Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIGMS (R01GM11755), P.W.J und ein Training Stipendium Stipendium vom National Cancer Institute (NIH) (CA009110), g.h. und j.h.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Johns Hopkins University genehmigt. Experimente wurden an Wildtyp C57BL/6J Mäusen durchgeführt.
1. Ernte fetale oder neonatale Eierstöcke und Vorbereitung der Prophase Chromatin breitet sich
<ol><li>Embryonen im 14,5 – 19,5 Tage Post-Coitum (Dpc) extrahieren Opfern Sie die trächtige Weibchen durch zervikale Dislokation oder CO2 Erstickung nach IACUC Richtlinien. Hinweis: Überspringen Sie Schritt 1.3 für postnatale Tag 1 – 5 Eierstöcke. Abbildung 1 enthält eine Zusammenfassung der meiotischen Prophase Bühnen in verschiedenen Altersstufen der embryonalen und postnatale bereichert.</li>
	<li>Öffnen Sie die Abdominopelvic Hohlraum mit sterile Schere, so dass eine v-förmige Öffnung. Aus der mütterlichen Gebärmutter Horn zu sezieren Sie, trennen Sie die Embryonen aus der Plazenta und transferieren Sie die Embryonen in 35 mm Petrischalen mit 3 mL vorgewärmten 1 x Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) bei 37 ° C. Hinweis: Ein Fliptop-Inkubator bei 37 ° C einstellen kann verwendet werden, um Temperatur zu halten. Darüber hinaus kann eine Temperatur geregelt-Glas-Bühne auch, Temperatur während der Eierstock Manipulation verwendet werden.</li>
	<li>Mit 3,5-Zoll-Chirurgische Scheren Embryonen oder Welpen über Enthauptung nach IACUC Richtlinien zu opfern. Legen Sie enthauptet Embryonen oder Welpen in vorgewärmten PBS vor weiteren Dissektion.</li>
	<li>Sezieren eines Embryos oder Welpen gleichzeitig in einer separaten 35 mm Petrischale mit 3 mL vorgewärmten PBS bei 37 ° C. Fahren Sie durch Schnitt entlang der ventralen Mittellinie von der hinteren Hälfte des Embryos, entlang der vorderen Hälfte unter die Vorderbeine und direkt oberhalb der hinteren Gliedmaßen und Rute wie in Abbildung 2A-Bbeschrieben.</li>
	<li>Öffnen Sie den Bauch mit 3,5-Zoll-chirurgische Schere. Mit feinen Spitzen Pinzette zu verdrängen oder entfernen Sie die Leber und Schleifen des Darms, die Eierstöcke in einer neuen 35 mm Petrischale mit 3 mL vorgewärmten PBS bei 37 ° C aussetzen (siehe Guide in Abbildung 2 b). Die Eierstöcke befinden sich direkt unterhalb und hinter der Niere in Richtung der hinteren Wand der Bauchhöhle (Abb. 2 b–C). Ein Leitfaden für die Unterscheidung zwischen männlichen und weiblichen Keimdrüsen wird in Abb. 2Dbereitgestellt. Hinweis: Für optimale Bedingungen schnell zu sezieren, die Eierstöcke nach trächtige Weibchen geopfert wird.</li>
	<li>Entfernen Sie beide Eierstöcke von jedem weiblichen Fetus mit einer feinen Spitze Pinzetten unter einer Dissektion Umfang und in einer Uhrgläser oder separate Brunnen von Multi-Well Platte mit 0,5 bis 1,0 mL vorgewärmten PBS und pflegen bei 37 ° C.</li>
	<li>Legen Sie jedes Paar der Eierstöcke in 0,5 mL Hypo-Extraktionspuffer (17 mM Trinatrium Citrat Dihydrat, 50 mM Saccharose, 5 mM EDTA, 0,5 mM DVB-t, 30 mM Tris-HCl, Proteasehemmer, pH 8,2) in einem sauberen Uhrglas oder ein kleiner Brunnen von einem 9-Well-Platte, und achten Sie auf die Eierstöcke Comp Tauchen vollständig. Inkubieren Sie mindestens 15 min lang, aber nicht mehr als 30 min. Hinweis: Hypo-Extraktionspuffer frisch machen und innerhalb von 2 h von DVB-t-Zusatz verwenden.</li>
	<li>Während der Inkubation mit einem hydrophobe Barriere Pap-Stift zeichnen Sie zwei 22 x 22 mm2 Quadrate auf ein sauberes Glas 25 x 75 mm2, 1 mm dicken Mikroskop-Objektträger, wie in Abbildung 3Agezeigt. Hinweis: Folien können rechtzeitig vorbereitet werden.</li>
	<li>Pipette 45 – 50 µL 100 mM Saccharose in eine saubere Folie und ein paar Eierstöcke bis zum Tropfen zu übertragen.</li>
	<li>Mit den Spitzen enden von zwei 27 G Nadeln, necken Sie die Eierstöcke auseinander um Zellen in die Saccharoselösung zu lösen. Mit der Pinzette große Stücke von Eierstock entfernen und sorgfältig pipette Saccharoselösung um Zellen zu verteilen.</li>
	<li>Platz 40 µL Fixativ Lösung (1 % Paraformaldehyd (PFA), 0,2 % Waschmittel (siehe Tabelle der Materialien), pH 9.2) in jedes Quadrat der vorbereitete Folie. Mit einem 200 µl Pipettenspitze Fixativ Lösung gleichmäßig über die Oberfläche der Folie.</li>
	<li>Pipette 20 µL des Saccharose-Mix auf jedes Quadrat von der Folie, die das Fixiermittel enthalten. Hinweis: Dies entspricht mit ein paar Eierstöcke pro Folie.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Folien in einer geschlossenen feuchten Kammer über Nacht bei Raumtemperatur. Hinweis: Die Übernachtung Inkubation reichen um (12-15 Stunden) bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Öffnen Sie den Deckel und lassen Sie die Folien vollständig an der Luft trocknen.</li>
	<li>Objektträger in einem Coplin Glas mit 50 mL 0,4 % Netzmittel-PBS-Lösung waschen (siehe Tabelle der Materialien) für 2 min an der Luft trocknen, und fahren Sie mit Immunolabelling-Protokoll (Schritt 6). Hinweis: Es kann möglich sein, die Folien bei-80 ° C für die spätere Verwendung zu speichern, aber dies variiert je nach Protein des Interesses. Gehen Sie für ein optimales Ergebnis sofort auf das Immunolabelling-Protokoll (Schritt 6).</li>
</ol>2. Metaphase ich Eizellenentnahme
<ol><li>Um die Anzahl der antrale Follikel von jeder Maus isoliert zu maximieren, intraperitoneal injizieren Sie geschlechtsreif Jungfrau weibliche Mäuse mit 5 IU trächtige Stute Serum Gonadotropin (PMSG, auch bekannt als equine Chorion-Gonadotropin (EKG)). Hinweis: Für optimale Eizelle Ertrag sollte Mäuse 1 bis 3 Monate alt, sein wie die Anzahl der Eizellen geerntet mit zunehmendem Alter abnimmt. Zur Vorbereitung der PMSG lösen Sie Flasche 5.000 IU in 100 mL sterilen PBS (5 U/0.1 mL) Store in Einweg-Aliquote von 600 µL bei-20 ° C auf.</li>
	<li>Bereiten Sie nach 44 – 48 h Kollektion Medium, minimale wesentliche Mittel alpha (MEMα) Mittel ergänzt mit 5 % fetalen bovine Serum (FBS) und 3 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA; MEMΑ/BSA/FBS). Sterilisieren Sie Medien durch einen 0,2 µm-Poren-Filter. Dekantieren Sie 2,5 mL MEMα/BSA/FBS in eine Glasschale per Mausklick Mittel- und warm auf 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator. Hinweis: Andere Sammlung und Kulturmedien, die im Handel erhältlichen (M2 und M16) sind auch allgemein verwendet. Achtung: Wir empfehlen entfernen Kultur Gerichte aus dem 5 % CO2 Inkubator, eine zu einem Zeitpunkt für begrenzte Dauer Umgebungsluft Belichtung während der Manipulation Schritte zu minimieren.</li>
	<li>Die Mäuse durch zervikale Dislokation oder CO2 Erstickung nach IACUC Richtlinien zu opfern.</li>
	<li>Öffnen Sie die Abdominopelvic Hohlraum mit steriler Schere, wodurch eine große v-förmige Öffnung. Mit Pinzette, verdrängen Sie Darm in Richtung des Kopfes von der Maus. Suchen Sie jedes uterine Horn; die Eierstöcke sind proximal zu den Brustkorb präsentieren. Halten Sie die Eileiter mit feinen Zangen und schneiden Sie das Fett Superior der Eierstöcke mit Dissektion Schere (Abbildung 4). Weiterhin halten die Eileiter und den Eierstock aus der Bursa und in Sammlung Schale mit MEMα/BSA/FBS Medium mit einem anderen Satz von feinen Pinzetten freisetzen. Hinweis: Wie in Schritt 1 ist es unerlässlich, die Eierstöcke bei 37 ° C zu halten und zu pflegen um 5 % CO2. Ein Fliptop-Inkubator bis zu 5 % CO2 Mix angeschlossen kann verwendet werden, um optimale Wartung der Temperatur- und CO2 -Konzentration zu ermöglichen. Darüber hinaus sollte eine Temperatur geregelt-Glas-Bühne auch, Temperatur während der Eizelle Manipulation verwendet werden.</li>
	<li>Mit einer 1 mL Spritze mit einem 27-Gauge-Nadel (oder ähnlicher Größe), Cumulus Eizelle komplexe lösen, indem manuell Durchbohrung der großen antrale Follikel.</li>
	<li>Sammeln Sie während der Beobachtung durch ein Mikroskop Dissektion, GV inszeniert Eizellen mit einer Mund-betrieben Glaspipette oder Kapillare oder einer handbetriebenen Mikrometer-Spritze (Abbildung 5). Sammeln Sie nur Eizellen, die freigegeben werden von antrale Follikel. GV Eizellen haben einen Durchmesser von ca. 90 µm. GV Eizellen können 2-3 Schichten von Granulosa Zellen umgeben sein, und haben einen Durchmesser von rund 200 µm.</li>
	<li>Kultur der Eizellen in einem sauberen Uhrglas oder ein 9-Well-Platte mit MEMα/BSA/FBS Medium für 6 h, Metaphase zu erreichen ich bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator.</li>
	<li>Fahren Sie mit Schritt 4 fort.</li>
</ol>3. Metaphase II (MII) Eizellenentnahme
<ol><li>Zur Maximierung der Oozyten isoliert von jeder Maus Spritzen Sie intraperitoneal geschlechtsreif Jungfrau weibliche Mäuse mit 5 IU der PMSG. Nach 44 – 48 h intraperitoneale Injektion mit 5 IU humanes Choriongonadotropin (hCG). Hinweis: Für optimale Eizelle Ertrag sollte Mäuse 1 bis 3 Monate alt, sein wie die Anzahl der Eizellen geerntet mit zunehmendem Alter abnimmt. Um hCG vorzubereiten, lösen eine Flasche 10.000 U in 200 mL PBS (5 U/0.1 mL). Speichern Sie in Einweg-Aliquote von 600 µL bei-20 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie nach 12 bis 14 Uhr MEMα/BSA/FBS Kollektion Medium, wie oben in Schritt 2.2 beschrieben.</li>
	<li>Die Mäuse durch zervikale Dislokation oder CO2 Erstickung nach IACUC Richtlinien zu opfern.</li>
	<li>Öffnen Sie die Abdominopelvic Hohlraum mit steriler Schere, wodurch eine große v-förmige Öffnung. Mit Pinzette, verdrängen Sie Darm in Richtung des Kopfes von der Maus. Suchen Sie jedes uterine Horn, die Eierstöcke sind proximal zu den Brustkorb präsentieren. Halten Sie die Eileiter mit feinen Zangen und schneiden Sie das Fett Superior der Eierstöcke mit Dissektion Schere (Abbildung 4). Dann entfernen Sie den Eierstock und Eileiter und legen in Sammlung Schale mit MEMα/BSA/FBS Medium. Hinweis: Wie in den Schritten 1 und 2 ist es unerlässlich, die Eierstöcke bei 37 ° C zu halten und zu pflegen um 5 % CO2. Ein Fliptop-Inkubator bis zu 5 % CO2 Mix angeschlossen kann verwendet werden, um optimale Wartung der Temperatur- und CO2 -Konzentration zu ermöglichen. Darüber hinaus sollte eine Temperatur geregelt-Glas-Bühne auch, Temperatur während der Eizelle Manipulation verwendet werden.</li>
	<li>Mit Hilfe einer 1 mL Spritze mit einem 27 G (oder ähnlicher Größe) oder scharfe Pinzette, reißen ein Loch in der Ampulle des Eileiters, die MII Eizellen freizugeben. Hinweis: Seien Sie vorsichtig, nicht zu beschädigen die Eizellen in der Ampulle. Der Ampulle erscheint geschwollen und durchscheinend, derart, dass die Eizellen sichtbar (Abbildung 4 sind).</li>
	<li>Ernten Sie MII Eizellen aus der Ampulle des Eileiters in eine neue Schale mit Sammlung Medium mit einer Mund-betrieben Glaspipette oder Kapillare oder einer handbetriebenen Mikrometer-Spritze (Abbildung 5).</li>
	<li>Fahren Sie mit Schritt 4 fort.</li>
</ol>(4) Eizelle Entblößung und Zona Pellucida entfernen
<ol><li>Bereiten Sie 300 IU/mL von Hyaluronidase in MEMα Medium ergänzt mit 3 mg/mL BSA zu Eizellen der umgebenden Kumuluszellen (2,5 mL/Maus) in ein Uhrglas und halten bei 37 ° C, 5 % CO2zu entblößen. Hinweis: Hyaluronidase Wirksamkeit sinkt stark nach 1 h der Vorbereitung. Für MII Eizellen ist Hyaluronidase Behandlung nicht erforderlich.</li>
	<li>Setzen Sie Eizelle-Cumulus Zelle komplexe bis 300 IU/mL von Hyaluronidase in MEMα/BSA 3 min um Eizellen der umgebenden Kumuluszellen entblößen aus. Achtung: Überschreiten Sie 3 min Exposition gegenüber Hyaluronidase, nicht, da es die Eizellen schädigen.</li>
	<li>Waschen Sie die Eizellen, transfer Eizellen zu einem frischen erwärmt MEMα/BSA mittlere Schüssel. Mit einem kleinen Mund betriebene Glaspipette oder Kapillare (etwas größer als der Durchmesser der Eizelle, die etwa 90 µm), pipette die komplexe oben und unten, um die Kumuluszellen vollständig zu lösen. Lassen Sie die Eizellen in den Inkubator zu erholen, während der Vorbereitung für den nächsten Schritt.</li>
	<li>Warmen sauren Tyrode-Lösung, MEMα/BSA und Waymouths Medien auf 37 ° C (500 µL/Maus). Platz 300 µL in jede Vertiefung der kleine 9-Brunnen Glasplatten.</li>
	<li>Entfernen Sie die Zona Pellucida (ZP) übertragen Sie 5 – 10 Eizellen in Tyrode Lösung. Setzen Sie die Eizellen für nur 30-45 s, um die Lösung. Hinweis: Zu wenig Kontakt mit der Lösung wird nicht die ZP vollständig entfernen, die die Eizellen platzen und Chromosomen Ausbreitung verhindert. Zu viel Belastung beschädigt und die Eizelle zu töten. ZP auflösen unter die Dissektion Mikroskop beobachten kann helfen bei der Optimierung der Belichtungszeit. Achtung: Mit frischen Tyrode-Lösung ist kritisch, da seine Funktion mit dem Alter abnimmt. Verwenden Sie einen frischen Brunnen Tyrode Lösung für jede Gruppe von Eizellen behandelt, um gleichmäßige Verdauung der ZP zu gewährleisten.</li>
	<li>Sofort nach dem ZP entfernen waschen Sie die Eizellen durch die Übertragung in erwärmten MEMα/BSA/FBS Medium. Wiederholen Sie dies waschen. Hinweis: Achten Sie bei der Übertragung von Eizellen leicht zusammenkleben und auf die Glaspipette oder Kapillare folgenden entfernen von der ZP. Vornässen der Glaspipette oder Kapillare in Waymouths Mediums werden Eizellen zusammenkleben minimieren.</li>
	<li>Und die Eizellen wieder für 30 Minuten in Waymouth Medium bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator.</li>
	<li>Fahren Sie mit Schritt 5 fort.</li>
</ol>5. MI und MII Eizelle Chromatin Spreads
<ol><li>Zeichnen Sie mit einem PAP-Stift, ein 11 x 44 mm2 Rechteck auf der Glas-Folie, wie in Abbildung 6Agezeigt.</li>
	<li>Beschichten die Folie mit einer dünnen Schicht Fixativ (1 % Paraformaldehyd, 0,2 % Triton X 100 H2O, pH 9.2) durch Pipettieren 100 µL Fixativ auf der Folie und die Folie hin und her schaukeln. Tippen Sie auf die Folie um loszuwerden überschüssige Fixiermittel.</li>
	<li>Zwischen 5 bis 10 Eizellen mit einer kleinen Mund Pipette Nadel mit als wenig Medien wie möglich holen Sie ab und ziehen Sie die Nadel in einer Linie über die Fixiermittel-beschichtete Folie während der Hinterlegung der Eizellen von 1 cm oberhalb der Folie in die Fixativ Lösung. Führen Sie diesen Schritt mit einer Dissektion Mikroskop um sicherzustellen, dass die Eizellen hinterlegt worden sind und dass sie platzen, haben. Hinweis: Die Eizellen sollte sofort auf der Folie platzen. Die Höhe, bei der die Eizellen sind, hinterlegt Auswirkungen der Grad des Chromatins zu verbreiten. Repräsentative Ergebnisse in Abbildung 6 für weitere Details zu sehen.</li>
	<li>Inkubieren Sie Folien bei Raumtemperatur in einer geschlossenen Kammer befeuchtete über Nacht erlauben das Chromatin zu halten.</li>
	<li>Die Folien vollständig an der Luft trocknen lassen und abspülen Folien in einem Coplin Glas mit 50 mL 0,4 % Netzmittel-H2O, pH 8.0.</li>
	<li>Fahren Sie mit Schritt 6 fort.</li>
</ol>(6) Immunolabelling
<ol><li>Bereiten Sie die Antikörper-Verdünnungspuffer (ADB) in Tabelle 1beschrieben.</li>
	<li>Bereiten Sie zwei Coplin Gläser mit 50 mL Waschlösung Puffer (WB) (10 % ADB in PBS verdünnt) und einem Coplin JAR-Datei mit 50 mL WB und 0,05 % Reinigungslösung (z.B.50 mL WB 250 µL 10 % Waschmittel hinzufügen).</li>
	<li>Waschen Sie die Folien, die in Abschnitt 1 und 5 dieses Protokolls für 10 min in einem Coplin JAR-Datei mit 50 mL WB vorbereitet wurden. Achtung: Nicht lassen Sie die Folien, die zu jedem Zeitpunkt während der Immunolabelling trocknen.</li>
	<li>Waschen Sie die Objektträger für 10 min in der Coplin Glas mit 50 mL WB und 0,05 % Lauge. Waschen Sie die Folien in den verbleibenden Coplin JAR-Datei mit 50 mL WB-Lösung für 10 min.</li>
	<li>Tippen Sie auf überschüssige Flüssigkeit und Cover Folie mit 100 µL der ausgewählten Primärantikörper in ADB verdünnt. Bei 4 ° C über Nacht in einer geschlossenen feuchten Kammer inkubieren. Hinweis: Inkubation kann verkürzt werden, um 2 bis 3 Stunden bei 37 ° C. Verwenden Sie kleinere Mengen von Antikörpern (z.B. 50 µL) durch die Folie mit einem Deckglas oder Parafilm abdecken.</li>
	<li>Spülen Sie Folien in einem Coplin Glas mit 50 mL 0,2 % Netzmittel-PBS-Lösung, pH 8.0.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 6,2 bis 6,5.</li>
	<li>Tippen Sie auf überschüssige Flüssigkeit und Cover Folie mit 100 µL der ausgewählten Sekundärantikörper in ADB verdünnt. Inkubieren Sie Folien 1 bis 2 Stunden bei 37 ° C in einer geschlossenen feuchten Kammer.</li>
	<li>Waschen Sie Objektträger 2 Mal für 10 min in Coplin Gläser mit 50 mL 0,2 % Netzmittel-PBS-Lösung, pH 8.0.</li>
	<li>Waschen Sie Objektträger 2 Mal für 5 min in Coplin Gläser mit 50 mL 0,2 % Netzmittel-H2O Lösung, pH 8.0.</li>
</ol>7. Montage Folien
<ol><li>Für Prophase Chromatin Spreads vorbereitet in Schritt 2, hinzufügen 100 µL Eindeckmedium mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, 1.5µg / mL). Für MI und MII Chromatin breitet sich bereit in Schritt 5, fügen 50 µL Eindeckmedium mit DAPI (1.5µg / mL). Tupfen Sie entfernt überschüssige Flüssigkeit.</li>
	<li>Ein 22 x 60 mm-Deckglas darauf legen und mit klaren Nagellack versiegeln. Speichern Sie in einer Folie Box bei 4 ° C oder-20 ° C bis zur Bewertung per Fluoreszenz-Mikroskopie. Hinweis: Tippen Sie leicht auf Deckglas, um überschüssige Eindeckmedium vor der Versiegelung mit Nagellack zu entfernen.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Chromatin Ausbreitung Vorbereitungen erlauben Forschern, weiblichen Säugetieren Meiose und die dynamische Lokalisierung von Proteinen, chronologisch zu studieren. Die embryonalen und neonatale Chromatin-Spreads ermöglichen genaue Analyse von Veranstaltungen das ganze meiotischen Prophase. Metaphase I und Metaphase II Chromatin Spreads können verwendet werden, um einzelne Schwester unterscheiden Chromatiden von Schwestern und gepaarten Homologen Chromosomen gepaart sowie Diploidie zu beurteilen. Im Vergleich dazu, kann...

Während der Spermatogenese werden große halbsynchrone Wellen der meiotischen Keimzellen in den Hoden zu Beginn der Pubertät und im gesamten Erwachsenenalter1schnell und kontinuierlich aufgefüllt. Im Gegensatz zu den Männchen wird Meiose bei den Weibchen nur während der fetalen Entwicklung eingeleitet. Nach der Geburt, Eizellen bleiben verhaftet in einem längeren Dictyate Stadium der Prophase I mit einer intakten Germinal Vesicle (GV; Kernhülle) bis zur Pubertät. Zu Beginn der Pubertät eine Teilmenge der Eizellen werden zyklisch ausgewählt, um Wachstum und Reifung, Kennzeichnung der Einleitung der meiotischen Wiederaufnahme zu unterziehen. Meiotische Wiederaufnahme in ausgewachsene Eizellen manifestiert sich durch das Verschwinden der GV in einem Prozeß bekannt als Germinal Vesicle Aufschlüsselung (GVBD). Die Eizelle wird dann Chromosom Kondensation und Segregation, gefolgt von Polkörperchen Extrusion. Eizellen werden bei der Progression zu MII verhaftet und stimuliert die zweite und letzte meiotische Teilung nur nach der Befruchtung abgeschlossen.
Weibliche Fruchtbarkeit hängt stark von dem Erfolg der meiotischen Prophase ich fortschreiten. Der Schlüssel hierzu ist eine physische Verbindung zwischen Homologen Chromosomen bekannt als Chiasmata, die durch Reparatur der induzierten DNA-Doppelstrang Brüchen (DSB) über Crossover Rekombination2vermittelt wird. Dieser Vorgang erfolgt im Rahmen der dynamischen eiweißreichen leski bekannt als des synaptonemalen Komplexes (SC), die zwischen Homologen Chromosomen zur Erleichterung ihrer Synapsis3bildet. Der SC ist ein Reißverschluss dreigliedrige Struktur, die besteht aus zwei parallelen seitlichen Elementen verbunden durch Zentralregion Proteine, die homologe zusammen in der gesamten laufenden DNA-Reparatur hält. Vor der Synapsis bilden Vorstufen von den seitlichen Elementen, genannt axiale Elemente zwischen Schwester Chromatiden. Synaptonemalen Komplex Proteine wie SYCP2 und SYCP3 bilden axiale Elemente, die zu den Achsen der Schwester Chromatids Zusammenhalt während der frühen Prophase colocalize. Diese später dienen als Bindungsstellen für die transversale Filament-Protein, SYCP1, das zentrale Element Montage und Synapsis zwischen ausgerichteten homologe4erleichtert. Maus Eizellen ist komplette Synapsis durch die Anwesenheit von 20 komplett entnehmen Sie bitte, dass überlappende SYCP3 und SYCP1 Strecken, die visualisiert werden können, mithilfe von Chromatin Zubereitungen verbreiten. SYNAPSIS ist bei Eintritt in die Pachytene Unterphase abgeschlossen wobei Reife Frequenzweichen, die in Form Chiasmata zwischen homologen bestimmt sind mit MutL Homolog (MLH1/3) Dimere Förderung ihre präzise Verarbeitung5,6 verziert sind , 7. Bauunterhaltung der Chromosomen (SMC) komplexe, einschließlich Cohesin, condensin und die SMC5/6-Komplex, sind wichtig für die Regulierung des Chromosoms Dynamik und Struktur im gesamten Meiose8,9, 10,11,12. Gemeinsam sorgen diese Ereignisse korrekte Bi-Ausrichtung der Homologen Chromosomen an den gegnerischen Spindel Polen nach Demontage des SC.
Die meiotische Zellzyklus ist ein leistungsfähiges Modell, die Rollen der verschiedenen Proteine im Genom Wartung aufgrund der programmierten Induktion und anschließende Reparatur der DNA DSB zu untersuchen. Säugetier-Meiose ist darüber hinaus auch eine relevante Modell für die Untersuchung von epigenetischen Modifikationen und Prägung13. Jedoch ist es technisch schwierig, bewerten diese Ereignisse während weibliche Meiose stattfindet in fetalen und neonatalen Eierstöcke bei Säugetieren (Abbildung 1). In 5 Subverteiler teilbar Prophase: Leptonema, Zygonema, Pachynema, Diplonema und Dictyate. Hier beschreiben wir, wie zu isolieren und zu unterscheiden zwischen fetalen und neonatalen Eierstöcke und Hoden (Abbildung 2). Adaptiert von zuvor beschriebenen Methoden, diese Handschrift auch beschreibt ein Protokoll (Schritt 1) mit video-Demonstration für die Vorbereitung der weiblichen meiotischen Prophase ich Chromatin breitet sich14,15,16,17 . Verbindung mit Immunolabelling, wie beschrieben in Schritte 6 und 7, dieses Protokoll ermöglicht detaillierte mikroskopische Analyse der Prophase ich Ereignisse in Eizellen.
Oogenese ist fehleranfällig und Chromosom Missegregation Ereignisse während der ersten meiotischen Teilung stellen die häufigste Quelle der genetischen Krankheit Nachkommen18,19. In diesem Manuskript (Protokoll (Schritt 2) beschreiben wir ein Protokoll, in dem grundiert Eierstöcke von Erwachsenen weiblichen Mäusen Reife GV inszeniert Eizellen entnommen sind. Unterstützende Bedingungen werden ausgewachsene Eizellen luteinisierendes Hormon-unabhängigen Wiederaufnahme der Meiose nach Isolation und Kultur20unterzogen. Nach meiotische Wiederaufnahme Eizellen durch Meiose ich Fortschritt, dann in Metaphase II zu verhaften. Eizellen bleiben in Metaphase II, verhaftet, wenn befruchtet. In den Schritten 2 – 5 passen wir uns zuvor aufgezeichneten Protokolle mit video-Demonstration zu beschreiben, wie zu sammeln, Kultur und Chromatin verteilt Vorbereitungen21MI und MII Eizellen vorbereiten. Dieser Chromatin Verbreitung Technik ermöglicht eine klare Immunolabelling der Proteine Chromosomen zugeordnet. Darüber hinaus dieses Protokoll kann auch zur Unterscheidung zwischen bivalenten und einwertigen Chromosomen und lösen weitere einzelne Schwester Chromatiden Bewertung der Eizelle Diploidie zu erleichtern. Daher kann dieses Protokoll neben enthüllt Lokalisierung Muster der meiotischen Proteine, auch als ein unschätzbares Werkzeug für die Aufklärung der Ursachen von Chromosom Missegregation während MI und MII dienen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>119-069-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm petri dishes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>T1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm x 12mm petri dishes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>T1103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>300-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissection scissors</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting&#160;scissors, sharp tip, 41/2&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watch glass square 1 5/8</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>742300</td>
			<td>Autoclave before each use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646563</td>
			<td>Add to hypotonic buffer immediately before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x Protease Inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Add to hypotonic buffer immediately before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in)</td>
			<td>Becton, Dickinson (BD)</td>
			<td>309623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>3063-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super PAP pen, large (liquid blocker)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>71310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde aqueous</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Detergent in manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen</td>
			<td>240-9020-Z10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jars</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-flo 200</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>74257</td>
			<td>Wetting agent in manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4877</td>
			<td>Store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin (HCG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0434</td>
			<td>Store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Spot Plates with nine concave cavities</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-748B</td>
			<td>Autoclave before each use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22260943</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brand Parafilm M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR701501</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-178-5B</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-178-5D</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitutoyo micrometer head</td>
			<td>Mituoyo</td>
			<td>150-208</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309646</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.45 &#956;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431220</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipette 5 3/4&#34;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>83 x 0.5 mm pipette tip</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P3080</td>
			<td>For making oocyte collection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waymouth&#39;s media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11220035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A3160602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td>For oocyte culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml filter units 0.22um</td>
			<td>Denville</td>
			<td>F5227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1788</td>
			<td>Store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-1270</td>
			<td>For ADB/wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470</td>
			<td>For ADB/wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slides (22mmx60mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SteREO Discovery.V8</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>495015-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MLH1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MA5-15431</td>
			<td>Dilution factor- 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-SYCP1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PA1-16763</td>
			<td>Dilution factor- 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-SCP3</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-20845</td>
			<td>Dilution factor- 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-centromere protein</td>
			<td>Antibodies Incorporated</td>
			<td>15-235</td>
			<td>Dilution factor- 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti- TOPOII</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109524</td>
			<td>Dilution factor- 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab78517</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Rec8</td>
			<td>Courtesy of Dr. Karen Schindler</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dilution factor- 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-11057</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-31573</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-11004</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-11013</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>Dilution factor- 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin spread preparations for the analysis of mouse oocyte progression from prophase to metaphase ii

Chromatin verbreitete Techniken haben am meisten benutzt, die dynamische Lokalisierung verschiedener Proteine während der Gametogenese, insbesondere für die Spermatogenese zu beurteilen. Diese Techniken ermöglichen für die Visualisierung von Protein- und DNA-Lokalisierung Muster bei meiotische Veranstaltungen wie homologe Chromosom Paarung, Synapsis und DNA zu reparieren. Während einige Protokolle in der Literatur beschrieben wurden, sind allgemeine Chromatin verbreitete Techniken mit Säugetieren Prophase Eizellen begrenzt und schwierig aufgrund des Zeitpunkts der Meiose Initiation in fetalen Ovarien. Im Vergleich dazu können Jugendliche männliche Mäuse mit höheren Erträgen ohne Mikrodissektion Prophase Spermatozyten abgeholt werden. Es ist jedoch schwierig, eine reine synchronisierte Population von Zellen in bestimmten Phasen aufgrund der Heterogenität der meiotischen und Post-meiotische Keim-Zell-Populationen in den Jugendlichen und Erwachsenen Hoden zu erhalten. Für die späteren Phasen der Meiose ist es vorteilhaft, die Eizellen durchläuft Meiose I (MI) oder Meiose II (MII), weil Gruppen von reifen Eizellen können von Erwachsenen weiblichen Mäusen gesammelt und wieder Meiose in Kultur angeregt zu beurteilen. Hier Methoden für meiotische Chromatin verteilt Vorbereitungen mit Eizellen seziert von fötale, neonatale und Erwachsenen Eierstöcke sind beschrieben mit dem dazugehörigen video-Demonstrationen. Chromosom Missegregation Veranstaltungen in Säugetieren Eizellen sind häufig, besonders während MI. Diese Techniken können verwendet werden, zu bewerten und zu charakterisieren, die Auswirkungen der verschiedenen Mutationen oder Umwelteinflüsse während der verschiedenen Stadien der Oogenese. Da gibt es deutliche Unterschiede zwischen Oogenese und Spermatogenese, sind die Techniken beschrieben wurden, innerhalb von unschätzbarem Wert für unser Verständnis von Säugetieren Oogenese und sexuell dimorphen Eigenschaften des Chromosoms und Protein Dynamik während der Meiose zu erhöhen .

Wir haben zwei Techniken zur Visualisierung und Bewertung meiotische Chromosomen in Eizellen beschrieben. Die erste Technik ist gesorgt, in Richtung Prophase Fortschreiten in embryonalen und neonatale Eierstöcke beurteilen. Prophase Chromatin Ausbreitung Vorbereitungen sind unglaublich wertvoll für zahlreiche dynamische Prozesse während der Meiose, einschließlich Chromosom Paarung, Synapsis visualisieren und desynapsis, homologe Rekombination und epigenetische Chromosom Umbau. Hier ze...

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II at JoVE.com

Chromatin-Spread-Präparate für die Analyse der Entwicklung von Maus-Oozyten von der Prophase zur Metaphase II | Genetik | Video

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin verteilt die Vorbereitungen für die Analyse der Maus Eizelle Progression von Prophase, Metaphase II

Oogenese bei Säugetieren ist bekanntermaßen anfällig für Fehler, vor allem auf Chromosom Missegregation. Dieses Manuskript beschreibt Chromatin verteilt Präparationsmethoden für Maus Prophase, Metaphase I und II inszeniert Eizellen. Diese grundlegenden Techniken ermöglichen die Untersuchung der Chromatin-gebundene Proteine und Chromosom Morphologie in Säugetieren Oogenese.

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

chromatin-spread-preparations-for-analysis-mouse-oocyte-progression

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15.2K Aufrufe.  Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health. Oogenese bei Säugetieren ist bekanntermaßen anfällig für Fehler, vor allem auf Chromosom Missegregation. Dieses Manuskript beschreibt Chromatin verteilt Präparationsmethoden für Maus Prophase, Metaphase I und II inszeniert Eizellen. Diese grundlegenden Techniken ermöglichen die Untersuchung der Chromatin-gebundene Proteine und Chromosom Morphologie in Säugetieren Oogenese.

Serie: Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous nature of most mammalian chromatin-modifying complexes. In order to overcome these hurdles, we have adapted a sequential salt extraction (SSE) assay for evaluating the relative binding affinities of chromatin-bound complexes. This easy and straightforward assay can be used by non-experts to evaluate the relative difference in binding affinity of two related complexes, the changes in affinity of a complex when a subunit is lost or an individual domain is inactivated, and the change in binding affinity after alterations to the chromatin landscape. By sequentially re-suspending bulk chromatin in increasing amounts of salt, we are able to profile the elution of a particular protein from chromatin. Using these profiles, we are able to determine how alterations in a chromatin-modifying complex or alterations to the chromatin environment affect binding interactions. Coupling SSE with other in vitro and in vivo assays, we can determine the roles of individual domains and proteins on the functionality of a complex in a variety of chromatin environments.

Sequential salt extraction of chromatin bound proteins is a useful tool for determining the binding properties of large protein complexes. This method can be employed to evaluate the role of individual subunits or domains in the overall affinity of a protein complex to bulk chromatin.

Sequentielle Salz Extraktionen für die Analyse von Bulk-Chromatin bindenden Eigenschaften von Chromatin komplexe ändern

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Forschung

Genetik

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

Analyse des c-KIT-Liganden-Promotors unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) in Maus-T-Zell-Linien

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV integration sites can be used as functional markers of active regulatory elements. Here, we present a retroviral scanning tool, which allows the genome-wide identification of cell-specific enhancers and promoters. Briefly, the target cell population is transduced with an mLV-derived vector and genomic DNA is digested with a frequently cutting restriction enzyme. After ligation of genomic fragments with a compatible DNA linker, linker-mediated polymerase chain reaction (LM-PCR) allows the amplification of the virus-host genome junctions. Massive sequencing of the amplicons is used to define the mLV integration profile genome-wide. Finally, clusters of recurrent integrations are defined to identify cell-specific regulatory regions, responsible for the activation of cell-type specific transcriptional programs.
The retroviral scanning tool allows the genome-wide identification of cell-specific promoters and enhancers in prospectively isolated target cell populations. Notably, retroviral scanning represents an instrumental technique for the retrospective identification of rare populations (e.g. somatic stem cells) that lack robust markers for prospective isolation.

Here, we describe a protocol for genome-wide mapping of the integration sites of Moloney murine leukemia virus-based retroviral vectors in human cells.

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites zur Definition zellspezifischer Regulierungsregionen

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Erzeugung von nativen Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Bibliotheken für Nukleosom Dichteanalyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly useful. Hydrodynamic tail vein injection of transposon-based constructs is an efficient method for genetic manipulation of hepatocytes in adult mice. In addition to constitutive transgene expression, this system can be used for more advanced applications, such as shRNA-mediated gene knock-down, implication of the CRISPR/Cas9 system to induce gene mutations, or inducible systems. Here, the combination of constitutive CreER expression together with inducible expression of a transgene or miR-shRNA of choice is presented as an example of this technique. We cover the multi-step procedure starting from the preparation of sleeping beauty-transposon constructs, to the injection and treatment of mice, and the preparation of liver tissue for analysis by immunostaining. The system presented is a reliable and efficient approach to achieve complex genetic manipulations in hepatocytes. It is specifically useful in combination with Cre/loxP-based mouse strains and can be applied to a variety of models in the research of liver disease.

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Hydrodynamic tail vein injection of transposon-based integration vectors enables stable transfection of murine hepatocytes in vivo. Here, we present a practical protocol for transfection systems that enables the long-term constitutive expression of a single transgene or combined constitutive and doxycycline-inducible expression of a transgene or miR-shRNA in the liver.

Konstitutive und induzierbaren Systeme für genetische In Vivo Änderung der Maus Hepatozyten mit hydrodynamischen Tail Vene Injektion

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

Generation der genomweiten Chromatin Konformation Capture Bibliotheken aus dicht inszenierten Anfang Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Histon-Modifikationen von Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein interactions in yeast. It allows analysis of a target region of interest without the need for prior knowledge about likely proteins bound to the target region. This, in theory, allows HyCCAPP to be used to analyze any genomic region of interest, and it provides sufficient flexibility to work in different cell systems. This method is not meant to study binding sites of known transcription factors, a task better suited for Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-like methods. The strength of HyCCAPP lies in its ability to explore DNA regions for which there is limited or no knowledge about the proteins bound to it. It can also be a convenient method to avoid biases (present in ChIP-like methods) introduced by protein-based chromatin enrichment using antibodies. Potentially, HyCCAPP can be a powerful tool to uncover truly novel DNA-protein interactions. To date, the technology has been predominantly applied to yeast cells or to high copy repeat sequences in mammalian cells. In order to become the powerful tool we envision, HyCCAPP approaches need to be optimized to efficiently capture single-copy loci in mammalian cells. Here, we present our adaptation of the initial yeast HyCCAPP capture protocol to human cell lines, and show that single-copy chromatin regions can be efficiently isolated with this modified protocol.

This is a method to identify novel DNA-interacting proteins at specific target loci, relying on sequence-specific capture of crosslinked chromatin for subsequent proteomic analyses. No prior knowledge about potential binding proteins, nor cell modifications are required. Initially developed for yeast, the technology has now been adapted for mammalian cells.

Anpassung der Hybridisierung erfassen der Chromatin-assoziierte Proteine für Proteomics für Säugerzellen

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly defined states of chromatin organization. The dynamic architecture of the nucleus is controlled by multiple mechanisms and shapes the transcriptional output programs. It is, therefore, important to determine locus-specific chromatin accessibility in a reliable fashion that is preferably independent from antibodies, which can be a potentially confounding source of experimental variability. Chromatin accessibility can be measured by various methods, including the Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements (FAIRE) assay, that allow the determination of general chromatin accessibility in a relatively low number of cells. Here we describe a FAIRE protocol that allows simple, reliable, and fast identification of genomic regions with a low protein occupancy. In this method, the DNA is covalently bound to the chromatin proteins using formaldehyde as a crosslinking agent and sheared to small pieces. The free DNA is afterwards enriched using phenol:chloroform extraction. The ratio of free DNA is determined by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) or DNA sequencing (DNA-seq) compared to a control sample representing total DNA. The regions with a looser chromatin structure are enriched in the free DNA sample, thus allowing the identification of genomic regions with lower chromatin compaction.

The plasticity of nuclear architecture is controlled by dynamic epigenetic mechanisms including non-coding RNAs, DNA methylation, nucleosome repositioning as well as histone composition and modification. Here we describe a Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements (FAIRE) protocol which allows the determination of chromatin accessibility in a reproducible, inexpensive, and straightforward manner.

Formaldehyd-gestützte Isolation regulatorischer Elemente auf die Maßnahme Chromatin Barrierefreiheit in Säugerzellen

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...