Diese Forschung wurde von National Institute of Health Zuschuss Zahlen R01NS050452 und R01EB009429 finanziert. Herstellung der Cantilever-Chips wurde von außen durch Mitarbeiter an der Nanofabrication Einrichtung an der Cornell University durchgeführt. Alle Geräte in der freitragenden Herstellungsprozess verwendet wurde in dieser Anlage entfernt. Besonderen Dank an Mandy Esch und Jean-Matthieu Prot für die Unterstützung bei freitragenden Mikrofabrikation. Video-Animation des Auslegers Funktionalität wurde von Charles Hughes, Alex und Eric Zelenin Imperiale aus dem synthetischen Reality Lab an der UCF erzeugt.

1. Freischwinger Chipfertigungs Dargestellten Details der beschriebenen Herstellungsschritte sind in Figur 1 versehen. <ol><li> Platzieren Silicon-On-Insulator (SOI)-Wafer in einem Ofen gebacken und bei 125 ° C für 20 Minuten, um sie zu entwässern. </li><li> Abscheidung einer 1,5 um dicken Schicht aus Siliziumoxid auf den Griff Schicht des entwässerten SOI Wafers unter Verwendung einer Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD)-Tool. </li><li> Platzieren des Wafers auf dem Spin-Coater Futter mit der Vorrichtungsschicht nach oben weist. Sicherzustellen Wafer zentriert Streifen 2 ml P20-Primer auf der Mitte des Wafers und Schleudern bei 3000 Upm für 60 sec bei einer Beschleunigung von 1000 Umdrehungen / sec. P20 Primer fördert die Haftung des Photoresist an der Vorrichtungsschicht. </li><li> Während der Wafer weiterhin auf dem Spin-Coater Futter Streifen 2 ml S1818 Photoresist auf die Mitte des Wafers und Schleudern bei 3000 Upm für 60 sec bei einer Beschleunigung von 1000 Umdrehungen / Sek obtain eine 1,5 um dicke Schicht Photolack. </li><li> Legen Sie die Wafer auf einer heißen Platte und führen Sie einen Soft backen bei 115 ° C für 1 min. </li><li> Durchführen einer harten Kontakt UV Belichtung unter Verwendung einer Photolithographie-Kontaktmaskenausrichter, um das Muster von der Auslegermaske auf den Fotolack auf der Geräteschicht übertragen. Berechnung der Belichtungszeit auf der Grundlage einer Belichtungsenergie von 125 mJ / cm 2 für S1818 Photoresist. </li><li> Entwicklung der Photolack durch Eintauchen der Wafer in einem Fotolack 726 MIF-Entwickler für 1 min unter leichtem Schütteln der Wafer hin und her. </li><li> Spülen Sie die Wafer mit deionisiertem (DI) Wasser und trocknen Sie sie am besten mit einem Spin-rinse Trockner (SRD)-Tool. </li><li> Entfernen des Photoresists von der Kante des Wafers (bis zu 5 mm von der Kante) mit einem Wattestäbchen in Aceton getaucht. </li><li> Laden Sie die Wafer in einer tiefen Reactive Ion Etch (DRIE) Werkzeug, mit dem Photoresist Seite nach oben, und führen Sie ein Rezept, um die strukturierte Siliziumschicht durch die Devi ätzence-Schicht. Die vergrabene Oxidschicht dient als Ätzstopp, so führen eine Ätzung mit 50% bis 100% mehr Zyklen, als erwartet wird erforderlich zu sein, um ein vollständiges Ätzen zu gewährleisten. </li><li> Platzieren des Wafers in einem heißen Bad Photoresistlösung für 20 min, um die Fotolackentfernung. Übertragen Sie die Wafer einem Eilgang-Rinser (QDR), um die Wafer mit DI-Wasser spülen. Nach der Fotolackentfernung, laden Sie die Wafer in einer SRD-Tool zu spülen und trocknen Wafer. Überprüfen Sie die Wafer unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, der Ausleger Muster erscheint, wie erwartet. </li><li> Abscheidung einer 1 um dicken Schicht von undotiertem Siliziumoxid auf der Bauteilschicht des Wafers unter Verwendung eines PECVD-Anlage. Diese Oxidschicht dient als Schutzschicht für die Ausleger während der weiteren Verarbeitungsschritte. </li><li> Platzieren des Wafers auf dem Spin-Coater Spannfutter mit der Griffschicht nach oben, um die Verarbeitung von der Rückseite des Wafers beginnen. Sicherzustellen Wafer zentriert Streifen 2 ml P20-Primer auf der Mitte des Wafers und Schleudern bei 3000 UpMfür 60 Sekunden bei einer Beschleunigung von 1000 U / sec. </li><li> Während der Wafer weiterhin auf dem Spin-Coater Futter Streifen 2 ml SPR220-4.5 Photoresist auf die Mitte des Wafers und Schleudern bei 2000 Upm für 45 sec bei einer Beschleunigung von 1000 Umdrehungen / sec, um eine 6,5 um dicke Schicht zu erhalten, Photoresist. </li><li> Legen Sie die Wafer auf einer heißen Platte Nähe, um eine weiche backen bei 115 ° C für 2 min durchzuführen. </li><li> Mit Hilfe eines Photolithographie Kontakt Ausrichter der Lage, vorne / hinten Ausrichtung, richten Sie die Rückseite Fenster Maske auf der Vorderseite freitragende Muster und führen Sie eine harte Kontakt UV-Exposition, um die Muster von der Rückseite Fenster Maske auf den Photolack auf dem Griff Schicht übertragen. Verwenden Sie eine Belichtungszeit, basierend auf Belichtungsenergiewert von 480 mJ / cm 2 für SPR220-4.5 Photolack berechnet. </li><li> Nach der UV-Belichtung, lassen die Scheiben bleiben in einem dunklen Raum 30 Minuten lang vor dem nächsten Verarbeitungsschritt. </li><li> Entwickeln des Photoresists durch Eintauchen des Wafers inein 726 MIF Photoresistentwickler für 2 min unter leichtem Schütteln der Wafer hin und her. </li><li> Spülen Sie die Wafer mit deionisiertem (DI) Wasser und trocknen Sie sie am besten mit einem Spin-rinse Trockner (SRD)-Tool. </li><li> Platzieren der Wafer in einem Ofen bei 90 ° C für 12 Stunden. </li><li> Ätzen der Silizium-Oxid-Schicht auf der Rückseite des Wafers unter Verwendung eines RIE-System mit fluorierten Gasen und ein Rezept für das Ätzen umfaßt. Die strukturierte Oxid auf der Rückseite des Wafers wirkt als eine Ätzmaske für die weitere Verarbeitung. Untersuchen der Wafer unter dem Mikroskop, um zu gewährleisten, daß das Siliziumoxid in der freiliegenden Fenster vollständig geätzt. </li><li> Entfernen des Photoresists auf dem Rand des Wafers (bis zu 5 mm von der Kante) mit einem Reinraum Tupfer in Aceton getaucht. </li><li> Laden Sie die Wafer in einem DRIE Werkzeug mit und führen Sie ein Rezept, um die strukturierte Griffschicht bis zu einer Tiefe von 500 um mit der vergrabenen Oxidschicht, die als Ätzstopp ätzen. Aufgeteilt in mehrere dieses Etch läuft auf eine übermäßige Erwärmung des zu verhindernWafer, die im Widerspruch Ätzen des Silizium bewirkt. Dieser Ätzschritt entfernt das Silizium unter den Auslegern. </li><li> Durchführen einer nassen Ätzschritt unter Verwendung von 25% verdünnte HF-Ätzmittel, um die vergrabene Oxidschicht unterhalb der Ausleger und die schützende Oxidschicht auf der Oberseite der Kragarme abzustreifen. HINWEIS: Dieser Schritt setzt die untere Oberfläche der Siliziumausleger und öffnet ein Fenster unter einen Zugriff auf den Ausleger mit der Lasersonde ist. </li><li> Spülen der Wafer mit einer Reihe von Wasserbädern DI und sorgfältig mit Stickstoff trocken. Da die Ausleger sind nur an ihrer Basis unterstützt, verwenden Sie keine Sprays kraft DI-Wasser oder Inertgas direkt auf den Auslegern. </li><li> Spalten die einzelnen Chips aus dem Wafer entlang der Schicht während der Griff Ätzschritt hergestellt spalten Linien. </li></ol> 2. Zellkultur <ol><li> Bereiten 13F Deckgläser nach bisher veröffentlichten Methoden 17. HINWEIS: Wenn 13F Buchtrslips nicht verfügbar sind, kann jede beliebige hydrophobe Oberfläche mit einem Kontaktwinkel von über 95 ° verwendet werden. </li><li> Sterilisieren Cantilever-Chips und 13F Deckgläschen in einer 70% igen Ethanollösung und an der Luft trocknen in einem Flow-Haube. </li><li> Zeigen einzelnen Cantilever-Chips auf der Oberseite der Deckgläser 13F in einem Standard-12-Well-Platte. </li><li> Mantel die Ausleger mit dem Biopolymer oder Oberflächenmodifikation für die Zelltyp optimiert wird nach den Standard-Zellkulturprotokolle verwendet. </li><li> Resuspendieren der Zellen in ihrer spezifischen Wachstumsmedium auf die gewünschte Konzentration. HINWEIS: Dieses Protokoll wird bei einer erheblichen Anzahl von Zellen fallen durch die Fenster freitragende und nicht zu der gewünschten Auslegeroberfläche anhaftenden führen. Zellpräparate sollten daher 3-4x konzentrierter als für Standard-Deckglas Vorbereitungen getroffen werden. B. Aussäen von Rattenskelettmuskelsatellitenzellen wird typischerweise unter Verwendung einer Aussaatdichte von 500 bis 700 Zellen / mm ² durchgeführt 15,16Und sind mit Cantilever-Substrate bei 2.000 Zellen / mm ² eingesetzt. Optimierungsversuche sollte mit neuen Zellquellen durchgeführt werden, um eine geeignete Aussaatdichte zu ermitteln. </li><li> Je 200 ul der Zellsuspension auf dem Ausleger Chipoberfläche, wodurch die Blase des Mediums deckt die freitragende Fenster ganz. Wenn das Medium transportiert durch das Fenster und keine statische Ball oberhalb der Ausleger bilden ersetzen 13F Deckglas und erneut versuchen, die Beschichtung. </li><li> Übertragen Sie die Platte mit den Chips in einen Inkubator und damit die Zellen für mindestens 1 Stunde (vorzugsweise 2-3 h) entsprechen. </li><li> Nach diesem Zeitraum Beschichtung, sterile Pinzette, um den Chip zu einer sauberen und die Kultur mit 1 ml Wachstumsmedium zu übertragen, ohne Deckglas 13F und nachfüllen. </li><li> Bringen Sie die Platte in den Inkubator. </li><li> Pflegen Zellen nach ihren Standardprotokoll für die In-vitro-Wartung auf Deckgläsern. Für Skelettmuskelzellen,einen Schalter der Mediumzusammensetzung zu Myotuben Bildung zu induzieren, wenn Zellen konfluent erforderlich. </li></ol> 3. Einrichten von Hardware und Software für Cantileverauslenkung Analyse <ol><li> Legen Sie einen beheizten Kulturschale in die Stufe eines aufrechten Elektrophysiologie Mikroskop. </li><li> 3 ml des Nährmediums werden die Zellen noch in (+ 10 mM HEPES) suspendiert, um die erhitzte Mikroskoptisch. </li><li> Halterung aus Edelstahl-Elektroden auf der Innenseite der erhitzten Kulturschale in einem Abstand von 15 mm und sie an einen Impulsgenerator, fähig zur Herstellung von Feldstimulationsimpulse variierender Intensität, Frequenz und Wellenform, damit das System die Feldstimulation zu erzeugen von Zellen, wenn angemessen. </li><li> Schraube eine Helium-Neon-Laser, auf XY Translationsstufen angebracht sind, die an der Unterseite des Mikroskoptisches und so einstellen, daß der Laserstrahl durch die Basis der erhitzten Kulturschale in einem Winkel von 30 ° gerichtet RelativE auf die Ebene des Auslegers. </li><li> Schraube eine Quadranten-Photodetektormodul, auf XY Translations Stufen montiert, die an der Unterseite des Mikroskoptisches und die Position, so dass der reflektierte Laserstrahl landet in der Mitte der 4 Quadranten. Abbildung 2 gibt einen Überblick über die Hardware einrichten die für die Durchführung des beschriebenen Protokolls. </li><li> Schreiben Sie ein Software-Programm, um die Linearantriebe, die über den Auslegern scannen steuern. Schreiben des Software-Programms mit Bezug auf das Flußdiagramm in Figur 3 versehen. Die für die Verwendung mit diesem System programmiert graphische Schnittstelle ist in Figur 4 vorgesehen. </li></ol> 4. Aufnahme Cantileverauslenkung Daten <ol><li> Schalten Sie den Freischwinger-Analyse-Hardware und der zugehörigen Software. </li><li> Legen Sie die beheizten Bühne Thermistor in das Medium und warten, bis es 37 ° C zu lesen. </li><li> Legen Sie die Cantilever-Chip in die Stufe mit der cantilevers in Richtung der rechten Seite der Bühne ausgerichtet. </li><li> Schalten Sie das Mikroskop-Lichtquelle. </li><li> Fokussieren Sie das Mikroskop, um die Kanten der Ausleger in den Blick zu bringen und mit dem Laser / Photodetektor Steuerungssoftware, um den Laserstrahl an der Spitze des Auslegers 1. HINWEIS Position: Unter der Annahme, die Ausleger sind auf der rechten Seite der Bühne, Freischwinger 1 ausgerichtet ist die in der oberen linken Ecke des Arrays positioniert und Zahlen laufen auf 16 in der unteren linken. Cantilever 17 ist in der oberen rechten Position und läuft bis 32 in der unteren rechten (5A). </li><li> Drücken Sie &quot;Play&quot; auf der Recording-Software. </li><li> Positionieren des Fotodetektors, so dass der Signalpegel &quot;0&quot; in sowohl x als auch y-Rahmen, indem die Schrittmotoren Steuerung des Photodetektors. </li><li> Set Freischwinger 1 Position in der Laser / Photodetektor Steuersoftware (Abbildung 4). </li><li> Bewegen Sie den Laser auf die Spitze des Auslegers 16, wiederholen Sie Schritt 4.7., Und legen cantilevER 16 Position in der Laser / Photodetektor Steuerungssoftware. </li><li> Bewegen Sie den Laser auf die Spitze des Auslegers 32, wiederholen Sie Schritt 4.7., Und setzen Ausleger 32 Position in der Laser / Photodetektor Steuerungssoftware. </li><li> Bewegen Sie den Laser auf die Spitze des Auslegers 17, wiederholen Sie Schritt 4.7., Und setzen Ausleger 17 Position in der Laser / Photodetektor Steuerungssoftware. </li><li> Schalten Sie das Mikroskop Lichtquelle und das Deckenlicht im Labor. </li><li> Drücken Sie auf &quot;Record&quot; auf der Recording-Software. </li><li> Stellen Sie den Impulsgenerator Hardware bis 40 ms, 5 V Impulse mit einer Frequenz von 1 Hz, und schalten Sie das Gerät ein. HINWEIS: Optional, beschäftigen optimierte Stimulationsprotokolle für bestimmte Zellquellen an dieser Stelle, die angegebenen Einstellungen sind Leitlinien auf der Basis gesammelter Daten mit Hilfe von Mensch und Nagetier-Zellquellen 12,13,15,16. </li><li> Mit dem Laser / Photodetektor Steuerungssoftware, setzen Sie die Hardware, um über die 32 Freischwinger Array scannen, Anhalten für 5 Sekunden bei jedem aufe. </li><li> Wenn der Scan der 32 Ausleger abgeschlossen ist, schalten Sie den Stimulator, dann stoppen Sie die Aufnahme-Software und bringen Sie die Datendatei. </li><li> Untersuchen Sie die aufgezeichneten Trace von jedem Ausleger zum Nachweis von Kontraktion. Notieren Sie jedes Frei mit positiven Antworten. Einer Kontraktion wird als Peak bezeichnet, wenn die Durchbiegung mindestens 0,1 V über der Basislinie. </li><li> Entfernen Sie alle nicht mehr reagiert Ausleger aus der Scan-Protokoll auf der Laser / Photodetektor Steuerungssoftware. </li><li> Die aktiven Ausleger können dann ohne Stimulation, um eine Lesung der spontanen Kontraktionsaktivität der Zelle erhalten erneut gescannt werden. </li><li> Führen Scans mit oder ohne weites Feld elektrische Stimulation nach Zugabe einer therapeutischen Verbindung zu dem Medium, um ihre Wirkung auf die funktionelle Leistung der kultivierten Zellen zu beobachten. </li><li> Zuführen Müdigkeit Einschätzungen von elektrischen Stimulation der Zellen über einen längeren Zeitraum und Scanebenen contr<html> actility zu messen, wie lange es dauert, Spitzenkraft unter einen bestimmten Schwellenwert fällt. </li><li> In Experimenten, in denen Motorneuronen in Co-Kultur mit Muskel gehalten wird, zu messen neuromuskulären Verbindungsbildung durch Behandlung von Motoneuronen-Myotuben Ausleger Co-Kulturen mit einem neuronalen Stimulans (wie Glutamat) oder synaptische Inhibitor (zB D-Tubocurarin) und Scannen und Zunahmen und Abnahmen der Spontanaktivität bzw. 16. </li><li> Führen bestimmte Abtastungen, wie durch die Anforderungen der geplanten Experimenten bestimmt. </li></ol> 5. Analyse der Daten Cantileverauslenkung <ol><li> Verwendung modifizierter Stoney-Gleichungen 15 (siehe unten), um rohe Cantileverauslenkung Daten (in Volt) in eine Auslesung der Stress in der Zellschicht oder Myotube (in Pascal) und eine direkte Messung der zellulären Kontraktionskraft (in nano-Newton) zu konvertieren: ad / 51866 / 51866eq1.jpg &quot;/&gt; Gleichung 1 <img alt="Gleichung 2" fo:content-width="2in" width="300" src="/files/ftp_upload/51866/51866eq2.jpg" /> Gleichung 2 </li><li> Wobei δ = Auslegerspitzenbiegung und Spannung durch die Myotuben hergestellt, σ c = Spannung, die durch die Myotuben hergestellt, unter der Annahme einer gleichförmigen dicken Film über die gesamte Breite des freitragenden, C = der Detektorsystem-spezifischen Koeffizienten in Bezug Spannung der Laserposition auf dem Foto -Detektor, θ = der Winkel der Laser und der Detektor relativ zu der Ebene des Auslegers, E Si = die Elastizitätsmoduls von Silizium, Si t = die Dicke des Auslegers, t f = Myotuben Dicke, V Si = Verhältnis Giftes Silizium, L = Länge Ausleger, P = Weglänge des Lasers von Cantileverspitze zu Detektor und w <sub&gt; Si = die Breite des Auslegers. Eine schematische Erläuterung, die in diesen Gleichungen verwendeten Begriffe ist in 6 vorgesehen. </li><li> Angenommen, die Myotuben wird ein gleichmäßiger Film ist die Kraft in der Myotuben gleich der Kraft in dem Film, was zu Gleichung 3 durch Gleichsetzen der Berechnung der Kraft von Stress und die angenommene Zellquerschnittsfläche, die für die Anwendung der Stoney verwendet wurde Gleichung. <img alt="Gleichung 3" fo:content-width="1.5in" src="files/ftp_upload/51866/51866eq3.jpg" /> Gleichung 3 </li><li> Folgenden Funktionsdatenerfassung, beheben Cantilever-Chips für immunzytochemische Analyse oder nutzen Zellen für Proteine ​​oder DNA-Analyse unter Verwendung von Standardverfahren. </li><li> Optional liefern die Zellen in den Inkubator statt der Vorbereitung für die molekulare Analyse, um funktionale Leistung zu einem späteren Zeitpunkt, neu zu bewerten. </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+and+morphological+characterization+of+rat+embryonic+motor+neurons+in+a+defined+system.">Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motor neurons in a defined system.</a> Biotechnology progress. 19, 1756-1761 (2003).</li><li>Rumsey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Node+of+Ranvier+formation+on+motor+neurons+in+vitro.">Node of Ranvier formation on motor neurons in vitro.</a> Biomaterials. 30, 3567-3572 (2009).</li><li>Murugan, R., Molnar, P., Rao, K. P., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterial+Surface+patterning+of+self+assembled+monolayers+for+controlling+neuronal+cell+behavior.">Biomaterial Surface patterning of self assembled monolayers for controlling neuronal cell behavior.</a> International journal of biomedical engineering and technology. 2, 104-134 (2009).</li><li>Guo, X., Johe, K., Molnar, P., Davis, H., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+fetal+spinal+cord+stem+cell+line,+NSI-566RSC,+and+its+induction+to+functional+motoneurons.">Characterization of a human fetal spinal cord stem cell line, NSI-566RSC, and its induction to functional motoneurons.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4, 181-193 (2010).</li><li>Varghese, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+target+for+amyloid+beta+toxicity+validated+by+standard+and+high-throughput+electrophysiology.">A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology.</a> PLoS ONE. 5, e8643 (2010).</li><li>Natarajan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+cardiomyocytes+on+microelectrode+arrays+as+a+functional,+high+information+content+drug+screening+platform.">Patterned cardiomyocytes on microelectrode arrays as a functional, high information content drug screening platform.</a> Biomaterials. 32, 4267-4274 (2011).</li><li>Davis, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+Cortical+Oligodendrocyte-Embryonic+Motoneuron+Co-Culture:+An+Axon-Oligodendrocyte+Interaction+Model.">Rat Cortical Oligodendrocyte-Embryonic Motoneuron Co-Culture: An Axon-Oligodendrocyte Interaction Model.</a> Journal of biomaterials and tissue. 2, 206-214 (2012).</li><li>Natarajan, A., DeMarse, T., Molnar, P., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+In+Vitro+Feed-Forward+Networks.">Engineered In Vitro Feed-Forward Networks.</a> J Biotechnol Biomater. 3, 2 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die kritischen Schritte bei der Analyse von Mikrobiegebalken zum Nachweis der zellulären Kontraktion sind die Anordnung der Auslegerchip innerhalb des Mikroskoptisch, und die nachfolgende Ausrichtung des Lasers und Photodetektors mit der Spitze der Ecke Auskragungen in der Anordnung. Wenn dies nicht genau durchgeführt, dann wird die Software nicht in der Lage, die Positionen der übrigen Cantilever in der Anordnung zu extrapolieren, bei der Datensammlung potentiell zu einer Akkumulation von falschen Negativen führen....

The in vitro culture of muscle cells from both human and rodent sources has been possible for decades1,2. However, while standard coverslip preparations are useful for biochemical assessment, they do not facilitate analysis of the cell&#8217;s primary functional output (contractility), and therefore are of somewhat limited value as a means to assess cellular maturation and performance. In order to maximize the amount of data obtainable from such in vitro cultures, it is necessary to advance the development of systems capable of housing such cells in configurations that permit the real-time assessment of their functional performance. The establishment of a multitude of three dimensional muscle models has made some progress toward fulfilling this need, and such systems have been used in a number of publications as a means to assess the contractile capacity of cultured muscle cells in vitro3-5. While such systems are invaluable for tissue modeling and reconstruction studies, they are limited in their applicability for studies of single cell responses. In such cases where single fiber studies are necessary, complex and labor intensive ex vivo methodologies remain the only option6-10. Furthermore, current movement toward the development of complex, multi-organ platforms for drug development and screening protocols requires the establishment of systems which are non-invasive, easily scalable and which integrate readily with supporting cells and tissue models11. 
Microscale cantilevers offer a simple method for assessing the functional contractile capacity of single cells/small populations of cells12,13. The technique is based on modified Atomic Force Microscopy (AFM) technology14, and uses a laser and photo-detector system to measure microscale cantilever deflection in response to cultured myotube contractile activity. Modified Stoney&#8217;s equations are then used to calculate stress in the myotube, and the force exerted by the myotube in order to generate the observed substrate deflection15. A scanning program has been written which enables simultaneous assessment of multiplexed cantilever arrays, offering potential moderate to high through-put applications for drug toxicity/efficacy studies15,16. Such technology may prove invaluable in the development of functional, pre-clinical assays for predicting drug efficacy in vivo. Furthermore, fabrication of cantilever chips in silicon does not impede post analysis processing of cells for standard biomolecular assays such as immunostaining, western blotting and PCR. 
This manuscript provides detailed instructions on the fabrication and preparation of microscale silicon cantilevers, the hardware and software set-up, and the operating guidelines for assessing the functionality of contractile cells cultured on these chips. Standard cell culture techniques can be implemented for plating and maintenance of cells on these surfaces, hence any contractile cell type for which reliable culture parameters exist should be able to integrate with this device with ease. The relatively simple 2D culture parameters utilized in this system makes integration of other cell models or addition of cell types that can interact with muscle (such as innervating neurons) straight-forward, greatly increasing the applicability of this model in the development of more complex functional in vitro assays and multi-organ models of mammalian systems.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="690">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:299px;">Name of material/ equipment</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:108px;">Catalog number</td>
			<td style="width:156px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Primary rat muscle growth medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Neurobasal medium</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">21103-049&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">B27 (50x)</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">17504044</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">1x</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Glutamax (100x)</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">35050061</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">1x</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">G5 supplement</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">17503-012&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">1x</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Glial-Derived Neurotrophic Factor</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Cell sciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">CRG400B</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">20 ng/ ml</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Brain-Derived Neurotrophic Factor</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Cell sciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">CRB600B</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">20 ng/ ml</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Ciliary Neurotrophic Factor</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Cell sciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">CRC400A</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">40 ng/ ml</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Neurotrophin-3</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Cell sciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">CRN500B</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">20 ng/ ml</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Neurotrophin-4</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Cell sciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">CRN501B</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">20 ng/ ml</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Acidic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">13241-013&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">25 ng/ ml</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Vascular Endothelial Growth Factor</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Life Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">P2654</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">20 ng/ ml</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Cardiotrophin-1</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Cell sciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">CRC700B</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">20 ng/ ml</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Heparin Sulphate</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">D9809&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">100 ng/ ml</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">L5158&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">20 ng/ ml</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">Vitronectin</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Sigma</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">V0132</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">100 ng/ ml</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Primary rat muscle differentiation medium</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;">NB Activ 4</td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;">Brain Bits LLC</td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;">NB4-500</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td dir="LTR" height="17" style="height:17px;width:299px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:128px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:108px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Class 2 red diode laser</td>
			<td>Newport</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Photo-detector</td>
			<td>Noah Industries</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Model 2100 Pulse stimulator</td>
			<td>A-M systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Multiclamp 700B Digitizer</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Patch clamp microscope and stage</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Delta T4 culture dish controller</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Axoscope software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">LabVIEW software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">37oC, 5% CO2 incubator</td>
			<td>NAPCO</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Class 2 microbiological flow hood</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pipettes and tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilization of microscale silicon cantilevers to assess cellular contractile function in vitro

Die Entwicklung von mehr vorausschauende und biologisch relevanten in-vitro-Tests liegt auf der Weiterentwicklung der vielseitigen Zellkultursysteme, die die funktionelle Beurteilung der gesetzten Zellen zu erleichtern sagt. Zu diesem Zweck bietet Mikrotechnik Ausleger eine Plattform, mit der die Funktionalität der Kontraktions einer Reihe von Zelltypen, einschließlich Skelett, Herz und Zellen der glatten Muskulatur zu messen, durch die Bewertung der Kontraktion induziert Substrat Biegen. Anwendung der gemultiplexten Auslegerarrays stellt die Mittel zur Entwicklung moderaten bis hohen Durchsatz Protokolle zur Beurteilung der Wirksamkeit von Medikamenten und Toxizität, Krankheits-Phänotyp und Progression sowie neuromuskuläre und andere Zell-Zell-Interaktionen. Diese Handschrift enthält die Details zur Herstellung zuverlässiger Cantilever-Arrays für diesen Zweck, und die erforderlich sind, um erfolgreich Kulturzellen auf diesen Flächen Methoden. Weitere Beschreibung über die notwendigen funktionalen anal führen Sie die Schritte vorgesehenlyse von kontraktilen Zelltypen auf solche Arrays mit einem neuartigen Laser-und Foto-Detektor-System gepflegt. Die repräsentativen Daten zur Verfügung gestellt Highlights die Präzision und reproduzierbare Art der Analyse der Kontraktionsfunktion möglich mit diesem System, sowie die breite Palette von Studien, denen solche Technologie kann angewandt werden. Erfolgreiche weit verbreitete Annahme dieses Systems konnten die Ermittler stellen die Mittel, um eine schnelle, kostengünstige funktionelle Studien in vitro durchzuführen, was zu genaueren Vorhersagen von Gewebe Leistung, die Entwicklung der Krankheit und der Reaktion auf neue therapeutische Behandlung.

Erfolgreiche Kultur von kontraktilen Zellen Ausleger ist ein relativ einfaches Verfahren, unter Verwendung von Standard-Zellkulturtechniken (Abbildung 5). Der Anteil der Ausleger unterstützt Vertrags Zellen variiert je nach Zelltyp untersucht und spezifische Kulturtechnik beschäftigt. Verwendung von primären embryonalen Zellen aus Rattenhinterglieder abgeleitet wurden kontraktile Aktivität auf 12% der untersuchten Ausleger erfaßt wird (n = 4). Analyse der Kontraktionsfähigkeit unter Verwendung der...

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Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Mikro Siliziumcantilevern biegsam Kulturoberflächen zur Messung der Kontraktionskraft der Muskelzellen in vitro. Zellkontraktion bewirkt Cantilever Biege, die gemessen werden können, aufgezeichnet und umgerechnet in die Messwerte von Kraft und bietet eine nicht-invasive und skalierbaren System zur Messung Kontraktionsfunktion in vitro.

Nutzung von Microscale Siliziumcantilevern to Cellular Kontraktionsfähigkeit beurteilen<em&gt; In-vitro-</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

utilization-microscale-silicon-cantilevers-to-assess-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

10.1K Aufrufe.  University of Central Florida.  Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Mikro Siliziumcantilevern biegsam Kulturoberflächen zur Messung der Kontraktionskraft der Muskelzellen in vitro. Zellkontraktion bewirkt Cantilever Biege, die gemessen werden können, aufgezeichnet und umgerechnet in die Messwerte von Kraft und bietet eine nicht-invasive und skalierbaren System zur Messung Kontraktionsfunktion in vitro. 

Serie: Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utilization of Plasmonic and Photonic Crystal Nanostructures for Enhanced Micro- and Nanoparticle Manipulation

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological research. Perhaps the most widely used physical force to achieve noninvasive manipulation of small particles has been dielectrophoresis(DEP).1 However, DEP on its own lacks the versatility and precision that are desired when manipulating cells since it is traditionally done with stationary electrodes. Optical tweezers, which utilize a three dimensional electromagnetic field gradient to exert forces on small particles, achieve this desired versatility and precision.2 However, a major drawback of this approach is the high radiation intensity required to achieve the necessary force to trap a particle which can damage biological samples.3 A solution that allows trapping and sorting with lower optical intensities are optoelectronic tweezers (OET) but OET's have limitations with fine manipulation of small particles; being DEP-based technology also puts constraint on the property of the solution.4,5
This video article will describe two methods that decrease the intensity of the radiation needed for optical manipulation of living cells and also describe a method for orientation control. The first method is plasmonic tweezers which use a random gold nanoparticle (AuNP) array as a substrate for the sample as shown in Figure 1. The AuNP array converts the incident photons into localized surface plasmons (LSP) which consist of resonant dipole moments that radiate and generate a patterned radiation field with a large gradient in the cell solution. Initial work on surface plasmon enhanced trapping by Righini et al and our own modeling have shown the fields generated by the plasmonic substrate reduce the initial intensity required by enhancing the gradient field that traps the particle.6,7,8 The plasmonic approach allows for fine orientation control of ellipsoidal particles and cells with low optical intensities because of more efficient optical energy conversion into mechanical energy and a dipole-dependent radiation field. These fields are shown in figure 2 and the low trapping intensities are detailed in figures 4 and 5. The main problems with plasmonic tweezers are that the LSP's generate a considerable amount of heat and the trapping is only two dimensional. This heat generates convective flows and thermophoresis which can be powerful enough to expel submicron particles from the trap.9,10 The second approach that we will describe is utilizing periodic dielectric nanostructures to scatter incident light very efficiently into diffraction modes, as shown in figure 6.11 Ideally, one would make this structure out of a dielectric material to avoid the same heating problems experienced with the plasmonic tweezers but in our approach an aluminum-coated diffraction grating is used as a one-dimensional periodic dielectric nanostructure. Although it is not a semiconductor, it did not experience significant heating and effectively trapped small particles with low trapping intensities, as shown in figure 7. Alignment of particles with the grating substrate conceptually validates the proposition that a 2-D photonic crystal could allow precise rotation of non-spherical micron sized particles.10 The efficiencies of these optical traps are increased due to the enhanced fields produced by the nanostructures described in this paper.

Plasmonic tweezers and photonic crystal nanostructures are shown to produce useful enhancements in the efficiency and orientation control of optically trapping micro- and nano-particles.

Nutzung von Plasmonic und Photonic Crystal Nanostrukturen für verbesserte Mikro-und Nanopartikel-Manipulation

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological ...

Forschung

Biotechnik

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular machines centers on devices capable of directional motion, i.e. molecular motors, and on their scaled-down mechanical parts (wheels, axels, pendants etc) 7-9. This imitates the macro-machines, even though the physical properties essential for these devices, such as inertia and momentum conservation, are not usable in the nanoworld environments 10. Alternative designs, which do not follow the mechanical macromachines schemes and use mechanisms developed in the evolution of biological molecules, can take advantage of the specific conditions of the nanoworld. Besides, adapting actual biological molecules for the purposes of nano-design reduces potential dangers the nanotechnology products may pose. Here we demonstrate the assembly and application of one such bio-enabled construct, a semi-artificial molecular device which combines a naturally-occurring molecular machine with artificial components. From the enzymology point of view, our construct is a designer fluorescent enzyme-substrate complex put together to perform a specific useful function. This assembly is by definition a molecular machine, as it contains one 12. Yet, its integration with the engineered part - fluorescent dual hairpin - re-directs it to a new task of labeling DNA damage12.
Our construct assembles out of a 32-mer DNA and an enzyme vaccinia topoisomerase I (VACC TOPO). The machine then uses its own material to fabricate two fluorescently labeled detector units (Figure 1). One of the units (green fluorescence) carries VACC TOPO covalently attached to its 3'end and another unit (red fluorescence) is a free hairpin with a terminal 3'OH. The units are short-lived and quickly reassemble back into the original construct, which subsequently recleaves. In the absence of DNA breaks these two units continuously separate and religate in a cyclic manner. In tissue sections with DNA damage, the topoisomerase-carrying detector unit selectively attaches to blunt-ended DNA breaks with 5'OH (DNase II-type breaks)11,12, fluorescently labeling them. The second, enzyme-free hairpin formed after oligonucleotide cleavage, will ligate to a 5'PO4 blunt-ended break (DNase I-type breaks)11,12, if T4 DNA ligase is present in the solution 13,14 . When T4 DNA ligase is added to a tissue section or a solution containing DNA with 5'PO4 blunt-ended breaks, the ligase reacts with 5'PO4 DNA ends, forming semi-stable enzyme-DNA complexes. The blunt ended hairpins will interact with these complexes releasing ligase and covalently linking hairpins to DNA, thus labeling 5'PO4 blunt-ended DNA breaks.
This development exemplifies a new practical approach to the design of molecular machines and provides a useful sensor for detection of apoptosis and DNA damage in fixed cells and tissues.

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

We demonstrate the assembly and application of a molecular-scale device powered by a topoisomerase protein. The construct is a bio-molecular sensor which labels two major types of DNA breaks in tissue sections by attaching two different fluorophores to their ends.

In-vitro-Assembly von Semi-künstliche molekulare Maschine und ihre Verwendung zum Nachweis von DNA-Schäden

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Quantifizierung der globalen diastolischen Funktion durch kinematische Modellierung basierende Analyse der transmitralen Fluss über die diastolische Füllung Parametrisierte Formalismus

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

Analyse von Misch Inhomogenität in einer mikrofluidischen Vorrichtung von Microscale Schlieren Technik

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.

Adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to rapidly consume hexose and pentose mixed sugars in enzyme saccharified undetoxified hydrolyzates and to accumulate over 40 g/L ethanol.

Techniken für die Entwicklung von robusten Pentose-gärenden Hefe für Biokonversion von Lignocellulose zu Ethanol

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme ...

Measuring and Modeling Contractile Drying in Human Stratum Corneum

Stratum corneum (SC) is the most superficial skin layer. Its contact with the external environment means that this tissue layer is subjected to both cleansing agents and daily variations in ambient moisture; both of which can alter the water content of the tissue. Reductions in water content from severe barrier dysfunction or low humidity environments can alter SC stiffness and cause a build-up of drying stresses. In extreme conditions, these factors can cause mechanical rupture of the tissue. We have established a high throughput method of quantifying dynamic changes in the mechanical properties of SC upon drying. This technique can be employed to quantify changes in the drying behavior and mechanical properties of SC with cosmetic cleanser and moisturizer treatments. This is achieved by measuring dynamic variations in spatially resolved in-plane drying displacements of circular tissue samples adhered to an elastomer substrate. In-plane radial displacements acquired during drying are azimuthally averaged and fitted with a profile based on a linear elastic contractility model. Dynamic changes in drying stress and SC elastic modulus can then be extracted from the fitted model profiles.

This article describes a method of quantifying the dynamic drying behavior and mechanical properties of stratum corneum by measuring spatially resolved in-plane drying displacements of circular tissue samples adhered to an elastomer substrate. This technique can be used to measure how different chemical treatments alter drying and tissue mechanical properties.

Messung und Modellierung Kontraktile Trocknung im Bereich Human Stratum corneum

Stratum corneum (SC) is the most superficial skin layer. Its contact with the external environment means that this tissue layer is subjected to both ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Erweiterte 3D-Lebermodelle für In-vitro-Genotoxizitätstests nach langfristiger Nanomaterial-Exposition

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug

Deep vein thrombosis (DVT) is a global health concern. The primary approach to achieve vessel recanalization for critical obstructions is catheter-directed thrombolytics (CDT). To mitigate caustic side effects and the long treatment time associated with CDT, adjuvant and alternative approaches are under development. One such approach is histotripsy, a focused ultrasound therapy to ablate tissue via bubble cloud nucleation. Pre-clinical studies have demonstrated strong synergy between histotripsy and thrombolytics for clot degradation. This report outlines a benchtop method to assess the efficacy of histotripsy-aided thrombolytic therapy, or lysotripsy.
Clots manufactured from fresh human venous blood were introduced into a flow channel whose dimensions and acousto-mechanical properties mimic an iliofemoral vein. The channel was perfused with plasma and the lytic&#160;recombinant tissue-type plasminogen activator. Bubble clouds were generated in the clot with a focused ultrasound source designed for the treatment of femoral venous clots. Motorized positioners were used to translate the source focus along the clot length. At each insonation location, acoustic emissions from the bubble cloud were passively recorded, and beamformed to generate passive cavitation images. Metrics to gauge treatment efficacy included clot mass loss (overall treatment efficacy), and the concentrations of D-dimer (fibrinolysis) and hemoglobin (hemolysis) in the perfusate. There are limitations to this in vitro design, including lack of means to assess in vivo side effects or dynamic changes in flow rate as the clot lyses. Overall, the setup provides an effective method to assess the efficacy of histotripsy-based strategies to treat DVT.

Histotripsy-aided lytic delivery or lysotripsy is under development for the treatment of deep vein thrombosis. An in vitro procedure is presented here to assess the efficacy of this combination therapy. Key protocols for the clot model, image guidance, and assessment of treatment efficacy are discussed.