Name: saturated fatty acids induce ceramide-associated macrophage cell death
Uploaded: 2017-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
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Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von der University of Louisville Startkapital und National Cancer Institute (Bethesda, MD) gewährt R01CA177679, R01CA180986.

das Protokoll von der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der University of Louisville gebilligt wurde.
 1. Maus Knochenmark abgeleitet Makrophagen (BMDMs) <ol><li>einschläfern eine 6 bis 8 Wochen alten, gesunden Wildtyp-Maus mit CO 2. Heften Sie es auf eine Dämmplatte und sprühen Sie es mit 70 % Ethanol, bis es getränkt ist. Entfernen Sie die Tibia/Femur-Knochen mit Zange und Schere. Setzen Sie sie in einer Petrischale mit 5 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Führen Sie alle Verfahren unter sterilen Bedingungen.</li>
	<li>Aufschneiden beide Enden der Tibia/Femur-Knochen mit einer Schere in einem sterilen Gewebekultur-Haube. Spülen Sie den Knochen mit einer 25 G Nadel mit PBS + 2 % fetalen bovine Serum (FBS) in einem 15 mL-Tube.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Knochenmarkzellen 500 X g, 4 ° C für 5 min.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL roten Blutzelle Lysis Puffer zur lyse der Erythrozyten (RBC) für weniger als 1 min. sofort mit 9 mL 1 X PBS verdünnt. Zentrifuge wieder wie in Schritt 1.3. Die Überstände dekantieren.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL 1 X PBS, filtern die Zellsuspension durch eine sterile 40 μm-Nylon-Netzgewebe in einem anderen 15 mL-Tube, Zelle Schutt/Klumpen zu entfernen. Zentrifuge wieder wie in 1.3. Die Überstände dekantieren.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 15 mL Roswell Park Memorial Institute mittlerer (RPMI) 1640 mit 5 % FBS und 10 μg/mL Gentamicin, Platte, die die Zellen in der Kulturschale von 100mm Gewebe am 37 o C-Inkubator für 60 min. Wirbel sanft das Gericht, die schwimmende herausnehmen Zellen, und zähle sie.</li>
	<li>Platte 6 x 10 6 Zellen in einer 100-mm-Schale mit 12 mL Makrophagen differenzieren Medien (RPMI 1640 mit 5 % FBS und 10 μg/mL Gentamicin, gemischt mit 30 % L929 konditionierten Media 10) mit 10 ng/mL rekombinanter Maus Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) für 2 Tage.</li>
	<li>Nach Kultivierung für 2 Tage in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO 2, füttern Sie jedes Gericht mit 6 mL frische Makrophagen differenzieren Medien mit 10 ng/mL M-CSF.</li>
	<li>Am Tag 5, 8 mL der alten Medien, ohne die Zellen zu stören und fügen 10 mL frisches Makrophagen differenzieren Medien mit 10 ng/mL M-CSF.</li>
	<li>Am 7. Tag ernten die Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) mit einer Zelle Heber. 
	Hinweis: Angehängte Makrophagen können auch mit 5 mL 1 mM EDTA mit 1 X PBS-Puffer für 5 bis 10 min losgelöst werden nach dem Entfernen der Float-Zellen und Platte zweimal mit 5 mL 1 X PBS waschen. Zentrifugieren Sie die Zellen wie in Schritt 1.3., Aufschwemmen sie in frische Makrophagen, die Medien zu unterscheiden und mit einer Hemocytometer zu zählen.
	<ol><li>Bestätigen die BMDMs &#39; Phänotyp durch Durchflusszytometrie als 5 beschrieben. Vorbereiten der abgeleiteten Maus Makrophagen in einer bestimmten Konzentration für die folgenden Studien.</li>
	</ol></li></ol> 2. BSA-fetthaltige Säure konjugieren Vorbereitung <ol><li>vorbereiten 2 mM BSA in sterilen PBS. Zum Beispiel wiegen 6,65 g BSA, hinzufügen 30 mL 1 X PBS aufzulösen, fügen Sie mehr PBS bis 50 mL Skalierung Komponenten um 2 mM BSA in 1 X PBS zu machen.</li>
	<li>Vorbereitung 5 mM individuelle Natriumsalz der Fettsäuren in 2 mM BSA. Heizen auf 37 ° C oder höher, wenn nötig, und beschallen die Mischung von 2 mM BSA und Natriumsalz von Fettsäuren, bis eine klare Lösung erhalten wird. 
	Hinweis: Im Vergleich zu ungesättigten Fettsäuren, gesättigter Fettsäuren benötigen eine höhere Temperatur und weitere Beschallungsdauer für auflösen.</li>
	<li>Filter die Fettsäuren-Säure-BSA-Lösung durch einen 0,22-μm-Filter, aliquoten es in 1,5 mL sterile Microcentrifuge Rohre, und speichern sie bei 4 ° C für den kurzfristigen Einsatz oder bei-20 ° C für langfristige Lagerung. Kein Niederschlag nach Lagerung bei 4 ° C im Kühlschrank beachtet werden.</li>
</ol> 3. Gesättigte Fettsäuren induzieren Zelle Tod der Maus Knochenmark abgeleitet Makrophagen <ol><li>BMDMs in einer Gewebekultur 24-Well-Platte-Platte mit 0,4 x 10 6 /mL in Makrophagen differenzieren Medien.</li>
	<li>Behandlung der Zellen mit 0,4 mM Palmitinsäure und Stearinsäure für 16 bis 24 h bei 37 ° C-Inkubator mit 5 % CO 2. BSA zu verwenden, als die Negativkontrolle.</li>
	<li>Ernte der Zellen mit einer Zelle Lifter nach Behandlung und spin-down der Zellen bei 500 X g, 4 ° C für 5 min.</li>
	<li>Beflecken Zellen mit Annexin V-Alexa 488 und 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) in 100 μL annexin V Bindung Puffer für 15 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Die Probe mit 200 µL annexin-Bindung Puffer verdünnen, vorsichtig mischen, dann halten Sie die Proben auf Eis nach der Inkubationszeit.</li>
	<li>Analysieren die gefärbten Zellen so bald wie möglich durch Flow Cytometry 5. Annexin V-Alexa 488 in FITC Kanal erkannt und 7-AAD in PerCP/PerCP-Cy5.5-Kanal erkannt wird.</li>
</ol> 4. Intrazelluläre Ceramid Färbung <ol><li>nach der Fettsäure-Behandlung, die Zellen wie in Schritt 3.3 ernten. Befestigen Sie die Zellen in 4 % Paraformaldehyd für 30 min.</li>
	<li>Die Probe mit 1 mL 1 X PBS waschen, spin-down als Schritt in 3.3 und dekantieren des Überstandes.</li>
	<li>Die Zellen mit Anti-Ceramid Primärantikörper (Verdünnung 1: 200) in 100 μl 1 X Permeabilisierung Puffer für 30 min. Färben</li>
	<li>Waschen und Spin down die Zellen wieder wie in Schritt 4.2.</li>
	<li>Die Zellen mit Anti-Maus IgM Sekundärantikörper (Verdünnung 1: 500) in 100 μl 1 X Permeabilisierung Puffer für 30 min. Färben</li>
	<li>Waschen und Spin down die Zellen wieder wie in Schritt 4.2. Fügen Sie 250 μl 1 X PBS und analysieren die gefärbten Zellen von Flow Cytometry 5. 
	Hinweis: Finden Sie die detaillierte Reagenz-Liste in der Tabelle von Geräten und Reagenzien.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+toxicity+of+fatty+acids+on+a+macrophage+cell+line+(J774).">Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774).</a> Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).</li><li>Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+high+and+low+affinity+fatty+acid+binding+sites+on+human+serum+albumin+revealed+by+NMR+drug-competition+analysis.">Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis.</a> J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).</li><li>Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+Acid+Saturation+of+Albumin+Used+in+Resuscitation+Fluids+Modulates+Cell+Damage+in+Shock:+In+Vitro+Results+Using+a+Novel+Technique+to+Measure+Fatty+Acid+Binding+Capacity.">Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity.</a> Shock. , (2017).</li><li>Vusse, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Albumin+as+fatty+acid+transporter.">Albumin as fatty acid transporter.</a> Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Fatty+Acid+Binding+Protein+Promotes+Saturated+Fatty+Acid-Induced+Macrophage+Cell+Death+through+Enhancing+Ceramide+Production.">Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production.</a> J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Fatty+Acid+binding+protein+promotes+skin+inflammation+induced+by+high-fat+diet.">Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet.</a> Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).</li><li>Wen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid-induced+NLRP3-ASC+inflammasome+activation+interferes+with+insulin+signaling.">Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling.</a> Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid-binding+protein+E-FABP+restricts+tumor+growth+by+promoting+IFN-beta+responses+in+tumor-associated+macrophages.">Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages.</a> Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).</li><li>Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitic+and+stearic+fatty+acids+induce+caspase-dependent+and+-independent+cell+death+in+nerve+growth+factor+differentiated+PC12+cells.">Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells.</a> J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. , (2008).</li><li>Dansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+binding+of+very-long-chain+fatty+acyl-CoA+esters+to+the+peroxisomal+non-specific+lipid-transfer+protein+(sterol+carrier+protein-2).">High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2).</a> Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).</li><li>Ulloth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+methyl-beta-cyclodextrin+toxicity+in+NGF-differentiated+PC12+cell+death.">Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death.</a> Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).</li></ol>

Die Autoren erklären keine finanziellen Interessenkonflikte.

Die richtige Vorbereitung der Fettsäure-Lösung ist von entscheidender Bedeutung für die biologische Funktion von Fettsäuren zu studieren. Die Neutralisation der Fettsäuren erhöht die Löslichkeit in wässriger Lösung. Natriumsalze der Fettsäuren, vor allem gesättigte Fettsäuren, sind jedoch noch der geringe Löslichkeit in Wasser oder PBS, wie wir beobachten. Eine Methode ist mit 95-100 % Ethanol helfen Fettsäure1auflösen. Mit dieser Methode kann auch bei niedrigeren Konzentrationen f?...

Fettsäuren spielen eine wichtige Rolle im Energiestoffwechsel und in der Synthese der Phospholipide der Membran in verschiedenen Arten von Zellen. Fettsäuren haben eine geringe wässrige Löslichkeit. Entsprechende Vorbereitung der Fettsäure ist von entscheidender Bedeutung für die Erforschung der biologischen Funktionen der Fettsäuren in Säugerzellen. Wenn Fettsäuren mit Ethanol vorbereitet sind, kann viele Fettsäuren ihre giftigen Seife (Reinigungsmittel) Wirkung auf die Zellmembran, auch bei relativ niedrigen Konzentrationen1angezeigt. Als natürliche, große Transporter für die freien Fettsäuren im Serum gilt als Serum-Albumin einen guten Träger für Fettsäure-Lieferung in Vitro für Fettsäure Funktion Assays2,3,4. Jedoch sind die Details der Vorbereitung der Fettsäure und Serum-Albumin-Konjugat in der Regel nicht verfügbar, obwohl viele Forschungsarbeiten mit Fettsäuren veröffentlicht worden sind.
Makrophagen express hoch epidermale Fettsäure-bindendes Protein und Fett Fettsäure-bindende Protein5,6,7,8. Sie aktiv Aufnahme gesättigten und ungesättigten Fettsäuren, die ihre Immunfunktionen regulieren kann. Um die Wirkung von Fettsäuren auf Makrophagen und andere Zellen zu untersuchen, wurden verschiedene Methoden der Fettsäure Vorbereitung angewandte1,7,9. Mit entsprechend vorbereitete Fettsäure/Serum-Albumin-Konjugate, um die Wirkung von Fettsäuren auf Makrophagen Funktion zu untersuchen, ist von entscheidender Bedeutung in biologisch sinnvolle Daten zu erhalten. Studien über die Auswirkungen der Fettsäuren auf Makrophagen Funktion bieten Grundkenntnisse und mögliche therapeutische Ziele in Bezug auf Fettsäure-Stoffwechsel bei Erkrankungen Makrophagen beteiligt.

<table><tbody><tr><td>CPX Ultrasonic Bath&amp;nbsp;</td><td>Bransonic</td><td>Model 2800</td><td></td></tr><tr><td>Sodium palmitate (PA)</td><td>Nu-Chek Prep, Inc.</td><td>S-1109</td><td>M.W. 278</td></tr><tr><td>Sodium stearate (SA)</td><td>Nu-Chek Prep, Inc.</td><td>S-1111</td><td>M.W. 306</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF)&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology,&amp;nbsp; Inc.</td><td>5228</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>VWR International</td><td>71002-878</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Fisher Scientific</td><td>A13201</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM)</td><td>Sigma</td><td>C8104-50TST</td><td>Clone: MID 15B4</td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgM Antibody, &amp;micro; chain, FITC conjugate</td><td>Sigma</td><td>AP128F</td><td></td></tr><tr><td>Fixation buffer</td><td>Biolegend</td><td>420801</td><td></td></tr><tr><td>Permeabilization buffer</td><td>Ebioscience</td><td>4307693</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysis Buffer&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V Binding Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>L929 cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Corning&amp;nbsp;Cell Lifter&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-364</td><td></td></tr><tr><td>Note: M.W. is for molecular weight.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

saturated fatty acids induce ceramide-associated macrophage cell death

Makrophagen express hoch epidermale Fettsäure-bindendes Protein und Fett Fettsäure-bindendes Protein. Sie aktiv Aufnahme gesättigten und ungesättigten Fettsäuren, die eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Immunfunktionen spielen könnte. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass verschiedene Fettsäuren, gesättigt oder ungesättigt, können unterschiedliche Auswirkungen auf das Zellwachstum und die Funktion besitzen. Allerdings variieren die Ansätze für die Fettsäure-Vorbereitung zu unphysiologischen Ergebnissen führen kann. Serum-Albumin, natürliche Träger für Fettsäuren in peripheren Säugetierblut wird empfohlen zur Bildung einer konjugiert komplex mit das Natriumsalz von Fettsäuren, Fettsäure-Funktion in Säugerzellen, minimiert die Toxizität von Fettsäure-Seife zu untersuchen. Somit ist eine einfache, relativ schnelle Heizung und beschallen Methode entwickelt und präsentiert hier für BSA-Fettsäuren konjugierte Säurebildung. Wir beschreiben ein Protokoll mit gesättigten Fettsäuren, vor allem Stearinsäure Säuren zu schweren Zelltod in der Maus Knochenmark abgeleitet Makrophagen induzieren. Wir zeigen weiter, dass gesättigte Fettsäure-induzierte Zelltod mit kumulierten zellulären Ceramid-Spiegel positiv assoziiert ist. Diese Methode kann für Studien über die Auswirkungen der Fettsäure auf andere Säugetier-Zellen erweitert werden.

Fettleibigkeit erhöht freie Fettsäure-Konzentrationen im Serum. Als professionelle Phagozyten aufgreifen Makrophagen aktiv Fettsäuren zu Host Homöostase. Bei diesen Prozessen können überladene Lipide Makrophagen Zelltod auslösen. Zu diesem Zweck wir BMDMs kultiviert in Vitro mit übergewichtigen diätetischen Fettsäuren und gemessenen Makrophagen Zelltod mit Flow durchflusszytometrischen Färbung. Im Vergleich zur BSA-Kontrolle, gesättigten Fettsäuren, induziert insbeso...

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Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Wir zeigen eine geradlinige Methode murine primären Makrophagen von Knochenmarkzellen zur Ableitung und eine einfache Methode zur Vorbereitung von BSA-Fettsäure konjugiert. Dann zeigen wir, dass gesättigter Fettsäuren Makrophagen Zelltod induzieren können, und solchen Zelltod positiv assoziiert mit zellulären Akkumulation von Ceramid-Ebenen ist.

Gesättigte Fettsäuren induzieren Ceramid-assoziierten Makrophagen Zelltod

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.2K Aufrufe.  University of Louisville. Wir zeigen eine geradlinige Methode murine primären Makrophagen von Knochenmarkzellen zur Ableitung und eine einfache Methode zur Vorbereitung von BSA-Fettsäure konjugiert. Dann zeigen wir, dass gesättigter Fettsäuren Makrophagen Zelltod induzieren können, und solchen Zelltod positiv assoziiert mit zellulären Akkumulation von Ceramid-Ebenen ist.

Serie: Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.

Isolierung, Charakterisierung und Reinigung der Makrophagen aus den Geweben von Fettleibigkeit bedingte Entzündung betroffen

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung von Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): Eine neue Methode zur Protein-Lipid-Wechselwirkungen Analyze

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Biologie

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution of inflammation. Accumulation of apoptotic debris in the body may trigger chronic inflammatory responses that lead to systemic autoimmune diseases over time. Impaired apoptotic cell clearance has been implicated in a variety of autoimmune diseases. Apoptotic clearance is a complex process rarely detected under physiological conditions. It involves abundant surface receptors and signaling molecules. Studying the process of apoptotic cell clearance provides insightful molecular mechanisms and subsequent biological responses, which may lead to the development of new therapeutics. Here, we describe protocols for the induction of apoptotic thymocytes, the preparation of peritoneal macrophages, and the analysis of apoptotic cell clearance by flow cytometry and microscopy. All cells will undergo apoptosis at a certain stage, and many residential and circulating cells can uptake apoptotic debris. Therefore, the protocol described here can be used in many applications to characterize apoptotic cell binding and ingestion by many other cell types.

Here, we present a protocol to prepare apoptotic thymocytes and peritoneal macrophages and analyze the efficiency of efferocytosis and the specific inhibitor-mediated blocking of apoptotic thymocytes engulfment. This protocol has a broad application in cell-mediated clearance of other particles including artificial beads and bacteria.

Experimentelle Analyse des Apoptotic Thymozyte Engulfment durch Macrophagen

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive fat accumulation leads to non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), &#160;which is potentially reversible and may evolve into non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and eventually cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). The molecular mechanisms linking lipid accumulation in hepatocytes with the progression to NASH, irreversible liver damage, fibrosis, cirrhosis, and even HCC still remains unclear. To this end, several in vitro and in vivo models have been developed to elucidate the pathological processes that cause NAFLD. In the present study, we describe a cellular model for the induction of liver vesicular steatosis that consists of DMSO-differentiated human hepatic HepaRG cells treated with the fatty acid salt sodium oleate. Indeed, sodium oleate-treated HepaRG cells accumulate lipid droplets in the cytoplasm and show typical features of steatosis. This in vitro human model represents a valuable alternative to in vivo mice models as well as to the primary human hepatocytes. We also present a comparison of several methods for the quantification and evaluation of fat accumulation in HepaRG cells, including Oil Red O staining, cytofluorimetric Bodipy measurement, metabolic gene expression analysis by qPCR, and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. CARS imaging combines the chemical specificity of Raman spectroscopy, a chemical analysis technique well-known in materials science applications, with the benefits of high-speed, high-resolution non-linear optical microscopies to allow precise quantification of lipid accumulation and lipid droplet dynamics. The establishment of an efficient in vitro model for the induction of vesicular steatosis, alongside an accurate method for the quantification and characterization of lipid accumulation, could lead to the development of early stage diagnosis of NAFLD via the identification of molecular markers, and to the generation of new treatment strategies.

In this study, we describe a detailed protocol for inducing liver vesicular steatosis in differentiated HepaRG cells with the fatty acid salt sodium oleate and employ methods for detection and quantification of lipid accumulation, including coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy, cytofluorimetric analysis, Oil red O staining, and qPCR.&#160;

Induzieren und Charakterisieren der vesikulären Steatose in differenzierten HepaRG-Zellen

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive ...

Medizin

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent live cells. Vital activities, such as survival, proliferation, growth, and differentiation, are among the many cellular functions modulated by apoptotic cells. The ability to recognize and respond to apoptotic cells appears to be a universal feature of all cells, regardless of lineage or organ of origination. However, the diversity and complexity of the response to apoptotic cells mandates that great care be taken in dissecting the signaling events and pathways responsible for any particular outcome. In particular, one must distinguish among the multiple mechanisms by which apoptotic cells can influence intracellular signaling pathways within viable responder cells, including: receptor-mediated recognition of the apoptotic cell, release of soluble mediators by the apoptotic cell, and/or engagement of the phagocytic machinery. Here, we provide a protocol for identifying intracellular signaling events that are induced in viable responder cells following their exposure to apoptotic cells. A major advantage of the protocol lies in the attention it pays to dissection of the mechanism by which apoptotic cells modulate signaling events within responding cells. While the protocol is specific for a conditionally immortalized mouse kidney proximal tubular cell line (BU.MPT cells), it is easily adapted to cell lines that are non-epithelial in origin and/or derived from organs other than the kidney. The use of dead cells as a stimulus introduces several unique factors that can hinder the detection of intracellular signaling events. These problems, as well as strategies to minimize or circumvent them, are discussed within the protocol. Application of this protocol should aid our expanding knowledge of the broad influence that dead or dying cells exert on their live neighbors, both in health and in disease.

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

Identifizierung von intrazellulärer Induzierte in lebenden Zellen durch Interaktion Signalisierung mit Benachbarte Zellen, die eine programmierten Zelltods

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Lebendzell-Imaging der Lipidtröpfchengröße und -fusion mit Oil Red O und BODIPY

Evaluation of Lipid Droplet Size and Fusion in Bovine Hepatic Cells

Lipid droplets (LDs) are organelles that play an important role in lipid metabolism and neutral lipid storage in cells. They are associated with a variety of metabolic diseases, such as obesity, fatty liver disease, and diabetes. In hepatic cells, the sizes and numbers of LDs are signs of fatty liver disease. Moreover, the oxidative stress reaction, cell autophagy, and apoptosis are often accompanied by changes in the sizes and numbers of LDs. As a result, the dimensions and quantity of LDs are the basis of the current research regarding the mechanism of LD biogenesis. Here, in fatty acid-induced bovine hepatic cells, we describe how to use oil red O to stain LDs and to investigate the sizes and numbers of LDs. The size distribution of LDs is statistically analyzed. The process of small LDs fusing into large LDs is also observed by a live cell imaging system. The current work provides a way to directly observe the size change trend of LDs under different physiological conditions.

Autor im Rampenlicht: Bewertung der Größe und Fusion von Lipidtröpfchen in bovinen Leberzellen  

The present protocol describes how to use oil red O to dye lipid droplets (LDs), calculate the size and number of LDs in a fatty acid-induced fatty hepatocyte model, and use BODIPY 493/503 to observe the process of small LDs fusing into large LDs by live cell imaging.

Evaluierung der Lipidtröpfchengröße und -fusion in bovinen Leberzellen

Lipid droplets (LDs) are organelles that play an important role in lipid metabolism and neutral lipid storage in cells. They are associated with a variety ...

Analyse von LPS/ATP-getriggerten Zelltodmechanismen in THP-1-Zellen

LPS and ATP-induced Death of PMA-differentiated THP-1 Macrophages and its Validation

Cell death is a fundamental process in all living organisms. The protocol establishes a lipopolysaccharide (LPS) and adenosine triphosphate (ATP)-induced phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)-differentiated lipid deposition in human monocyte (THP-1) macrophage model to observe cell death. LPS combined with ATP is a classic inflammatory induction method, often used to study pyroptosis, but apoptosis and necroptosis also respond to stimulation by LPS/ATP. Under normal circumstances, phosphatidylserine is only localized in the inner leaflet of the plasma membrane. However, in the early stages of pyroptosis, apoptosis, and necroptosis, the cell membrane remains intact and exposed to phosphatidylserine, and in the later stages, the cell membrane loses its integrity. Here, flow cytometry was used to analyze Annexin V and 7-Aminoactinomycin D (AAD) double staining to detect the cell death from the whole cells. The results show&#160;that substantial cells died after stimulation with LPS/ATP. Using scanning electron microscopy, we observe the possible forms of cell death in individual cells. The results indicate that cells may undergo pyroptosis, apoptosis, or necroptosis after stimulation with LPS/ATP. This protocol focuses on observing the death of macrophages after stimulation with LPS/ATP. The results showed that cell death after LPS and ATP stimulation is not limited to pyroptosis and that apoptosis and necrotic apoptosis can also occur, helping researchers better understand cell death after LPS and ATP stimulation and choose a better experimental method.

Autor im Rampenlicht: THP-1-Makrophagenreaktion auf LPS/ATP – Enthüllung des Pyroptose-, Apoptose- und Nekroptose-Spektrums

This protocol is based on LPS and ATP-induced death of PMA-differentiated THP-1 macrophages. We use flow cytometry to analyze Annexin V and 7-AAD double staining to detect cell death, using the whole cell and employing scanning electron microscopy to observe the cell membrane morphology.

LPS und ATP-induzierter Tod von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen und deren Validierung

Cell death is a fundamental process in all living organisms. The protocol establishes a lipopolysaccharide (LPS) and adenosine triphosphate (ATP)-induced ...

Gesättigte Fettsäuren induzieren Ceramid-assoziierten Makrophagen Zelltod

Zusammenfassung

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Isolierung, Charakterisierung und Reinigung der Makrophagen aus den Geweben von Fettleibigkeit bedingte Entzündung betroffen

Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung von Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): Eine neue Methode zur Protein-Lipid-Wechselwirkungen Analyze

Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Experimentelle Analyse des Apoptotic Thymozyte Engulfment durch Macrophagen

Induzieren und Charakterisieren der vesikulären Steatose in differenzierten HepaRG-Zellen

Identifizierung von intrazellulärer Induzierte in lebenden Zellen durch Interaktion Signalisierung mit Benachbarte Zellen, die eine programmierten Zelltods

Evaluierung der Lipidtröpfchengröße und -fusion in bovinen Leberzellen

Evaluierung der Lipidtröpfchengröße und -fusion in bovinen Leberzellen

Evaluierung der Lipidtröpfchengröße und -fusion in bovinen Leberzellen

LPS und ATP-induzierter Tod von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen und deren Validierung