Name: application of chronic stimulation to study contractile activity-induced rat skeletal muscle phenotypic adaptations
Uploaded: 2018-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
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Wir sind dankbar für seine kompetente Lektüre des Manuskripts Liam Tyron. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Finanzierung von naturwissenschaftlich-technischen Forschung Rat von Kanada (NSERC), D. A. Haube. D. A. Hood ist auch der Inhaber einer Canada Research Chair in Zellphysiologie.

Alle tierbezogenen Verfahren wurden überprüft und genehmigt von der York University Animal Care Committee. Bei der Ankunft im Tierhaus an der York University erhielten alle Ratten mindestens fünf Tage, bis an ihre Umgebung vor dem chirurgischen Eingriff mit Verpflegung Ad Libitumzu akklimatisieren. Obwohl dieses Protokoll auf andere Arten15,17,22zuvor durchgeführt wurde, das aktuelle Papier baut auf die Pionierarbeit von Pette und Kollegen23 und konzentriert sich speziell auf die Rattenmodell.
1. Vorbereitung des chronischen kontraktilen Leistungseinheit
<ol><li>Überprüfen Sie mit einem Voltmeter, das Potenzial der Münze Lithiumbatterien. Hinweis: Sollte das Potenzial eines jeden Akkus 3,0 ± 0,10 V sein.</li>
	<li>Legen Sie zwei oder drei Batterien in den Schlitz des Gerätes, so dass das Gesamtpotenzial 6-9 V ist. Hinweis: Es liegt im Ermessen der Forscher zu prüfen, wie viel Potenzial (6 oder 9 V), weiterhin während der gesamten Versuchsdurchführung. Je nach Design der Studie und der gewünschten Intensität des Reizes können entweder 2 oder 3 Batterien verwendet werden.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass das Gerät über das Puls-Kennzeichen funktionsfähig ist, indem man das Gerät 1 Impuls von einem tragbaren Infrarot-Strobe Licht emittiert.</li>
</ol>2. chirurgische Verfahren chronische kontraktilen Aktivität
Hinweis: Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente vor dem chirurgischen Eingriff. Während und unmittelbar nach der Operation bleibt die Körpertemperatur der Ratten durch ein Heizkissen. Es ist wünschenswert, den chirurgischen Eingriff auf eine chirurgische drapieren durchzuführen. Der Chirurg sollte sterile OP-Handschuhe sowie einen sauberen Kittel tragen. Bei Bedarf empfiehlt es sich, eine Einweg-Atemschutzmaske tragen.
<ol><li>Betäuben Sie Ratten unter 1-3 % Isofluran Inhalation mit Sauerstoff, der durch ein Gas-Vaporizer-System betrieben wird. Bestätigen Sie, dass Tier vollständig durch Überprüfung Megalosauridae Zeh kneifen und durch Beobachtung der Atemwege Umfang und Tempo sediert ist. Wenden Sie okuläre Schmiermittel auf Augen, Trockenheit zu vermeiden. Wenden Sie eine subkutane Injektion von Meloxicam (0,5 mg/mL) bei 2 mg/kg. Hinweis: Es wird auch empfohlen, eine Multi-modale Anwendung der Analgesie (z.B. Meloxicam plus Lidocain), keine Schmerzen während und nach der Operation zu minimieren.</li>
	<li>Rasieren Sie sanft ein Streifen um den Rumpf von der Rückseite des Halses, der linken Megalosauridae sowie etwa hinter der Vorderbeine und über dem vorderen Thorax. Wischen Sie rasierte Bereichen mit Jod und Äthyl-Alkohol zu desinfizieren.</li>
	<li>Mit dem Tier auf den Bauch legen, machen einen kleinen Schnitt (~0.5 cm) auf der Rückseite des Halses in der Mitte der rasierte Region (tastbare Bereich zwischen den Schulterblättern) mit einem Skalpell (Nr. 10 Blatt).</li>
	<li>Suchen Sie die Peronaeus.<ol>
<li>Tier auf der rechten Seite und eine ~ 2-3 cm-langen Schnitt in der Haut der linken Megalosauridae. Zielbereich der Schnitt um die Oberschenkel-Muskel-Gruppen, die denkmalgeschützte zwischen den Grübchen des Kniegelenks und der Rückseite in der Nähe des Ursprungs der Rute ist. Hinweis: Achten Sie darauf, den ersten Schnitt-Bereich verunreinigen, wenn die Position des Körpers verändern.</li>
		<li>Chirurgische Schere gebogen mit stumpfen Spitzen, sezieren der subkutanen Bereich weit ~3.5 - 4 cm, trennt die Haut vom darunter liegenden Muskeln um eine Tasche zwischen geöffneten Haut und der darunter liegenden Muskeln zu machen. Öffnen Sie die Haut vom darunter liegenden Gewebe rund um den gesamten Umfang des Schnittes (~1.5 cm2).</li>
		<li>Machen Sie einen kleinen Schnitt (weniger als 0,5 cm) auf den Bizeps Femoris Muskel mit Chirurgische Scheren, um sicherzustellen, dass die Spitzen der Schere direkt nach unten durch den Muskel schneiden.</li>
		<li>Der Schnittbereich sanft zu öffnen, bis die internen Muskelgruppen und der Peronaeus sichtbar sind (die Tiefe des externen Muskelgewebe (z.B. Bizeps Femoris) ist um ~0.5 cm). Mit Pinzette, sanft Touch/Prise Nervus sichtbar und beobachten Sie die Reaktionen der Muskeln Zielgruppen (z. B. TA Muskel) und Zehen (sichtbare Dorsalflexion) zu bestätigen, dass die Peronaeus isoliert ist. Hinweis: Dieser Schritt sollte mit äußerster Vorsicht zu vermeiden, schneiden oder den Nerv Beschädigung erfolgen.</li>
		<li>Befestigen Sie das Fenster durch offen mit Metall Retraktoren ziehen, so dass die Größe des Fensters ~1.5 cm2 mit Nervus Peronaeus liegen in der Mitte des Fensters ist. Verwenden Sie kleine Metallhaken befestigt Gurte und/oder Gummibänder, die auf der Tischfläche (oder Chirurgie Board), nach unten befestigt sind (Abbildung 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>Befestigen Sie den Draht zu beiden Seiten des Nervs.<ol>
<li>~ 50-60 cm von Polytetrafluorethylen (PTFE) vorbereiten-feinen Edelstahl-Draht beschichtet und in der Mitte falten. Hinweis: Es möglicherweise hilfreich, PTFA-beschichtetem Draht unter dem UV-Licht vor der Operation verfügbar zu machen.</li>
		<li>Haken Sie den gefalteten Teil des Drahtes in den Schlitz des eine 30 cm lange Edelstahl-Stab. Übergeben Sie die Rute, zusammen mit den Draht, subkutan aus der offenen Tasche der Megalosauridae in den Bereich der kleinen Schnitt an der Rückseite des Halses in einem L-förmigen Muster am Bein und entlang der Mittellinie des Rückens.</li>
		<li>Finden Sie die beiden Enden des Drahtes bei der Megalosauridae. Streifen Sie die Drähte, da alle Leitungen PTFE-isoliert sind. Streifen Sie mit einem Skalpell, sorgfältig die Enden des Drahtes von ~1.5 cm. Wenn die Drähte ausgefranst werden, schneiden Sie sie aus und wieder Streifen. Wickeln Sie die abisolierte Enden einer abgestumpften 21-G-Nadel (5 Mal), so dass eine Spule. Sobald die Spulen richtig gemacht werden, lassen Sie die Nadel von ihnen.</li>
		<li>Mit einer Größe 6-0 chirurgische Seide, sichern Sie jeweils der Spulen auf beiden Seiten der Peronaeus (Abbildung 2A).<ol>
<li>Machen Sie einen Knoten am Ende der Spule, und auf der linken Seite des Nervs Naht. Sicherstellen Sie, dass die Spule bei 1,5-2,5 mm vom Nerv.</li>
			<li>Um die Spule zu sichern, gelten Sie zwei oder drei zusätzliche Nähte entlang der Spule.</li>
			<li>Wiederholen Sie diese Schritte auf der rechten Seite des Nervs.</li>
		</ol>
</li>
		<li>2-3 Tropfen antibiotische Lösung (Ampicillin in Kochsalzlösung; 132 mg/mL), und dann vorsichtig das Fenster (z.B. Bizeps Femoris Muskelgewebe) Größe 5-0 Seide mit Naht.</li>
	</ol></li>
	<li>Lose wind den verbleibenden Durchhang der Draht (über den Durchmesser des Zeigefingers) und in der subkutanen Tasche über die genähten Inzision des Bizeps Femoris Muskels (etwa oberhalb der Hüfte) einschieben.</li>
	<li>Geben Sie 2-3 Tropfen antibiotische Lösung wieder (Ampicillin in Kochsalzlösung; 132 mg/mL). Schließen Sie die geöffnete Haut durch Heften.</li>
	<li>Verbinden Sie die Drähte (aus dem Schnitt am Hals) mit der CCA-Stimulator.<ol>
<li>Verbinden Sie Pin Buchsen mit den Drähten.<ol>
<li>Schneiden Sie die Drahtschlinge, die aus der Schnitt an der Spitze des Halses zu 2 Kabelenden (Dies führt zu den Spulen zu beiden Seiten des Nervus Peronaeus vernäht) erstellen.</li>
			<li>Mit einem Skalpell, Streifen Sie die Enden der Drähte von ~0.5 cm. Cut off ausgefranste Drähte ab, wenn überhaupt.</li>
			<li>Langsam schieben Sie die abisolierten Teile der Drähte in das Loch der Pin Buchsen, und mit einem Lötkolben, Löten Sie der Drähte auf die Pin-Buchsen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Optional, überprüfen Sie die Verbindung von Drähten.<ol>
<li>Verbinden Sie die Stifte mit eine große Benchtop-Stimulator-Einheit über Krokodilklemmen.</li>
			<li>Ein Einzelimpuls von 9 V (0,1 ms, 10 Hz) um zu bestätigen, dass TA Muskel Verträge und den linken Dorsiflexes Fuß zu liefern.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Übergeben Sie die Pin verbunden-Drahtenden durch die sterile Gaze-Pad, die ~ 4 x 4 cm.</li>
		<li>Verbinden Sie die Stifte mit der CCA Stimulator Einheit.<ol>
<li>Übergeben Sie die Kabel durch das Loch im Boden des Feldes Stimulator. Hinweis: Dieses Feld ist eine hausgemachte Kammer für die CCA-Stimulator-Einheit und 3,5 cm × 3,5 cm × 2,5 cm13.</li>
			<li>Legen Sie die Pins in den Anschlussbuchsen am Gerät von CCA. Die CCA-Einheit legte sanft in die Kammer. Verwenden Sie eine stickige Tack, um das CCA-Gerät an der Unterseite der Kammer zu sichern.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Befestigen Sie mit eine sportliche Band oder poröse chirurgische Band der Kammers mit Klebeband um den rasierte Rumpf. Die Spitze der Kammer mit drei Schichten des Tapings schließen und beenden durch das Einwickeln von einer Bands um die Seiten der Stimulator Box, die Box (Abb. 2 b) zu sichern.</li>
	</ol></li>
	<li>Überprüfen, ob die CCA funktioniert indem man das Gerät in einen einzigen Impuls des Infrarot-Lichtes (Wellenlängenspektrum > 770 nm), die von einem tragbaren Infrarot-Stroboskop ausgegeben. Hinweis: Wenn die CCA ordnungsgemäß funktioniert, werden Forscher in der Lage sein zu sehen, dass die Megalosauridae Muskeln (z. B. TA) als Reaktion auf das Infrarotlicht öffentliche Auftraggeber sind.</li>
	<li>Beobachten Sie die Ratte zu und überwachen Sie die Temperatur, bis es vollständig Bewusstsein wiedererlangt hat. In einem Single-Insassen Käfig um Schaden von anderen Tieren zu verhindern Haus und lassen Sie keine Tunnel oder plastische Objekte in den Käfig für den Rest der Studie um das Risiko der Beschädigung des Geräts Stimulator oder Verletzung des Tieres. Versorgung mit einem Amoxicillin-inklusive Trinkflasche (0,5 mg/mL).</li>
	<li>Gelten Sie Dosis von 1 mg/kg von Meloxicam subkutan alle 24 h nach der Operation, die mindestens 72 h nach wie vor.</li>
</ol>3. chronische kontraktilen Aktivität
<ol><li>Können Sie nach der Operation mindestens 5-7 Tage für eine vollständige Wiederherstellung der Schnitt und Naht Gebiete in/um die Skelettmuskulatur. Hinweis: Während und nach CCA Verfahren gründlich überprüfen Sie jedes Tier Zustand durch die Beobachtung ihrer Verhaltensweisen (z. B. Essen, trinken und/oder verschieben). Darüber hinaus bestimmen Sie schweren Stress oder Nebenwirkungen durch eine Veränderung des Körpergewichts vor und nach dem CCA-Verfahren überprüfen.</li>
	<li>Am Tag der CCA-Stimulation, CCA durch die Aufdeckung der Stimulator-Einheit in einen einzigen Impuls von infrarotem Licht einschalten (Wellenlängenbereich > 770 nm) durch ein tragbares Infrarot-Stroboskop.</li>
	<li>3 oder 6 h 10 Hz CCA Stimulation anwenden. Hinweis: Der zeitliche Rahmen für die Stimulation obliegt der Forscher. Die Häufigkeit der Stimulation nie geändert wurde in diesen Experimenten und durch die Ausweitung der Stimulation von 3 bis 6 h/Tag, nach unserer Erfahrung nur sehr bescheidene Verbesserungen in der mitochondrialen Adaption eingehalten worden. Wenn möglich, überprüfen Sie die Stimulation und Tier alle 30-60 Minuten.</li>
	<li>Schalten Sie nach der gewünschten Zeit CCA das CCA-Gerät per Infrarot-Licht Exposition (gleicher Vorgang wie das Gerät einschalten).</li>
	<li>Wenn Sie mehrere Tage beantragen, wiederholen Sie den Schritt 3.2. bis 3.4.</li>
	<li>Zeitplan für die Erhebung der Gewebe zu bestimmen. Zum Beispiel sammeln Sie Gewebe 24 h nach Beginn der letzten Kampf des CCA (d.h.18 h nach der letzten CCA-Stimulation von 6 h), die unter der Narkose durchgeführt wird, wie bei den CCA chirurgischen Eingriff. Sofort nach dem Sammeln aller Gewebe, Tiere einschläfern von Herzen besteuert, während das Tier noch in Narkose ist.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die chronische kontraktilen (CCA) Aktivitätsmodell der Übung durch niederfrequente Muskel Stimulation in Vivo, ist ein hervorragendes Modell für das Studium Muskel phänotypische Anpassungen zur Ausübung von13,24,25 , 26. wie in früheren Studien20,27, CCA ist ein effektives Werkzeug, mit dem Forscher Steuern Training Volum...

Skelettmuskulatur kann anpassen und Ausbildung durch Veränderungen in der Bioenergetik und physikalische Struktur1ausüben. Eines der wichtigsten Veränderungen herbeigeführt durch Ausdauertraining ist mitochondriale Biogenese, welches durch eine Erhöhung der Expression des mitochondrialen Komponenten (z. B. Cytochrom C Oxidase [COX] Untereinheiten) ausgewertet werden kann, sowie der Ausdruck von die transcriptional Coactivator, PGC-1α-2. Eine wachsende Anzahl von Studien haben gezeigt, dass zahlreiche andere Faktoren, einschließlich der mitochondrialen Umsatz- und Mitophagy, auch wichtig für Muskel-Anpassungen sind. Jedoch die Mechanismen durch die akute oder chronische Übung regulieren diese Prozesse in der Skelettmuskulatur sind noch unklar.
Um die Wege abzugrenzen die Ausübung induzierten Muskel Anpassungen zu regulieren, haben verschiedene Übung Modelle in Nagetier Studien, einschließlich Laufband, Rad laufen und Schwimmen Übung gebräuchlich. Diese Protokolle haben jedoch einige Einschränkungen, dass ~ 4-12 Wochen nötig sind, um diesen phänotypischen Veränderungen3,4,5zu beobachten. Als alternative experimentelle Methode, niederfrequente Stimulation-induzierten chronischen kontraktilen Aktivität (CCA) hat effektiv verwendet, da es in einem wesentlich kürzeren Zeitraum zu Muskel Anpassungen führen kann (d. h. bis zu 7 Tagen) und seine Auswirkungen scheinen werden Sie vergleichbar oder sogar größer als andere Übung-Protokolle. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von hormonellen6, Temperatur7und neurologischen Auswirkungen8 Muskel-spezifische Reaktionen auf chronische Übung verstehen erschweren. Zum Beispiel Schilddrüsenhormone9,10 und Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF)-111 wurden identifiziert, um Muskel Training-induzierte Anpassungen zu vermitteln, die auch andere Signalwege im Skelett regulieren kann Muskel. CCA-induzierte Effekte sind vor allem minimal systemische Faktoren, so dass Fokus auf die direkte Reaktion des skelettartigen Muskels auf kontraktilen Aktivität geregelt.
Die Außeneinheit für CCA wurde erstmals von Tyler und Wright12und wurde mit Modifikationen12entwickelt. Kurzum, das Gerät besteht aus drei Hauptteilen: einem Infrarotdetektor, die durch die Einwirkung von Infrarotlicht, Impulsgeber und einen Puls-Indikator (Abbildung 1) aktiviert oder deaktiviert werden kann. Die detaillierte Schaltungsdesign des Referats Stimulator wurde zuvor13beschrieben. Die detaillierte und spezifische Merkmale der CCA finden Sie in größerer Tiefe in einer Reihe von Review Artikel14,15,16,17. In Kürze soll die Stimulation Protokoll Peronaeus bei tiefen Frequenzen zu aktivieren (z. B. 10 Hz), und der innervierten Muskulatur (m. Tibialis anterior [TA] und Beinstrecker m.digitorum Longus [EDL] Muskel) sind gezwungen, Verträge für eine vorgegebenen Zeitspanne (z.B. 3-6 h). Im Laufe der Zeit verschiebt dies die genannten Muskeln zu einer mehr aerobe Phänotyp, nachgewiesen durch eine Zunahme der Kapillardichte18 und mitochondriale Inhalt19,20,21. Daher ist diese Methode ein bewährtes Modell, einige der großen Ausdauer Training Anpassungen im skelettartigen Muskel der Ratten zu imitieren.
Dieser Beitrag stellt ein detailliertes Verfahren der Elektrode Implantation Operation, CCA zu induzieren, so dass die Forscher dieses Modell in ihre Übung Studien anwenden können. CCA ist ein hervorragendes Modell für das Studium des zeitlichen Verlauf des Muskels Anpassungen, wodurch ein wirksames Instrument für die Untersuchung von molekularen und Signalisierung Veranstaltungen zu beiden frühen und späteren Zeitpunkten nach Beginn der Übung Training.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dawley Rat</td><td>Charles River</td><td>Strain 400</td><td></td></tr><tr><td>Chronic contractile activity unit</td><td>Home-made</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>CCA unit protective box (3.5 x 3.5 x 2.5 cm)</td><td>Home-made</td><td>n/a</td><td>Box should be made of opaque material or covered in an opague tape</td></tr><tr><td>Coin lithium ion batteries (3V)</td><td>Panasonic</td><td>CR2016</td><td></td></tr><tr><td>Medwire</td><td>Leico Industries</td><td>316SS7/44T</td><td></td></tr><tr><td>Solder pin (socket)</td><td>Digi-Key</td><td>ED6218-ND</td><td></td></tr><tr><td>Zonas porous tape</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td>5104</td><td></td></tr><tr><td>Suture silk (Size 5)</td><td>Ethicon</td><td>640G</td><td></td></tr><tr><td>Suture silk (Size 6)</td><td>Ethicon</td><td>706G</td><td></td></tr><tr><td>Curved blunt scissor (11.5 cm Length)</td><td>F.S.T.</td><td>14075-11</td><td></td></tr><tr><td>Curved blunt scissor (15 cm Length)</td><td>F.S.T.</td><td>14111-15</td><td></td></tr><tr><td>Delicate haemostatic forceps (16 cm Length)</td><td>Lawton</td><td>06-0230</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Feather</td><td>3</td><td></td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>F.S.T.</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Stainless-steel rod (30 cm; 7mm diameter)</td><td>Home-made</td><td>n/a</td><td>Rod should have 5 mm slit in one end to hold the wire for tunneling under the skin</td></tr><tr><td>Clip applying forceps</td><td>KLS Martin</td><td>20-916-12</td><td></td></tr><tr><td>Staples (clips)</td><td>Bbraun</td><td>BN507R</td><td></td></tr><tr><td>Metal hooks/retractor</td><td>Home-made</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Povidone-iodine (500 mL)</td><td>Rougier</td><td>#NPN00172944</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium</td><td>Novopharm</td><td>#DIN00872644</td><td></td></tr><tr><td>Metacam</td><td>Boehringer</td><td>#DIN02240463</td><td></td></tr><tr><td>Digital multimeter (voltmeter)</td><td>Soar Corporation</td><td>ME-501</td><td></td></tr><tr><td>LED digital stroboscope</td><td>Lutron Electronic Enterprise</td><td>DT-2269</td><td></td></tr></tbody></table>

application of chronic stimulation to study contractile activity-induced rat skeletal muscle phenotypic adaptations

Skelettmuskulatur ist ein anpassungsfähiges Gewebe wie seine biochemischen und physiologischen Eigenschaften stark als Reaktion auf chronische Übung verändert werden. Um die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen, die verschiedenen Muskel-Adaptionen herbeizuführen, haben eine Reihe von Ausübung Protokolle wie Laufband, Rad laufen und Schwimmen-Übung in tierexperimentellen Studien verwendet worden. Jedoch üben diese Modelle erfordern eine längere Zeit zu Muskel-Anpassungen, die humorale oder neurologische Faktoren, wodurch ihre Anwendungen bei der Untersuchung der Muskel-spezifische Kontraktion-induzierte Anpassungen auch geregelt werden kann. Indirekte niederfrequente Stimulation (10 Hz) induzieren chronische kontraktilen Aktivität (CCA) hat als ein alternatives Modell für Übung Training eingesetzt, da es erfolgreich zu Muskel mitochondriale Anpassungen innerhalb von 7 Tagen, unabhängig von systemische Faktoren führen kann. Dieses Papier beschreibt die Operationstechniken der Skelettmuskulatur von Ratten, die Behandlung von CCA zuweisen für weit verbreitete Anwendung in Zukunft Studien erforderlich.

Wir haben gezeigt, dass chronische kontraktilen Aktivität (CCA) ein wirksames Instrument zur günstigen mitochondriale Anpassungen im skelettartigen Muskel induzieren ist. Ratten, die 7 Tage der CCA (6 h pro Tag) unterzogen anzeigen verbesserte mitochondriale Biogenese in der stimulierten Muskulatur im Vergleich zu den Megalosauridae unstimulierte kontralateralen (Kontrolle). Dieser Anstieg der mitochondrialen Biogenese wird durch erhöhte Protein-Expression von PGC-1α (<strong class="x...

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Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz des Aktivitätsmodells chronische kontraktilen der Übung, skelettartiger Muskel Stimulation induzierte Anpassungen in der Ratte Megalosauridae zu beobachten.

Anwendung der chronische Stimulation kontraktilen Aktivität induzierten Ratte Skelettmuskulatur phänotypische Anpassungen zu studieren

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

application-chronic-stimulation-to-study-contractile-activity-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.7K Aufrufe.  York University. Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz des Aktivitätsmodells chronische kontraktilen der Übung, skelettartiger Muskel Stimulation induzierte Anpassungen in der Ratte Megalosauridae zu beobachten.

Serie: Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

Myo-mechanischen Analyse von isolierten Skelettmuskel

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Forschung

Medizin

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

Muscle strains are one of the most common complaints treated by physicians. A muscle injury is typically diagnosed from the patient history and physical exam alone, however the clinical presentation can vary greatly depending on the extent of injury, the patient's pain tolerance, etc. In patients with muscle injury or muscle disease, assessment of muscle damage is typically limited to clinical signs, such as tenderness, strength, range of motion, and more recently, imaging studies. Biological markers, such as serum creatine kinase levels, are typically elevated with muscle injury, but their levels do not always correlate with the loss of force production. This is even true of histological findings from animals, which provide a "direct measure" of damage, but do not account for all the loss of function. Some have argued that the most comprehensive measure of the overall health of the muscle in contractile force. Because muscle injury is a random event that occurs under a variety of biomechanical conditions, it is difficult to study. Here, we describe an in vivo animal model to measure torque and to produce a reliable muscle injury. We also describe our model for measurement of force from an isolated muscle in situ. Furthermore, we describe our small animal MRI procedure.

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

An in vivo animal model of injury is described. The method takes advantage of the subcutaneous position of the fibular nerve. Velocity, timing of muscle activation, and arc of motion are all pre-determined and synchronized using commercial software. Post injury changes are monitored in vivo using MR imaging/spectroscopy.

Ein In vivo Nager-Modell der Kontraktion-induzierte Verletzung und nicht-invasive Überwachung von Recovery

Muscle strains are one of the most  common complaints treated by physicians. A muscle injury is typically diagnosed from the patient history and  physical ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which facilitate the functional assessment of the seeded cells. To that end, microscale cantilever technology offers a platform with which to measure the contractile functionality of a range of cell types, including skeletal, cardiac, and smooth muscle cells, through assessment of contraction induced substrate bending. Application of multiplexed cantilever arrays provides the means to develop moderate to high-throughput protocols for assessing drug efficacy and toxicity, disease phenotype and progression, as well as neuromuscular and other cell-cell interactions. This manuscript provides the details for fabricating reliable cantilever arrays for this purpose, and the methods required to successfully culture cells on these surfaces. Further description is provided on the steps necessary to perform functional analysis of contractile cell types maintained on such arrays using a novel laser and photo-detector system. The representative data provided highlights the precision and reproducible nature of the analysis of contractile function possible using this system, as well as the wide range of studies to which such technology can be applied. Successful widespread adoption of this system could provide investigators with the means to perform rapid, low cost functional studies in vitro, leading to more accurate predictions of tissue performance, disease development and response to novel therapeutic treatment.

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

This protocol describes the use of microscale silicon cantilevers as pliable culture surfaces for measuring the contractility of muscle cells in vitro. Cellular contraction causes cantilever bending, which can be measured, recorded, and converted into readouts of force, providing a non-invasive and scalable system for measuring contractile function in vitro.

Nutzung von Microscale Siliziumcantilevern to Cellular Kontraktionsfähigkeit beurteilen<em&gt; In-vitro-</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Biotechnik

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

Anwendungen<em&gt; In Vivo</em&gt; Funktionstest der Ratte Vorderer Schienbeingewebe Skeletal Muscle Repair Engineered für die Bewertung

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

Echtzeit- und wiederholte Messung des Skelettmuskelwachstums bei einzelnen lebenden Zebrafischen, die einer veränderten elektrischen Aktivität ausgesetzt sind

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

Entwicklungsbiologie

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

Verfahren für die Ratte<em&gt; In situ</em&gt; Skeletal Muscle kontraktilen Eigenschaften

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Biologie

Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study skeletal muscle reformation and function in a scalable format that is amenable to experimental manipulations. 3D muscle culture systems are desirable as they enable scientists to study skeletal muscle ex vivo in the context of human cells. 3D in vitro&#160;models closely mimic aspects of the native tissue structure of adult skeletal muscle. However, their universal application is limited by the availability of platforms that are simple to fabricate, cost and user-friendly, and yield relatively high quantities of human skeletal muscle tissues. Additionally, since skeletal muscle plays an important functional role that is impaired over time in many disease states, an experimental platform for microtissue studies is most practical when minimally invasive calcium transient and contractile force measurements can be conducted directly within the platform itself. In this protocol, the fabrication of a 96-well platform known as &#39;MyoTACTIC&#39;, and en masse production of 3D human skeletal muscle microtissues (hMMTs) is described. In addition, the methods for a minimally invasive application of electrical stimulation that enables repeated measurements of skeletal muscle force and calcium handling of each microtissue over time are reported.

This manuscript describes a detailed protocol to produce arrays of 3D human skeletal muscle microtissues and minimally invasive downstream in situ assays of function, including contractile force and calcium handling analyses.

Bewertung funktioneller Metriken der Skelettmuskelgesundheit in Mikrobeschwerden der menschlichen Skelettmuskulatur

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Ex Vivo Beurteilung der Kontraktilität, Müdigkeit und Alternans in isolierten Skelettmuskulatur

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction

Many neuromuscular diseases, such as myasthenia gravis (MG), are associated with dysfunction of the neuromuscular junction (NMJ), which is difficult to characterize in animal models due to physiological differences between animals and humans. Tissue engineering offers opportunities to provide in vitro models of functional human NMJs that can be used to diagnose and investigate NMJ pathologies and test potential therapeutics. By incorporating optogenetic proteins into induced pluripotent stem cells (iPSCs), we generated neurons that can be stimulated with specific wavelengths of light. If the NMJ is healthy and functional, a neurochemical signal from the motoneuron results in muscle contraction. Through the integration of optogenetics and microfabrication with tissue engineering, we established an unbiased and automated methodology for characterizing NMJ function using video analysis. A standardized protocol was developed for NMJ formation, optical stimulation with simultaneous video recording, and video analysis of tissue contractility. Stimulation of optogenetic motoneurons by light to induce skeletal muscle contractions recapitulates human NMJ physiology and allows for repeated functional measurements of NMJ over time and in response to various inputs. We demonstrate this platform&#39;s ability to show functional improvements in neuromuscular connectivity over time and characterize the damaging effects of patient MG antibodies or neurotoxins on NMJ function.

We describe a reproducible, automated, and unbiased imaging system for characterizing neuromuscular junction function using human engineered skeletal muscle tissue and optogenetic motoneurons. This system allows for the functional quantification of neuromuscular connectivity over time and detects diminished neuromuscular function caused by neurotoxins and myasthenia gravis patient serum.

Engineering und Charakterisierung eines optogenetischen Modells des humanen neuromuskulären Übergangs

Many neuromuscular diseases, such as myasthenia gravis (MG), are associated with dysfunction of the neuromuscular junction (NMJ), which is difficult to ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

Kontraktilität Messungen auf isolierte Papillarmuskeln für die Untersuchung von Herz Inotropie bei Mäusen

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Anwendung der chronische Stimulation kontraktilen Aktivität induzierten Ratte Skelettmuskulatur phänotypische Anpassungen zu studieren

Zusammenfassung

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