Name: saturated fatty acids induce ceramide-associated macrophage cell death
Uploaded: 2017-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
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이 작품 루이빌 대학 시작 기금에 의해 부분적으로 지원 하 고 국립 암 연구소 (베 데스 다, 메릴랜드) R01CA177679, R01CA180986를 부여 합니다.

프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 루이스 빌 대학에 의해 승인 되었다.
 1. 마우스 골 수 유래 세포 (BMDMs) <ol><li>Euthanize CO 2를 사용 하 여 6에 8-주 오래, 건강 한 야생 타입 마우스. 폼 보드로 고정 하 고 그것이 젖 었 때까지 70% 에탄올 스프레이. 집게와가 위 경골/대 퇴 골 뼈를 제거 합니다. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 5 mL 1와 페 트리 접시에 넣어. 무 균 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다.</li>
	<li>오픈는 시저와 경골/대 퇴 골 뼈의 양쪽 끝에서에서 잘라 무 균 조직 문화 후드. 15 mL 튜브에 PBS + 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 25g 바늘 뼈를 플러시.</li>
	<li>500 x g, 4 ° C 5 분 대에 골 수 세포를 원심</li>
	<li>미만 1 분 9 mL 1 x PBS 가진 즉시 Dilute 위해 lyse 적혈구 (RBC)를 1 mL 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼에 셀 펠 릿 resuspend. 1.3 단계에서 원심 분리기 다시입니다. supernatants 가만히 따르다.</li>
	<li>셀 펠 릿 10 mL 1 x PBS에 resuspend, 세포 파편/덩어리를 제거 하려면 다른 15 mL 튜브에 불 임 40 μ m 나일론 메쉬를 통해 세포 현 탁 액을 필터링 합니다. 1.3에서 원심 분리기 다시입니다. supernatants 가만히 따르다.</li>
	<li>15 mL 로스웰 파크 기념 연구소 중간 (RPMI) 1640 5 %FBS 10 μ g/mL gentamicin, 37 o C 인큐베이터에서 100 m m 조직 문화 접시에 셀 60 분 부드럽게 요리, 소용돌이 대 한 부동 꺼내 접시에 셀 펠 릿 resuspend 세포, 그리고 그들을 계산.</li>
	<li>10 ng/mL 재조합 마우스 대 식 세포와 미디어 (5 %FBS 30 %L929 바른된 미디어 10 혼합 10 μ g/mL gentamicin RPMI 1640) 차별화 12 mL macrophage 6 x 10 6 셀 100 mm 접시에 접시 콜로 니 자극 인자 (M-CSF) 2 일.</li>
	<li>5% CO 2와 37 ° C 배양 기에서 2 일간 배양 후 각 접시 6 mL 신선한 macrophage 차별화 10 ng/mL M-CSF와 미디어 피드.</li>
	<li>5 일에 밖으로 오래 된 미디어의 8 mL 셀을 방해 하지 않고 고 추가 10 mL 신선한 macrophage 미디어 10 ng/mL M-CSF와 차별화.</li>
	<li>셀 기중 장치를 사용 하 여 골 수 유래 세포 (BMDMs) 수확 7 일에. 
	참고: 연결 된 대 식 세포 수 또한 될 해리 했다 5 mL 1 m m 5 ~ 10 분의 1 x PBS에 EDTA와 float 세포를 제거 하 고 두 번 5 mL 1 x PBS 가진 접시를 세척 후. 1.3 단계에서 세포를 원심., 미디어, 차별 하는 신선한 macrophage에 그들을 resuspend 및는 hemocytometer로 그들을 계산.
	<li>확인은 BMDMs <ol>&#39; 표현 형으로 cytometry에 의해 설명 5. 다음과 같은 연구에 대 한 특정 농도에 세포 파생된 마우스 준비.</li>
	</ol></li></ol> 2. BSA-지방산 산 켤레 준비 <ol><li>준비 2mm BSA 살 균 PBS에. 예를 들어 추가 30 mL 1 x PBS를 해산, 6.65 g BSA, 무게 추가 더 많은 PBS 50 mL까지 1 x PBS에 2mm BSA를 만들기 위해 구성 요소를 확장.</li>
	<li>2mm BSA에에서 지방산의 준비 5mm 개별 나트륨 소금. 필요한 경우, 37 ° C 이상가 열 하 고 명확한 해결책을 얻을 때까지 2mm BSA의 혼합물 및 지방산의 나트륨 염을 sonicate. 
	참고: 불포화 지방산에 비해, 포화 지방산 필요 더 높은 온도 및 더 많은 쥡니다 시간 해산.</li>
	<li>필터는 0.22 통해 지방-산 성-BSA 솔루션 μ m 필터, 약 수 1.5 mL 메 마른 microcentrifuge에 그것은 튜브, 단기 사용을 위한 4 ° C에 또는 긴 기간 저장을 위해-20 ° C에서 그들을 저장 하 고. 아니 강 수는 냉장고에서 4 ° C에서 저장 후 관찰 해야 합니다.</li>
</ol> 3. 포화 지방산 유도 세포 죽음의 마우스 골 수 파생 된 세포 <ol><li>미디어를 차별화 하는 대 식 세포에 10 6 /mL x 0.4 BMDMs 24-잘 조직 문화 접시에 접시.</li>
	<li>0.4 m m 팔 미 틴 산 및 스 테아 르 산 5% CO 2와 37 ° C 배양 기에서 16 ~ 24 h에 대 한 세포 치료. BSA를 사용 하 여 부정적인 컨트롤로.</li>
	<li>셀 치료 후 셀 기중을 수확 하 고 500 x g, 5 분에 4 ° C에서 셀 아래로 회전</li>
	<li>Annexin V-알 렉 사 488와 100에서 7-aminoactinomycin D (7-AAD) 세포를 얼룩이 μ annexin V 바인딩 버퍼 실 온에서 15 분.</li>
	<li>Annexin 바인딩 버퍼의 200 µ L로 샘플을 희석, 부드럽게, 혼합 후 잠복기 후 얼음 샘플을 유지.</li>
	<li>흐름 cytometry 5 스테인드 셀을 최대한 빨리 분석. FITC 채널에 감지 annexin V-알 렉 사 488와 7 AAD PerCP/PerCP-Cy5.5 채널에서 발견 되.</li>
</ol> 4. 세포내 세 라마 이드 얼룩 <ol><li>지방산 치료 후 수확 단계 3.3 에서처럼 셀. 다음 30 분에 대 한 4 %paraformaldehyde 셀 수정</li>
	<li>1 mL 1 x PBS와 샘플을 세척, 스핀 다운로 3.3에 고는 상쾌한 가만히 따르다.</li>
	<li>30 분에 대 한 100 μ 1 x permeabilization 버퍼에 셀 안티-세 라마 이드 1 차적인 항 체 (1: 200 희석)을 얼룩</li>
	<li>세척 및 스핀 아래로 단계 4.2에서 다시 셀.</li>
	<li>반대로 마우스 IgM 이차 항 체 (1: 500 희석)와 세포 30 분에 대 한 100 μ 1 x permeabilization 버퍼에 얼룩</li>
	<li>세척 및 스핀 다운 단계 4.2에서 다시 셀. 250 μ 1 x PBS를 추가 하 고 교류 cytometry 5 스테인드 세포 분석. 
	: 참고 장비 및 시 약의 테이블의 자세한 시 약 목록.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+toxicity+of+fatty+acids+on+a+macrophage+cell+line+(J774).">Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774).</a> Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).</li><li>Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+high+and+low+affinity+fatty+acid+binding+sites+on+human+serum+albumin+revealed+by+NMR+drug-competition+analysis.">Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis.</a> J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).</li><li>Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+Acid+Saturation+of+Albumin+Used+in+Resuscitation+Fluids+Modulates+Cell+Damage+in+Shock:+In+Vitro+Results+Using+a+Novel+Technique+to+Measure+Fatty+Acid+Binding+Capacity.">Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity.</a> Shock. , (2017).</li><li>Vusse, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Albumin+as+fatty+acid+transporter.">Albumin as fatty acid transporter.</a> Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Fatty+Acid+Binding+Protein+Promotes+Saturated+Fatty+Acid-Induced+Macrophage+Cell+Death+through+Enhancing+Ceramide+Production.">Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production.</a> J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Fatty+Acid+binding+protein+promotes+skin+inflammation+induced+by+high-fat+diet.">Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet.</a> Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).</li><li>Wen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid-induced+NLRP3-ASC+inflammasome+activation+interferes+with+insulin+signaling.">Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling.</a> Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid-binding+protein+E-FABP+restricts+tumor+growth+by+promoting+IFN-beta+responses+in+tumor-associated+macrophages.">Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages.</a> Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).</li><li>Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitic+and+stearic+fatty+acids+induce+caspase-dependent+and+-independent+cell+death+in+nerve+growth+factor+differentiated+PC12+cells.">Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells.</a> J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. , (2008).</li><li>Dansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+binding+of+very-long-chain+fatty+acyl-CoA+esters+to+the+peroxisomal+non-specific+lipid-transfer+protein+(sterol+carrier+protein-2).">High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2).</a> Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).</li><li>Ulloth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+methyl-beta-cyclodextrin+toxicity+in+NGF-differentiated+PC12+cell+death.">Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death.</a> Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).</li></ol>

저자는 금융 충돌의 관심을 선언합니다.

지방 산 성 해결책의 적절 한 준비는 지방산의 생물학적 기능 연구에 중요 한 중요성의 이다. 지방산의 중립화 수성 해결책에 있는 그것의 가용성을 증가 시킵니다. 그러나, 특히 포화 지방산, 지방산의 나트륨 염 우리가 관찰 물 또는 PBS에서 낮은 용 해도의 여전히 있습니다. 한 가지 방법은 지방산1해산 있도록 95-100% 에탄올을 사용 하는. 이 메서드를 사용 하 여 셀에 높은 독성 ?...

지방산이 에너지 대사에서와 다른 종류의 세포 막 인지질 합성에 중요 한 역할. 지방산은 낮은 수성 가용성이 있다. 지방산의 적절 한 준비는 포유류 세포에서 지방산의 생물 학적 기능을 공부를 위한 중요 한 중요성 이다. 지방산 에탄올 준비가 때 많은 지방산1상대적으로 낮은 농도 에서도 세포 막에 그들의 독성 비누 (세제) 효과 보여줄 수 있습니다. 무료 지방산은 혈 청에 대 한 자연, 주요 전송으로 혈 청 알 부 민 지방산 배달에서 생체 외에서 지방산 기능 분석 실험2,,34에 대 한 좋은 통신사를 간주 됩니다. 그러나, 지방산 및 혈 청 알 부 민 켤레의 준비의 세부 대개 하지 사용할 수 있습니다 지방산을 사용 하 여 많은 연구 논문 출판 되었습니다 비록.
대 식 세포는 매우 표 피 지방산 의무적인 단백질 및 지방 지방산 의무적인 단백질5,6,,78표현 한다. 그들은 적극적으로 호응을 포화 및 불포화 지방산이 면역 기능을 조절 수 있습니다. 대 식 세포와 다른 세포에 지방산의 영향 연구, 지방산 준비의 다른 방법이 적용된1,,79했다. 지방산은 대 식 세포 기능에 미치는 영향을 조사 하기 위해 적절 하 게 준비 된 지방산/혈 청 알 부 민 어원이 같은 말을 사용 하 여 생물학적으로 의미 있는 데이터를 얻기에 중요 한 중요성 이다. 대 식 세포 기능에 지방산의 영향에 대 한 연구는 기본적인 지식 및 대 식 세포 관련 질병에 지방 산 성 대사에 관련 된 잠재적인 치료 표적 제공할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>CPX Ultrasonic Bath&amp;nbsp;</td><td>Bransonic</td><td>Model 2800</td><td></td></tr><tr><td>Sodium palmitate (PA)</td><td>Nu-Chek Prep, Inc.</td><td>S-1109</td><td>M.W. 278</td></tr><tr><td>Sodium stearate (SA)</td><td>Nu-Chek Prep, Inc.</td><td>S-1111</td><td>M.W. 306</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF)&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology,&amp;nbsp; Inc.</td><td>5228</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>VWR International</td><td>71002-878</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Fisher Scientific</td><td>A13201</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM)</td><td>Sigma</td><td>C8104-50TST</td><td>Clone: MID 15B4</td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgM Antibody, &amp;micro; chain, FITC conjugate</td><td>Sigma</td><td>AP128F</td><td></td></tr><tr><td>Fixation buffer</td><td>Biolegend</td><td>420801</td><td></td></tr><tr><td>Permeabilization buffer</td><td>Ebioscience</td><td>4307693</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysis Buffer&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V Binding Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>L929 cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Corning&amp;nbsp;Cell Lifter&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-364</td><td></td></tr><tr><td>Note: M.W. is for molecular weight.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

saturated fatty acids induce ceramide-associated macrophage cell death

대 식 세포는 매우 상피 지방산 의무적인 단백질 및 지방 지방산 의무적인 단백질을 표현 한다. 그들은 적극적으로 호응을 포화 및 불포화 지방산, 면역 기능 조절에 중요 한 역할을 수 있습니다. 수많은 연구 다양 한 지방산, 포화 또는 불포화, 세포 성장 및 기능에 다른 영향을 보유. 그러나, 지방산 준비를 위해 사용 하는 방법 다는 비 생리 적인 결과 이어질 수 있습니다. 혈 청 알 부 민, 자연 캐리어 포유류 주변 혈액에서 지방산은 지방산 비누의 독성을 최소화 포유류 세포에서 지방산의 기능을 공부 하 공액 지방산의 나트륨 소금 복잡 한 성형에 대 한 것이 좋습니다. 따라서, 간단 하 고, 상대적으로 빠른 난방 및 메서드 sonicating 개발 이며 BSA 지방 산 성 어원이 형성에 대 한 여기에 제시. 우리는 포화 지방산, 특히 스 테아 르 산 마우스 골 수 유래 세포에 심각한 세포 죽음을 유도 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 더 포화 지방산 유도 된 세포 죽음은 긍정적으로 축적 된 세포 세 라마 이드 수준 연관 보여 줍니다. 이 메서드는 다른 포유류 세포에서 지방산의 영향 연구에 대 한 확장할 수 있습니다.

비만에 혈 청 자유로운 지방산 농도 증가합니다. 전문 식 세포로 세포 적극적으로 차지 지방산 호스트 항상성 유지를 합니다. 이 프로세스 동안 오버 로드 된 지질 대 식 세포 세포 죽음을 유도 수 있습니다. 이 위해, 우리는 BMDMs에서 체 외에 식이 지방산 및 흐름 cytometric 얼룩을 사용 하 여 측정 된 대 식 세포 세포 죽음의 비만 수준으로 교양. BSA 제어, 포화 지방산에...

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Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

우리는 murine 기본 세포 골 수 세포에서 파생 하는 스트레이트-앞으로 방법을 설명 하 고 BSA 지방산을 준비 하는 간단한 방법 변화. 포화 지방산은 대 식 세포 세포 죽음을 일으킬 수 있다 그리고 이러한 세포의 죽음은 확실히 세 라마 이드 레벨의 세포 축적와 관련 다음 설명 합니다.

포화 지방산은 세 라마 이드 관련 된 대 식 세포 세포 죽음을 유도

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.2K 조회수.  University of Louisville. 우리는 murine 기본 세포 골 수 세포에서 파생 하는 스트레이트-앞으로 방법을 설명 하 고 BSA 지방산을 준비 하는 간단한 방법 변화. 포화 지방산은 대 식 세포 세포 죽음을 일으킬 수 있다 그리고 이러한 세포의 죽음은 확실히 세 라마 이드 레벨의 세포 축적와 관련 다음 설명 합니다.

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Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.

절연, 특성화 및 비만 관련 염증에 의해 영향을 받는 조직에서 세포의 정화

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

연구

면역학 및 감염병학

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

자기 활성 셀 정렬 (LIMACS)를 사용하여 지질 소포 - 중재 동질 크로마 토그래피 : 단백질 지질 상호 작용을 분석하는 소설 방법

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

생물학

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution of inflammation. Accumulation of apoptotic debris in the body may trigger chronic inflammatory responses that lead to systemic autoimmune diseases over time. Impaired apoptotic cell clearance has been implicated in a variety of autoimmune diseases. Apoptotic clearance is a complex process rarely detected under physiological conditions. It involves abundant surface receptors and signaling molecules. Studying the process of apoptotic cell clearance provides insightful molecular mechanisms and subsequent biological responses, which may lead to the development of new therapeutics. Here, we describe protocols for the induction of apoptotic thymocytes, the preparation of peritoneal macrophages, and the analysis of apoptotic cell clearance by flow cytometry and microscopy. All cells will undergo apoptosis at a certain stage, and many residential and circulating cells can uptake apoptotic debris. Therefore, the protocol described here can be used in many applications to characterize apoptotic cell binding and ingestion by many other cell types.

Here, we present a protocol to prepare apoptotic thymocytes and peritoneal macrophages and analyze the efficiency of efferocytosis and the specific inhibitor-mediated blocking of apoptotic thymocytes engulfment. This protocol has a broad application in cell-mediated clearance of other particles including artificial beads and bacteria.

대 식 세포에의 한 사 멸 티 모 세포 침 몰의 실험 분석

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive fat accumulation leads to non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), &#160;which is potentially reversible and may evolve into non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and eventually cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). The molecular mechanisms linking lipid accumulation in hepatocytes with the progression to NASH, irreversible liver damage, fibrosis, cirrhosis, and even HCC still remains unclear. To this end, several in vitro and in vivo models have been developed to elucidate the pathological processes that cause NAFLD. In the present study, we describe a cellular model for the induction of liver vesicular steatosis that consists of DMSO-differentiated human hepatic HepaRG cells treated with the fatty acid salt sodium oleate. Indeed, sodium oleate-treated HepaRG cells accumulate lipid droplets in the cytoplasm and show typical features of steatosis. This in vitro human model represents a valuable alternative to in vivo mice models as well as to the primary human hepatocytes. We also present a comparison of several methods for the quantification and evaluation of fat accumulation in HepaRG cells, including Oil Red O staining, cytofluorimetric Bodipy measurement, metabolic gene expression analysis by qPCR, and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. CARS imaging combines the chemical specificity of Raman spectroscopy, a chemical analysis technique well-known in materials science applications, with the benefits of high-speed, high-resolution non-linear optical microscopies to allow precise quantification of lipid accumulation and lipid droplet dynamics. The establishment of an efficient in vitro model for the induction of vesicular steatosis, alongside an accurate method for the quantification and characterization of lipid accumulation, could lead to the development of early stage diagnosis of NAFLD via the identification of molecular markers, and to the generation of new treatment strategies.

In this study, we describe a detailed protocol for inducing liver vesicular steatosis in differentiated HepaRG cells with the fatty acid salt sodium oleate and employ methods for detection and quantification of lipid accumulation, including coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy, cytofluorimetric analysis, Oil red O staining, and qPCR.&#160;

분화된 HepaRG 세포에서 베아토시스 유도 및 특성화

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive ...

의학

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent live cells. Vital activities, such as survival, proliferation, growth, and differentiation, are among the many cellular functions modulated by apoptotic cells. The ability to recognize and respond to apoptotic cells appears to be a universal feature of all cells, regardless of lineage or organ of origination. However, the diversity and complexity of the response to apoptotic cells mandates that great care be taken in dissecting the signaling events and pathways responsible for any particular outcome. In particular, one must distinguish among the multiple mechanisms by which apoptotic cells can influence intracellular signaling pathways within viable responder cells, including: receptor-mediated recognition of the apoptotic cell, release of soluble mediators by the apoptotic cell, and/or engagement of the phagocytic machinery. Here, we provide a protocol for identifying intracellular signaling events that are induced in viable responder cells following their exposure to apoptotic cells. A major advantage of the protocol lies in the attention it pays to dissection of the mechanism by which apoptotic cells modulate signaling events within responding cells. While the protocol is specific for a conditionally immortalized mouse kidney proximal tubular cell line (BU.MPT cells), it is easily adapted to cell lines that are non-epithelial in origin and/or derived from organs other than the kidney. The use of dead cells as a stimulus introduces several unique factors that can hinder the detection of intracellular signaling events. These problems, as well as strategies to minimize or circumvent them, are discussed within the protocol. Application of this protocol should aid our expanding knowledge of the broad influence that dead or dying cells exert on their live neighbors, both in health and in disease.

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

세포 내 이웃 셀을받은 사멸 세포 죽음과의 상호 작용에 의해 실행 가능한 세포에서 유도 된 이벤트를 시그널링의 식별

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Oil Red O 및 BODIPY를 사용한 지질 방울 크기 및 융합의 라이브 셀 이미징

Evaluation of Lipid Droplet Size and Fusion in Bovine Hepatic Cells

Lipid droplets (LDs) are organelles that play an important role in lipid metabolism and neutral lipid storage in cells. They are associated with a variety of metabolic diseases, such as obesity, fatty liver disease, and diabetes. In hepatic cells, the sizes and numbers of LDs are signs of fatty liver disease. Moreover, the oxidative stress reaction, cell autophagy, and apoptosis are often accompanied by changes in the sizes and numbers of LDs. As a result, the dimensions and quantity of LDs are the basis of the current research regarding the mechanism of LD biogenesis. Here, in fatty acid-induced bovine hepatic cells, we describe how to use oil red O to stain LDs and to investigate the sizes and numbers of LDs. The size distribution of LDs is statistically analyzed. The process of small LDs fusing into large LDs is also observed by a live cell imaging system. The current work provides a way to directly observe the size change trend of LDs under different physiological conditions.

저자 스포트라이트: 소 간세포의 지질 액적 크기 및 융합 평가  

The present protocol describes how to use oil red O to dye lipid droplets (LDs), calculate the size and number of LDs in a fatty acid-induced fatty hepatocyte model, and use BODIPY 493/503 to observe the process of small LDs fusing into large LDs by live cell imaging.

소 간세포에서 지질 액적 크기 및 융합 평가

Lipid droplets (LDs) are organelles that play an important role in lipid metabolism and neutral lipid storage in cells. They are associated with a variety ...

THP-1 세포에서 LPS/ATP 유발 세포 사멸 메커니즘 분석

LPS and ATP-induced Death of PMA-differentiated THP-1 Macrophages and its Validation

Cell death is a fundamental process in all living organisms. The protocol establishes a lipopolysaccharide (LPS) and adenosine triphosphate (ATP)-induced phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)-differentiated lipid deposition in human monocyte (THP-1) macrophage model to observe cell death. LPS combined with ATP is a classic inflammatory induction method, often used to study pyroptosis, but apoptosis and necroptosis also respond to stimulation by LPS/ATP. Under normal circumstances, phosphatidylserine is only localized in the inner leaflet of the plasma membrane. However, in the early stages of pyroptosis, apoptosis, and necroptosis, the cell membrane remains intact and exposed to phosphatidylserine, and in the later stages, the cell membrane loses its integrity. Here, flow cytometry was used to analyze Annexin V and 7-Aminoactinomycin D (AAD) double staining to detect the cell death from the whole cells. The results show&#160;that substantial cells died after stimulation with LPS/ATP. Using scanning electron microscopy, we observe the possible forms of cell death in individual cells. The results indicate that cells may undergo pyroptosis, apoptosis, or necroptosis after stimulation with LPS/ATP. This protocol focuses on observing the death of macrophages after stimulation with LPS/ATP. The results showed that cell death after LPS and ATP stimulation is not limited to pyroptosis and that apoptosis and necrotic apoptosis can also occur, helping researchers better understand cell death after LPS and ATP stimulation and choose a better experimental method.

저자 스포트라이트: LPS/ATP에 대한 THP-1 대식세포 반응 — Pyroptosis, Apoptosis, and Necroptosis Spectrum 발표

This protocol is based on LPS and ATP-induced death of PMA-differentiated THP-1 macrophages. We use flow cytometry to analyze Annexin V and 7-AAD double staining to detect cell death, using the whole cell and employing scanning electron microscopy to observe the cell membrane morphology.

PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS 및 ATP 유도 사멸 및 그 검증

Cell death is a fundamental process in all living organisms. The protocol establishes a lipopolysaccharide (LPS) and adenosine triphosphate (ATP)-induced ...

포화 지방산은 세 라마 이드 관련 된 대 식 세포 세포 죽음을 유도

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Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출

대 식 세포에의 한 사 멸 티 모 세포 침 몰의 실험 분석

분화된 HepaRG 세포에서 베아토시스 유도 및 특성화

세포 내 이웃 셀을받은 사멸 세포 죽음과의 상호 작용에 의해 실행 가능한 세포에서 유도 된 이벤트를 시그널링의 식별

소 간세포에서 지질 액적 크기 및 융합 평가

소 간세포에서 지질 액적 크기 및 융합 평가

소 간세포에서 지질 액적 크기 및 융합 평가

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