Dieses Protokoll wurde ursprünglich auf Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle durch Xiaolan Ye und Michael Petrascheck entwickelt im Labor von Linda Buck. Die ausführliche Version über wurde erstellt, um das gesamte Verfahren zur Verfügung, um der größeren Gemeinschaft zu machen. Wir bedanken uns bei Carol Taylor, Sarah LeBoeuf und Andy Tomacelli für die kritische Durchsicht des Protokolls. Dies ist Manuskript # 2866 von The Scripps Research Institute. Die Petrascheck Lab wird von der Novartis ADI-Programm finanziert.

Überblick: Das Protokoll ist in vier Teile aufgeteilt. Teil 1 beschreibt, wie die Fütterung Bakterien vorbereiten. Teil 2 beschreibt, wie der Wurm Kultur vorzubereiten. Teil 3 beschreibt die Lebensdauer des Gastes. Teil 4 zeigt einige repräsentative Ergebnisse, und Teil 5 beschreibt, wie die erforderlichen Lösungen herzustellen. Lebensdauer Experimente dauern mehrere Wochen in Anspruch. Für jeden Schritt des Protokolls Woche, Tag und Uhrzeit des Tages aufgenommen, um die Planung zu erleichtern. Die L4 Stadium (Tag 0) wird als Bezugspunkt für das gesamte Protokoll verwendet. 1. Vorbereitung der Fütterung Bakterien Dieser Abschnitt beschreibt die Vorbereitung der Fütterung Bakterien. Die spezifische E. coli-Stamm verwendet, um C.elegans feed heißt OP50. Vor diesem Protokoll, um eine Kreuzkontamination der Wurm Kultur mit anderen Bakterien zu verhindern, hat die OP50 Belastung gemacht Carbenicillin / Ampicillin resistent 21. Bereiten Sie das OP50 vier vor fünf Tage im Voraus. Alle Materialien in Kontakt kommen mit OP50 müssen steril sein. Tag -7: Donnerstag (Woche 1): Impfen 5 ml TB mit 100 ug / ml Ampicillin und 0,1 ug / ml Amphotericin B mit einem OP50 Kolonie und Inkubation über Nacht bei 37 ° C in einem bakteriellen Schüttler. Tag -6: Freitag (Woche 1). Morgen 8:30 Uhr. Impfen früh, um genügend Zeit für die Kultur bis zur Sättigung zu erreichen <ol><li> Verdünnen Sie die Nacht-Kultur von OP50 1:2000 in 300 ml TB mit 50 ug / ml Ampicillin. Inkubieren Sie die Kultur in einem bakteriellen Schüttler für 8-12 Stunden bei 37 ° C bis zur Sättigung erreicht ist. Nicht in die Kultur zu wachsen länger als 14 Stunden. </li><li> Übertragen Sie die OP50 in eine sterile, pre-gewichteten Zentrifugenröhrchen. Pellet der OP50 durch Zentrifugation für 10 min bei 3500 rpm (2200 xg) in einer Tischzentrifuge. </li><li> Überstand verwerfen und wieder aussetzen OP50 Pellet in sterilem Wasser und re-Pellet durch Zentrifugation. Wiederholen Sie diesen waschen zweimal. </li><li> Nach dem zweiten Waschen, entfernen Sie sorgfältig alle das restliche Wasser. Darf kein Wasser in die Röhre gelassen werden. Wiegen Sie das Zentrifugenröhrchen mit dem Pellet und subtrahieren das Gewicht des leeren Zentrifugenröhrchen, um das Gewicht der Pellets zu bestimmen. </li><li> Gründlich resuspendieren Sie das Pellet in S-complete zu einer Konzentration von 100 mg / mL. Keine Klumpen überlassen werden sollte. </li><li> Die Konzentration von 100 mg / mL OP50 auf 2 x10 10 Bakterien / ml entsprechen. Verwenden Sie ein Foto-Spektrometer, um die Anzahl der Bakterien pro ml zu bestimmen, ob die Beziehung zwischen der optischen Dichte und der Anzahl der Bakterien pro ml bekannt ist. Falls erforderlich, die Konzentration der OP50 Fütterung Lösung zu 2 x10 10 Bakterien / ml. </li><li> Bewahren Sie die OP50solution bei 4 ° C, bis es für den Wurm Kultur verwendet. </li></ol> 2. Erstellung eines Synchron-Worm Kultur Dieser Abschnitt beschreibt die Herstellung des Wurms Kultur. Sein Ziel ist es, ein Alter-Synchron-Bevölkerung von Würmern zu generieren. Alle Materialien in Kontakt kommen mit C.elegans nach der Bleiche Behandlung in Schritt 5 müssen steril sein. Die Platten werden bei 20 ° C, sofern nicht anders angegeben. Tag -6: Freitag (Woche 1), 04.00 Uhr: Transfer der Tiere auf eine frische Platte <ol><li> Nehmen Sie etwa 5-10 Tage alten NGM Teller, auf dem die Mehrheit der Wurm Bevölkerung besteht aus verhungert L1-Larven. </li><li> Sterilisieren einem Spatel durch kurzes Erhitzen über einem Bunsenbrenner. Lassen Sie sie abkühlen. Verwenden Sie den gekühlten Spatel zum Ausschneiden Agar Stücke von der Platte mit den verhungerten Würmer. Übertragen mehrere dieser Stücke auf eine frische 10 cm NGM-Platte ausgesät mit OP50. Inkubieren für ca.. 65 Stunden bei 20 ° C, bis die Mehrheit der Wurm Bevölkerung besteht aus gravid Erwachsene. Die Zeit, die für die ausgehungerten Tiere L1 in gravid Erwachsenen wachsen kann von Stamm zu Stamm unterschiedlich. </li></ol> Tag -3: Montag (Woche 2) 10.00: Einführung eines synchronen Bevölkerung <ol start="3"><li> Sammeln Sie Würmer aus dem 10 cm Platte durch Waschen Sie die Platte mit 5-10 mL sterilem Wasser. Übertragung der Wurm / Wasser-Lösung in einen 15 mL konischen Rohr. </li><li> Waschen Sie die Würmer durch Zentrifugation 2 min in einer Tischzentrifuge bei 1200 rpm (280 xg). Überstand verwerfen und 10 ml Wasser. Wiederholen. </li><li> Überstand entfernen und 5 ml frisch zubereitete Bleiche / NaOH-Lösung (2,5 ml Bleiche, 1 mL 10 N NaOH, 6,5 mL H 2 O). Inkubieren für 5 Minuten bei RT, bis die Würmer offenen Bruch. Achten Sie darauf, vortexen jede Minute. Überwachen Sie den Fortschritt der Reaktion unter dem Binokular. </li><li> Sobald alle Erwachsenen zu lösen, 5 ml M9-Puffer, um die Reaktion zu neutralisieren. </li><li> Waschen Sie die Eier dreimal mit 10 mL M9-Puffer durch Zentrifugation 2 min bei 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Waschen Sie die Eier einmal mit 10 mL S-complete durch Zentrifugation 2 min bei 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Entfernen Sie den Überstand, 10 ml S-complete und die Lösung in ein frisches 50 mL konischen Rohr. 30 ml S-complete, um ein Endvolumen von 40 mL. Schütteln Sie das Rohr über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Kolbenpendel oder ein ähnliches Gerät. </li></ol> Tag -2: Dienstag (Woche 2), 12:00 Uhr: Seed die Tiere in Platten <ol start="10"><li> Unter dem Binokular, zu prüfen, ob die Würmer in der Nacht geschlüpft. Bestimmen Sie die Konzentration von Würmern in der S-Komplettlösung durch Zählen der Anzahl der Würmer in 10 ul Tropfen mit einem Binokular. Graf mindestens 10 Tropfen für jede Probe. </li><li> Re-suspend die Würmer in einer Konzentration von 80-100 Würmer / mL in S-abgeschlossen. Add Carbenicillin (Bestand 100 mg / mL) zu einer Endkonzentration von 50 ug / mL und Amphotericin B (Bestand 250 ug / mL) zu einer Endkonzentration von 0,1 pg / mL. Schütteln auf einem Kolbenpendel. Wenn die Herstellung größerer Mengen von Würmern, verwenden Sie einen 600 mL Nunclon Kolben mit Filterdeckel. </li><li> Am 14.30 Uhr fügen Sie die OP50 in Teil 1 bis zu einer Endkonzentration von 6 mg / mL (= 1,2 x10 9 Bakterien / ml) hergestellt. Senden Sie das OP50 bis 4 ° C. </li><li> Transfer-120 ul der worm/OP50 Lösung in jedes Well einer 96-Well-Platte. Verwenden Sie 96-Well Platten mit transparentem Boden. Vergewissern Sie sich, um die Würmer in der Schwebe zu halten beim Pipettieren. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit einem Tape-Versiegelung auf Kontamination und Verdunstung zu vermeiden. Schütteln Sie die Platte auf einem Schüttler für 2 min und Inkubation für 2 Tage bei 20 ° C, bis die Tiere die L4 Stadium zu erreichen. </li></ol> Tag 0: Donnerstag (Woche 2) vor dem Mittag: Sterilisieren Tiere, indem Fluordeoxyuridin (FUDR) <ol start="15"><li> Um die Tiere zu sterilisieren add 30 ul einer 0,6 mM FUDR Stammlösung in jede Vertiefung. Dieser Schritt bringt das Endvolumen in jeder Vertiefung zu 150 ul und reduziert die Endkonzentration des OP50 von 6 mg / ml bis 5 mg / mL (1x10 9 Bakterien / ml). Verschließen Sie die Platte mit Klebeband Versiegelungen und schütteln Sie sie für 2-3 min auf einem Schüttler. Wenn das OP50 war um 2:30 am Tag -2 hinzugefügt, ist es wichtig, dass die FUDR vor Mittag wird hinzugefügt. Zurück Platten, die 20 ° C Inkubator </li></ol> Tag 1: Freitag (Woche 2): Fügen Sie Medikamente zur Kultur <ol start="16"><li> Um 9:00 Uhr die meisten der Tiere sollten gravid und enthalten mehrere Eier jeden. Fügen Sie die Medikamente, deren Wirkung auf die Lebensdauer ist in der gewünschten Konzentration getestet werden. Wenn die Auflösung der Drogen in DMSO die Endkonzentrationen von DMSO sollte nicht mehr als 0,6%, wie DMSO-Konzentrationen höher als 0,6% zu verkürzen C.elegans Lebensdauer. Nach Zugabe des Medikaments, dichten die Platten mit Klebeband Versiegelung und schütteln Sie sie für 2-3 min auf einem Schüttler. Zurück Platten, die 20 ° C Inkubator </li><li> Hinzufügen der Medikamente können gelegentlich zu töten ein paar Tiere pro Platte, besonders wenn mit einem anderen Lösungsmittel als Wasser. Verwenden Sie eine inverse Mikroskop für lebende Tiere zu überprüfen. Generell sollte es weniger als 10 tote Tiere pro 96-Well-Platte sein. Zurück Platten, die 20 ° C Inkubator. </li></ol> Tag 4: Montag (Woche 3): Change Versiegelungen <ol start="18"><li> Um frischen Sauerstoff in die Kultur geben entfernen Sie die Versiegelung, warten Sie 1 Minute und verschließen die Platte. Schütteln Sie die Platte für 2-3 Minuten auf einem Schüttler. Wiederholen Sie jede Woche einmal. </li></ol> Tag 5: Dienstag (Woche 3): Add new OP50 zum Verhungern zu verhindern <ol start="19"><li> Add 5 ul der 100 mg / mL OP50-Lösung, die in Teil 1 zu jedem der 96 Löcher, um Hunger zu verhindern, wurde hergestellt. </li></ol> 3. Scoring der Lebensdauer. In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie das Überleben der synchronisierten Wurm Bevölkerung von Teil 2 überwacht wird, bis die Tiere starben. Zur Beobachtung der Tiere in den 96-Well-Platten, verwenden Sie einen inversen Mikroskop mit 2x oder 2.5x Ziel. Rekord Überlebensdaten dreimal in der Woche, Montag, Mittwoch und Freitag. Verwenden Bewegung, um festzustellen, ob die Tiere lebend oder tot sind. Starkes Licht, vor allem blaues Licht, induziert die Tiere sich zu bewegen. Entfernen Sie nicht tote Tiere aus dem Test. Gelegentlich kann Tiere, die nicht verschoben hat und tot waren in den vorhergehenden Zählung bestimmt später zu verschieben. <ol><li> Am Tag 0, am Anfang des Experiments zählen die Gesamtzahl der Würmer in jede Vertiefung. Censor Brunnen, die mehr als 18 Tiere aus der Analyse enthalten wie die Tiere in diesen Brunnen nicht mehr genügend OP50 und Effekte der diätetischen Restriktion zeigen. </li><li> Um die Chance, dass die Tiere schütteln den 96-Well-Platte auf einem Schüttler für 2 min bewegen zu erhöhen. vor dem Zählen. </li><li> In jedem Zählen Sitzung record date und Anzahl der Tiere, diebewegen, wie lebende Tiere. Bewegung in flüssiger ist viel einfacher als auf festen Medien und kann durch starkes Licht induziert werden. Die Verwendung einer höheren Vergrößerung kann helfen, sehr subtile Bewegungen wie die der Spitze des Pharynx vor Ort. Solche subtilen Bewegungen sind oft die einzige Bewegung in sehr alten Tieren beobachtet. </li><li> Zurück Platten, die 20 ° C Inkubator </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2-4 alle zwei vor drei Tagen bis alle Tiere tot sind. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse. Dieser Abschnitt zeigt ein Beispiel, wie man Aufzeichnungen über die Lebensdauer von Daten durch diese Tests und einige repräsentative Ergebnisse generiert halten. Abbildung 1A zeigt ein Beispiel, wie man Lebensdauer Daten während dieses Tests aufzuzeichnen. Eine Excel-Tabelle wird verwendet, um das Überleben der Populationen in jede Vertiefung zu halten. Für jeden gut ist es in der Platte zu koordinieren, Dehnung, Drogen, Konzentration des Medikaments und die Gesamtzahl der Tiere am Leben am Tag 0 (X0) wird am Anfang des Experiments aufgezeichnet. Stichtag sowie die Anzahl der lebenden und toten Tieren dreimal in der Woche, um das Überleben der verschiedenen Bevölkerungsgruppen in jede Vertiefung folgen. Um die Ergebnisse grafisch, berechnen den Anteil der Tiere am Leben für jeden Tag und Handlung als eine Funktion der Zeit in Tagen. P-Werte zu berechnen mit Hilfe statistischer Pakete wie STATA oder ähnliche Software. Das Medium Lebensdauer von C. elegans ist temperaturabhängig. Abbildung 1B zeigt, dass temperaturabhängige Veränderungen in Lebensspanne genau durch die Mikrotiterplatten basierten Lebensdauer Assay 22 wiedergegeben. Ebenso gibt die Mikrotiterplatte Assay Veränderungen in Lebensspanne von Mutanten berichtet, Lebensdauer, die von Wildtyp N2 Tiere 23-24 25 (Abb. 1C) unterscheiden können. Der Test kann auch verwendet werden, um mehr quantitative Aussagen zu machen. In Fig1D bedeuten Lebensdauer beträgt in Abhängigkeit von der Konzentration Mirtazepine 7 dargestellt. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert Lebensdauer von 7-12 Bevölkerung, jedes Lebewesen in ein anderes auch. Auch wenn die Anzahl der Tiere pro Well ist relativ gering (5-15 Tiere) der Well-to-Well-Variante ist relativ gering, wie aus der Fehlerbalken zu sehen ist. <img src="/files/ftp_upload/2496/2496fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Die Mikrotiterbasis Lebensdauer-Test reproduziert Veränderungen in Lebensdauer in der Literatur berichtet. (A) Sample-Daten in eine Excel-Tabelle gesammelt. Während jeder Sitzung Zählen Datum, der gut zu koordinieren und die Anzahl der lebenden und toten Tieren aufgenommen wurde. Zu Beginn des Experiments wurde die Gesamtzahl der Tiere in jeder Vertiefung bestimmt. (B) Survival-Kurve von Wildtyp-(N2) Tiere bei 20 ° C gezüchtet und 25 ° C. (C) Überlebenskurven von Stämmen, die Mutationen, die die Lebensdauer beeinflussen. Alle vier Stämme wurden in parallel bei 20 ° C getestet (D) Dosis-Wirkungs-Kurve von Mirtazepine behandelt N2 Tiere. Mittlere Lebensdauer ist als eine Funktion der Mirtazepine Konzentration aufgetragen. Fehlerbalken zeigen den SEM von 8 Wells pro Zustand. 5. Materials. M9-Puffer, 1000 ml <ul><li> 6 g Na 2 HPO 4 </li><li> 3 g KH 2 PO 4 </li><li> 5 g NaCl </li><li> 0,25 g MgSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> Add entionisiertem Wasser auf 1000 mL </li><li> Autoclave </li></ul> Potassiumphosphate pH 6,0, 1000 ml <ul><li> 136 g KH 2 PO 4 </li><li> Add entionisiertem Wasser auf 900 ml </li><li> Der pH-Wert auf 6,0 mit 5M KOH </li><li> Add entionisiertem Wasser auf 1000 mL </li><li> Autoclave </li></ul> Trace Metall-Lösung <ul><li> 1,86 g Na 2 EDTA </li><li> 0,69 g FeSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,20 g MnCl 2 ∙ 4H 2 O </li><li> 0,29 g ZnSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,016 g CuSO 4 </li><li> 1000 mL VE-Wasser </li><li> Autoklaven und dunkel lagern. </li></ul> S-Basalmedium, 1000 ml <ul><li> 5,9 g NaCl </li><li> 50 ml 1 M Kaliumphosphat, pH 6,0 </li><li> 1000 mL VE-Wasser </li><li> Autoclave </li><li> Lassen Sie die Lösung abkühlen lassen und dann 1 mL 5 mg / mL Cholesterin (gelöst in Et-OH). </li></ul> Kaliumcitrat 1M, 1000 ml <ul><li> 268,8 g Trikaliumcitrat </li><li> 26,3 Zitronensäuremonohydrat </li><li> Add 900 ml VE-Wasser </li><li> Der pH-Wert auf 6,0 mit 5M KOH </li><li> Add entionisiertem Wasser auf 1000 mL </li><li> Autoclave </li></ul> S-Vollmedium, 1000 ml <ul><li> 977 ml S-basalen </li><li> 10 mL 1M Kaliumcitrat pH 6 (steril) </li><li> 10 mL Spurenmetalle Lösung (steril) </li><li> 3 ml 1M CaCl 2 (steril) </li><li> 3 mL 1M MgSO 4 (steril) </li></ul> NGM-Agar <ul><li> 3.0g NaCl </li><li> 2,5 g Pepton(Aus Casein-, Bauchspeicheldrüsen-Digest) </li><li> 17g Agar </li><li> Add entionisiertem Wasser auf 975 ml und einen Rührstab </li><li> Autoclave </li><li> Nach dem Autoklavieren abkühlen auf 55 ° C und fügen Sie die folgenden Komponenten: <ul><li> 0,5 ml 1M CaCl 2 (steril) </li><li> 1 ml 5 mg / ml Cholesterin in Ethanol </li><li> 1 ml 1M MgSO 4 (steril) </li><li> 25 mL Potassiumphosphate Puffer, pH 6,0 (steril) </li></ul></li></ul> TB, 1000 ml <ul><li> 12g Bacto Trypton </li><li> 24 g Hefe-Extrakt </li><li> 4 mL Glycerol </li><li> Add 900 ml VE-Wasser </li><li> Autoclave </li><li> Nach dem Autoklavieren abkühlen auf 55 ° C und fügen Sie die folgenden Komponenten: <ul><li> 100 ml 0,17 M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 </li></ul></li></ul> 0,6 mM Fluordeoxyuridin (FUDR, sigma cat # F0503), 1000 ml <ul><li> 100 mg FUDR </li><li> Man löst in 670 ml sterile S-abgeschlossen ist, machen 10 mL oder 45 mL Aliquots. </li><li> Lagerung bei -20 ° C. </li></ul> 100 mg / mL Carbenicillin, 10 mL <ul><li> 1 g Carbenicillin </li><li> 10 mL sterilem, deionisiertem Wasser </li><li> Sterile Filtrat und aliquoten </li><li> Lagerung bei -20 ° C. </li><li> Verwenden Sie bei einer Endkonzentration von 50 ug / mL </li></ul> 250ug / mL Amphotericin B, 4 ml <ul><li> 1mg Amphotericin B </li><li> 4 mL Et-OH </li><li> Lagerung bei -20 ° C </li><li> Verwenden Sie bei einer Endkonzentration von 0,1 pg / mL </li></ul>

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A. 96, 7394-7397 (1999).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li><li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+life-span+in+Caenorhabditis+elegans+by+four+clock+genes.">Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes.</a> Science. 272, 1010-1013 (1996).</li></ol>

Das Protokoll vorgestellt ermöglicht die Messung von C.elegans Lebensdauer in 96-Well Mikrotiterplatten. Wie in den repräsentativen Ergebnissen gezeigt Abschnitt es zuverlässig repliziert bisherigen Erkenntnisse und liefert quantitative Informationen. Mit diesem Test haben wir erfolgreich mehr als 89.000 Molekülen auf ihre Wirkung auf C.elegans Lebensdauer untersucht. Für die Zwecke der Drogen-Screening, Mess-Lebensdauer in einer 96-well Mikrotiterplatten-Format hat mehrere Vorteile gegenüber den klassischen festen Medien-Assay. Es reduziert die Arbeitskosten für die mediale Aufbereitung, die Höhe der Inkubation Raum, und die Menge des Medikaments erforderlich erforderlich. Der 96-well-Format und die Mikroskopie Setup ermöglicht die Automatisierung des gesamten Tests für hohen Durchsatz-Screenings. Bei der Entwicklung des Assays mehrere Werte für jede Variable und deren Kombinationen wurden auf ihre Auswirkungen auf C.elegans Lebensdauer getestet. Diese Tests enthalten verschiedene OP50 Konzentration im Bereich von 3 bis 10 mg / mL (3, 4, 6, 8, 10 mg / mL), unterschiedliche Anzahl von Würmern pro Vertiefung reicht von 7 bis 45 (7, 10, 15, 22, 45 Würmer / well), andere Kultur Volumina von 40 bis 150 ul pro Well (40, 60, 80, 100, 120, 150 mL), und Änderungen in der Zusammensetzung des Puffers. Wenn gefüttert mit Carbenicillin-resistente OP50, angegeben weder Carbenicillin noch Amphotericin B in den Konzentrationen gefunden wurden, um C.elegans Lebensdauer beeinflussen. Kontinuierliche leichtem Schütteln der Platten, wie so oft in C. elegans Flüssigkultur empfohlen, wurde festgestellt, entbehrlich für die kleinen Volumina in diesem Test verwendet. Leichtem Schütteln ist jedoch erforderlich, wenn Mikrotiterplatten mit größeren Bohrungen verwendet werden sollen. Die angegebenen Werte in diesem Protokoll wurden sorgfältig auf der Grundlage statistischer Vergleich der verschiedenen Bedingungen getestet ausgewählt. Die größte Überraschung an diesem Test ist wohl die Tatsache, dass C.elegans in 96-Well-Platten, die mit Klebeband verschlossen werden kann gehalten werden. Side-by-Side-Vergleiche zeigten keine Unterschiede in Lebensspanne von Tieren in unverschlossenen Platten kultiviert, in Platten mit einer Kunststoff-Versiegelung versiegelt, oder in Platten mit Versiegelungen, die den Luftaustausch ermöglichen versiegelt. In allen drei Bedingungen, entwickelten die Tiere sehr homogen von L1 bis gravid Erwachsenen innerhalb von 65 Stunden und zeigte sehr vergleichbar Lebensdauer. Tiere parallel auf NGM gewachsen entwickelt etwas schneller, aber dieser Unterschied war unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von einer Versiegelung. Das vorgestellte Protokoll ist am lebenden Bakterien, sondern kann für tote Bakterien adaptiert werden. Allerdings in einer Flüssigkeit Assay einem einzigen überlebenden Bakterien schnell vermehren, und füllen Sie die Kultur. In unsere Hände ist die einzige zuverlässige Methode, um Bakterien in dem Maße, dass sie für flüssige Kultur verwendet werden kann töten bei längerer Behandlung der Bakterien mit Gamma-Bestrahlung. Ein wichtiger Punkt bei der Planung von einer Lebensdauer Experiment prüfen, ist die Macht der Nachweisgrenze. Abhängig von der Größe des Effekts, muss die Wirkung der Droge von Interesse in mehreren Bohrlöchern getestet werden. In einem typischen Assay 4 Arzneimittel-behandelten und 4 Kontroll-Wells, was in etwa auf 40-50 Tiere jeder sollte ausreichen, um eine 30% ige Erhöhung der Lebensdauer in mehr als 95% der Versuche zu erkennen. Erhöht um 14% sind nur in 60% der Fälle erkannt und daher mehr replizieren Brunnen. Der Reichtum der Lebensdauer von Daten mit diesem Test erzeugt wird, kann genutzt werden für Versuche zu entwickeln oder sich anstrengen, bestimmte parametrische Modelle Gompertz 1 sein. Diese Gompertz Modelle sind nützlich, um die Macht der Erkennung zu ermitteln und die Anzahl der False Positives und Negative für große Bildschirme zu schätzen. Wir überprüfen die Vorhersagen der Modelle in blinden Experimente und nutzte sie, um die Zahl der falsch-negativen in großen Bildschirmen (unveröffentlichte Ergebnisse) zu schätzen. Zusammenfassend erwarten wir, dass die vorgelegten Test wird von großem Nutzen, um kleine Moleküle, die Lebensdauer von C. elegans zu erweitern und die zugrunde liegenden Mechanismen zu studieren zu identifizieren.

A correction to the article Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates was made.

Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Amphotericin B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>cat# 171375</td>
<td>Also called Fungizone</td>
</tr>
<tr>
<td>FUDR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>cat# F0503</td>
<td>FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water</td>
</tr>
<tr>
<td>Mianserin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>M2525-250MG</td>
<td>Use as positive control at 50&mu;M final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyproheptadine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>cat#C6022-MG</td>
<td>Alternative positive control at 10 &mu;M final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Sealing Tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>cat# 236370</td>
<td>Polyester, non-sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>96 well plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>cat# 351172</td>
<td>Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene</td>
</tr>
<tr>
<td>Nunclon flask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>cat# 178883</td>
<td>used for large volumes</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates

Lebensdauer ist ein biologischer Prozess, durch mehrere genetische Signalwege reguliert. Eine Strategie, um die Biologie des Alterns befassen, ist es, Tiere zu erforschen, die Hafen-Mutationen in Komponenten des Alters-Regulationswege. Wenn diese Mutationen stören die Funktion des Alters-Regulationsweg und somit verändern die Lebensdauer des gesamten Organismus, liefern sie wichtige mechanistische Einblicke 1-3. Eine andere Strategie, um die Regulierung der Lebensdauer zu untersuchen ist, um kleine Moleküle zu stören Alter Regulationswege verwenden. Bis heute sind eine Reihe von Molekülen bekannt Lebensdauer in verschiedenen Modell-Organismen zu erweitern und werden als Instrumente verwendet werden, um die Biologie des Alterns 4-16 zu studieren. Die Zahl der identifizierten Moleküle so weit ist klein im Vergleich zu den genetischen &quot;Toolset&quot; findest, die Biologie des Alterns zu studieren. Caenorhabditis elegans ist einer der bedeutendsten Modelle zur Untersuchung Alterung wegen seiner ausgezeichneten Genetik und kurze Lebensdauer von drei Wochen. In jüngerer Zeit hat C.elegans als Modellorganismus für Phänotyp basierte Drogen-Bildschirme 5,7,16-20 wegen seiner geringen Größe und seiner Fähigkeit, in Mikrotiterplatten wachsen entstanden. Hier präsentieren wir einen Test, um C.elegans Lebensdauer in 96 well Mikrotiterplatten zu messen. Der Assay wurde entwickelt und erfolgreich eingesetzt, um große Bibliotheken für Moleküle, die C.elegans Lebensdauer 7 erstrecken Bildschirm. Die Zuverlässigkeit des Tests wurde in mehreren Tests untersucht: erstens durch die Messung der Lebensdauer von Wildtyp-Tieren bei unterschiedlichen Temperaturen angebaut, zweitens durch die Messung der Lebensdauer von Mutanten mit veränderten Lebenserwartung, drittens durch die Messung von Veränderungen der Lebenserwartung in Reaktion auf unterschiedliche Konzentrationen des Antidepressivums Mirtazepine. Mirtazepine wurde zuvor gezeigt, auf Lebenszeit in C.elegans 7 erstrecken. Die Ergebnisse dieser Tests zeigen, dass der Test in der Lage, frühere Ergebnisse aus anderen Untersuchungen repliziert wird und quantitativ. Die Mikrotiter-Format macht es auch Lebensdauer-Test mit automatisierten Liquid-Handling-Systeme und ermöglicht die Integration in automatisierte Plattformen.

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Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In diesem Protokoll wird eine Methode zur Messung<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Lebensdauer in 96-Well Mikrotiterplatten.

Messung Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Mikrotiterplatten

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

36.4K Aufrufe.  The Scripps Research Institute. In diesem Protokoll wird eine Methode zur Messung Caenorhabditis elegans Lebensdauer in 96-Well Mikrotiterplatten.

Serie: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Messung Caenorhabditis elegans Life Span auf festen Medien

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Forschung

Biologie

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

Die Quantifizierung der Hefe Chronologisches Life Span durch Auswachsen von gealterten Zellen

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Mess-replikative Lebensspanne in der Hefe

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice-Cap: Ein Verfahren zur Züchtung von Arabidopsis Und Tomatenpflanzen in 96-well-Platten für High-Throughput-Genotypisierung

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandin Extraktion und Analyse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Mess Oxidativer Stress Widerstandsrat<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In 96-Well-Mikrotiterplatten

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

Messung der RAN-Peptidtoxizität in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Messung Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Mikrotiterplatten

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Messung Caenorhabditis elegans Life Span auf festen Medien

Die Quantifizierung der Hefe Chronologisches Life Span durch Auswachsen von gealterten Zellen

Mess-replikative Lebensspanne in der Hefe

Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Ice-Cap: Ein Verfahren zur Züchtung von Arabidopsis Und Tomatenpflanzen in 96-well-Platten für High-Throughput-Genotypisierung

Grundlegende

Prostaglandin Extraktion und Analyse in

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Mess Oxidativer Stress Widerstandsrat

Messung der RAN-Peptidtoxizität in C. elegans