;">Warner Istruments</td>
			<td style="width:119px;">TB-3/CCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bipolar temperature controller</td>
			<td style="width:85px;">Warner Istruments</td>
			<td style="width:119px;">CL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Liquid cooling System</td>
			<td style="width:85px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:119px;">LCS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Das beschriebene Bildgebungsprotokoll kann verwendet werden , um das Verhalten von aggregationsanfällig prion-ähnliche Proteine in der Amöbe D. Analyse discoideum während der Hitzestress. 1 zeigt die Verteilung von GFP-markiertem Polyglutamin - Protein - Q103 in Zellen , die unter normalen Wachstumsbedingungen (1A), nach 2 Stunden Wärmebelastung bei 30 ° C (1B) und nach 6 Stunden Stress Wiederherstellungs- und Wachstum bei normalen Wachstumsbedingungen (Abbildung 1C). Bei Temperaturerhöhung von 23 ° C bis 30 ° C, die Q103-GFP Marker verschmilzt aus einer diffusen Verteilung Strukturen punktiert. Nach dem Stressabbau und das Wachstum bei normaler Temperatur, lösen sich diese Strukturen. Die Umverteilung von Q103-GFP und die Bildung von Hitzestress induzierten cytosolischen Herde können Bildanalyse quantifiziert werden. 2A zeigt die Analyse einzelner FOVs mit Fiji und das Plugin &quot;Cell Zähler &quot;. 2B zeigt die Quantifizierung der Wärmestressantwort. Dies zeigt , dass die cytosolische Q103-GFP Brennpunkte Erhöhung der Zahl mit fortHitzeStress. Während Hitzestress, die Proteinqualitätskontrolle (PQC) System ist überwältigt, so Aggregations- neigen Proteine wie das Prion-like protein Q103 kann nicht in einem löslichen Zustand und zunehmend Aggregat in zytosolischen Foci aufrechterhalten werden. die Zellen auch eine charakteristische Rundungs zeigen, wie in 1B. die Reduktion der cytosolischen Foci nach Stress Entfernung dargestellt legt nahe , dass die aggregierte Proteine ​​werden gelöst. Die Abbildungsqualität ist empfindlich gegenüber der anfänglichen Zelldichte, Fig . 3 zeigt ein Beispiel für Zellen nach der Belastungswiederherstellung geeigneten Anfangszelldichte (3A) und eine hohe Anfangszelldichte (3B) zu vergleichen. Wenn die anfängliche Zelldichte zu hoch war, Sternzellented Ströme zu bilden , wie in 3b dargestellt. Diese, die Schwierigkeiten bei der nachfolgenden Quantifizierung wie die Zellen auferlegt sind aus der Brennebene bewegt. Das beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um temperaturbedingte Veränderungen zu überwachen, wie oben beschrieben. Es kann auch zu reduzieren Phototoxizität verwendet werden , wenn bei einem physiologischen Wachstumstemperatur Bildgebung. Abbildung 4 zeigt einen Vergleich der Zelle bei 23 ° C in einer Kühlkammer (4A) abgebildet und ohne Temperaturregelung in einem klimatisierten Raum abgebildeten Zellen, Set auf 25 ° C (4B). Bei konstanten Kontakt mit dem Anregungslicht runden Zellen, wenn sie nicht unter temperierten Bedingungen abgebildet. Diese Änderung in der Zellform anzeigt Stress. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig1.jpg" /> Abbildung 1: <strong&gt; Aggregation neigende Prion-ähnliche Proteine verändern ihre zelluläre Verteilung während der Hitzestress. GFP-markierten polyglutamine reichen Huntingtin Exon 1 (Q103) konstitutiv in AX2-214 D. ausgedrückt discoideum Zellen (GFP - Signal in invertierten Graustufen - Nachschlagtabelle dargestellt). (A) Unter normalen Wachstumsbedingungen bei 23 ° C, Q103-GFP diffus im Cytoplasma verteilt. (B) Nach 2 Stunden von Hitzestress bei 30 ° C, Q103-GFP verschmilzt in zytosolischen Brennpunkte (rote Pfeile). Die Zellen zeigen eine charakteristische Formänderung und abrunden. (C) Nach dem Stressabbau und das Wachstum bei 23 ° C werden die cytosolische Brennpunkte gelöst. Nach 6 Stunden, kann keine cytosolische Foci beobachtet werden. Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 2: Quantifizierung der thermisch induzierten cytosolischen Foci - Bildung (A) Analyse von Zellen , die das freie Bildverarbeitungspaket Fiji und das Plugin &quot;Zellzähler&quot; verwendet wird .. Die Gesamtmenge an Zellen (Typ 1, blau Zähler Marker) in der Hellfeldbild bestimmt. Die Marker werden in der GFP-Kanal und die Anzahl der Zellen mit cytosolischen Foci (Typ 2, rot Zähler Marker) geladen wird bestimmt. (B) Quantifizierung der Brennpunkte nach 3 h Wärmebelastung bei 30 ° C und 3 Stunden von Stress Erholung bei 23 ° C (n = 4 Sichtfelder, Fehlerbalken = SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version davon zu sehen Zahl.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig3.jpg" /> <stron<html> g&gt; Abbildung 3: Einfluss der Zelldichte auf Zellen , die bei anfänglichen Zelldichten &lt;10 5 Zellen / ml abgebildet Langzeit Zeitraffer-Bildgebung (A).. Nach 3 Stunden von Hitzestress bei 30 ° C und 6 Stunden von Stress Erholung bei 23 ° C, bleiben immer noch Zellen im vegetativen Zyklus und dividieren. Nur wenige Zellen, die die Brennebene verlassen. (B) Zellen , die bei anfänglichen Zelldichten&gt; 10 6 Zellen / ml abgebildet. Nach 9 h Bildgebung (Einstellungen wie in A), haben Zellen, die den Entwicklungszyklus eingegeben und gestartet Streaming und aggregiert werden. Zellen in den Aggregaten nicht eindeutig unterschieden werden kann. Ein großer Teil der Zellen tritt aus der Brennebene und nicht analysiert werden kann. Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <html> .jpg &quot;/&gt; Abb . 4: Einfluss der Temperaturregelung auf phototoxische Effekte (A) Zellen abgebildet für 10 min mit Temperaturkontrolle bei 23 ° C: 6 Sichtfelder, z-Stapel (Abstand 0,5 uM, Probendicke 8 uM), Zeitraffer (Gesamt Zeit 10 min, Ablauf 1 min), GFP-Kanal (0,07 ms Belichtungszeit, 10% Laserintensität), RFP-Kanal (0,1 ms Belichtungszeit, 10% Laserintensität). Die Zellen zeigen keine Anzeichen der charakteristischen morphologischen Veränderungen mit phototoxischen Stress verbunden. (B) Zellen für 10 min ohne Temperatursteuerung (gleiche Bedingungen wie in A) abgebildet. Die Zellen Anzeichen einer phototoxischen induzierten Rundung aufweisen, Stress anzeigt. Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m. Die Zellen wurden auf einem System abgebildet basierend auf einem Mikroskop mit einem 100x / 1,4 numerische Apertur (NA) Ziel. Die Bilder wurden mit einer CCD-Kamera als 1.024 x 1.024 Pixel-Dateien unter Verwendung von 1 x 1 Binning gesammelt.4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Die Untersuchung der Proteinqualitätskontrolle System der<em&gt; D. discoideum</em&gt; Verwendung von Temperaturgesteuerte Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

6.1K Aufrufe.  Max-Planck Institute for Molecular Cell Biology and Genetics. The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Serie: Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Forschung

Biologie

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Imaging G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-vermittelten Signaltransduktion, die Steuerung der Chemotaxis Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D-Bildgebung von Protein Aggregation in lebenden Zellen

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the formation of thrombi that occlude the vasculature and injure organs, with life-threatening consequences. This motivates scientific research on platelet function and the development of methods to track cell-biological processes as they occur under flow conditions.
A variety of flow models are available for the study of platelet adhesion and aggregation, two key phenomena in platelet biology. This work describes a method to study real-time platelet degranulation under flow during activation. The method makes use of a flow chamber coupled to a syringe-pump setup that is placed under a wide-field, inverted, LED-based fluorescence microscope. The setup described here allows for the simultaneous excitation of multiple fluorophores that are delivered by fluorescently labeled antibodies or fluorescent dyes. After live-cell imaging experiments, the cover glasses can be further processed and analyzed using static microscopy (i.e., confocal microscopy or scanning electron microscopy).

This work describes a fluorescence microscopy-based method for the study of platelet adhesion, spreading, and secretion under flow. This versatile platform enables the investigation of platelet function for mechanistic research on thrombosis and hemostasis.

Live-Zelle Bildgebung von Platelet Degranulation und Sekretion unter Flow

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

LDL-Cholesterin-Aufnahme-Assay mit Live Cell Imaging-Analyse mit Zelle Systemüberwachung

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...