Diese Arbeit wurde durch ein Public Health Service Grant (HL086513) aus NHLBI zu PEO und ein umfassendes Research Grant aus dem California Institute for Regenerative Medicine (RC1-00104), eine Public Health Service Grant (HL085377) aus NHLBI unterstützt, und ein Geschenk aus dem Pollin Stiftung HSB SC wurde von einem California Institute for Regenerative Medicine Bridges unterstützt, um Cell Research Award (TB1-01194) nach San Francisco State University Stem.

Das Protokoll ist mit der Zustimmung der UCSF Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt. 1. Die Präparation der Maus extensor digitorum longus (EDL) Muscle <ol><li> Führen Sie alle tierischen Verfahren in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts. </li><li> Euthanize Tier mit 200 mg / kg intraperitoneal Pentobarbital / Genickbruch kurz vor Muskel-Ernte 10. Die Dissektion sollte geübt werden, so dass der Muskel geerntet werden kann und montiert in der Spannung Wandler innerhalb von 15 Minuten der Euthanasie. </li><li> Vereinbaren Kadaver in Rückenlage auf Dissektion Tablett und Stift Bein zu Boden. </li><li> Unter Dissektionsmikroskop, offene Haut, vorsichtig öffnen Faszie (Abb. 1a), und schälen tibialis vom Knöchel aufwärts bis EDL (Abb. 1b) aussetzen. Verwenden Tropfen Ringer-Laktat-Lösung, um den Muskel feucht und gepuffert bei der Ernte. </li><li> Entfernen Sie EDL, die Erhaltung soviel Sehne wie möglich an jedem Ende, und in eine Petrischale mit Ringer-Laktat-Lösung. Tie Naht zu jedem der Muskelsehnen (Fig.1C). Es ist wichtig, dass die Muskelfasern nicht berührt oder gestört während der Präparation. </li></ol> 2. Die Montage der Maus EDL im Muscle-Streifen Myographions <ol><li> Für diese Studien ist ein Gewebe Bad benötigt, schützt den Muskel während es beim in physiologischer Lösung bei konstanter Temperatur zu baden mit kontinuierlicher Sauerstoffzufuhr. Das Bad ist mit einem Kraftaufnehmer zur Messung der Muskelspannung gekoppelt. Wir beschäftigen ein integriertes Muskel Streifen Myographions Bad aus dem Dänischen Myo Technology (DMT-Modell 820MS) für diesen Zweck. Darüber hinaus sind ein Rechteckimpuls elektrischen Stimulator (Grass Modell S48) und Datenerfassung Plattform (ADInstruments PowerLab Data Acquisition System und LabChart Software) erforderlich, um zu entlocken, aufzuzeichnen und zu analysieren myo-mechanische Reaktionen bzw.. Die DMT 820MS hat Platin-Elektroden in die Kammer Abdeckung, die auf beiden Seiten des Muskels positioniert sind, in den mittleren Teil des Muskels Streifen integriert. Andere Myogrammgeräte erfordern besondere Aufmerksamkeit auf die Platzierung der Elektroden. </li><li> Füllen Myographions Bad mit 5 ml Krebs Henseleit-Lösung 11. Warm bis 25 ° C. Bubble-O 2 / CO 2 (95% / 5%) über Bad für 15 Minuten vor dem Gebrauch. </li><li> Verwenden Nähte EDL zwischen den Klemmen des Myographions erweitern und sichern die Sehnen der EDL Muskel (Fig.1D, E) zwischen den Klemmen. Achten Sie darauf, den Muskel selbst zu klemmen. </li><li> Pflegen Sie Myographions Bad bei 25 ° C </li></ol> 3. Myo-mechanischen Analyse A. Twitch Spannung <ol><li> Set ursprünglichen Länge in das Bad so, dass es keinen Muskel Laxheit. </li><li> Bestimmen Sie maximale Reiz (Dauer 0,5 ms) durch Anpassung Spannung, um eine maximale Zuckung Spannung zu erhalten, dann Stimulus bei 20% über maximal (bis supramaximale Stimulus zu erreichen) eingestellt. In unseren Studien ist die supramaximale Stimulus in der Regel bei einer Leistung von 40 Volt erreicht. </li><li> Stellen Sie sicher, Ausgabe vom Stimulator mit einem Oszilloskop. </li><li> Bestimmen Sie die optimale Länge durch die schrittweise Dehnung der Muskeln, bis keine weitere Steigerung der twitch Spannung. </li><li> Lassen Muskel für 3 min ins Gleichgewicht. </li><li> Deliver supramaximale Platz Stimulus (0,5 ms) bei optimaler Länge mit Grass S44 elektronische Stimulator und Record-Ausgang. </li><li> Rekord: twitch Spannungskurve (P t gegen die Zeit; Abb.2a). </li></ol> B. Tetanus Spannung <ol><li> Lassen Muskel für 3 Minuten ruhen lassen. </li><li> Tragen Sie einen Zug der supramaximale Impulse für 300msec bei 150 Hz auf optimale Länge mit Grass S44 elektronische Stimulator und Record-Ausgang. </li><li> Rekord: Tetanus-Spannungskurve (P o gegen die Zeit; Abb.2b). </li></ol> C. Force-Frequenz <ol><li> Lassen Muskel für 3 Minuten ruhen lassen. </li><li> Force-Frequenz: apply Züge supramaximale Stimuli bei 30, 60, 100, 140 und 160 Hz mit 3 Minuten Pause zwischen jedem Reiz (Abb. 3). Alternativ können Züge 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 100, 140 und 160 Hz für eine bessere Auflösung bei niedrigeren Frequenzen, wo Kraft wesentlich ändert angewendet werden. </li><li> Plot: Kraft-Frequenz-Beziehung (% der maximalen Kraft vs Stimulationsfrequenz). </li></ol> D. Fatigue <ol><li> Bewerben Zug kurzer tetani: 60 Hz für 300 ms (oder Frequenz angepasst werden, um 50% der maximalen Kraft zu erzeugen), alle 3 Sekunden für 10 Minuten. Mit 10 Minuten sollte die tetanischen Kraft auf ein Plateau von ca. 15% des Ausgangswertes (Abb. 4) abnehmen. </li><li> Plot: niederfrequenten Müdigkeit (% der maximalen Kraft gegen die Zeit). </li></ol> E. Zusätzliche Datenerfassung am Ende des Protokolls <ol><li> Vor Aushängen der Muskel aus dem Myographions, stellen Sie den muscle bei optimaler Länge, wie in Schritt III.A.4 bestimmt und messen deren Durchmesser entweder mit einem Okular am Mikroskop oder mit einem Messschieber. Berechnen Querschnittsfläche (um 2). </li><li> Messen Sie Muskelmasse (mg), indem Sie Fäden und einem Gewicht von Muskeln. </li><li> Wiegen Maus Körpermasse (gm) zu beurteilen. </li></ol> 4. Berechnungen <ol><li> Muscle: Körper-Masse-Verhältnis = Muskelmasse / Körpermasse </li><li> Twitch Spannung, P t (Mn) = maximale Spannung während zucken generiert </li><li> Spezifische zucken Spannung (N / cm 2) = twitch (mN) / Querschnittsfläche (um 2) x 10 5 N / mN • um 2 / cm 2 </li><li> Time to Peak Spannung (ms) = Zeit vom Beginn der Kontraktion um eine maximale Spannung </li><li> Half-Relaxationszeit (ms) = Zeit von der Spitze Spannung auf 50% der maximalen Spannung </li><li> Tetanische Spannung, P O (mn) = maximale Spannung während des Tetanus erzeugt </li><li> Spezifische tetanische Spannung (N / cm 2) = tetanische Spannung (mN) / Querschnittsfläche (um 2) x 10 5 N / mN • um 2 / cm 2 </li><li> Maximale Geschwindigkeit des Anstiegs des Tetanus (N / s) = Höchstsatz für die Erhöhung der Spannung während der die Spannung steigt in Tetanus, dh die maximale Steigung der tetanischen Spannung-Kurve (oder, dP O / dt) </li><li> Half-Entspannung tetanische Spannung (ms) = Zeit vom Aufhören der Stimulation auf 50% der Spannung am Ende der Stimulation </li><li> Twitch Spannung-zu-tetanische Spannungsverhältnis, P t / P O = maximale zucken Zug / maximale tetanische Spannung </li><li> Fatigue index = Verhältnis von Spannung nach zwei Minuten von niederfrequenten Müdigkeit bis zur maximalen isometrischen Spannung </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Dissection von EDL Muskeln. A, Exposure der Hinterlauf muscles.TA, tibialis anterior. B, Exposure von EDL (extensor digitorum longus) Muskeln. C, Befestigung der Nähte zu EDL Sehnen. D, Zugmessdose Bad (Ansicht von der Seite). E, montiert EDL in Bad (Ansicht von oben). Der Muskel in unvollständig in den Puffer zu illustrativen Zwecken eingetaucht, in der Praxis, der Muskel sollte vollständig eingetaucht werden, um ein Austrocknen zu verhindern. <img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Beispiel für Spannungsbögen. A, Beispiel zucken Spannung Kurve, maximal zucken Spannung (P t), Kontraktion der Zeit (CT) und Halb-Relaxationszeit (HRT). Bar, 1 sh. B, Beispiel tetanische Spannung Kurve maximale tetanische Spannung (P o) und Halb-Entspannung tetanische Spannung (HRTT). Bar, 1s. <img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Beispiel für Kraft-Frequenz-Beziehung Analyse. A, die Spannungen durch inkrementelle Stimulation Frequenzen erzeugt. B, Beispiel Impulsfolge bei 30MHz. Bar, 80ms. C, Beispiel für Impulsfolge bei 140MHz. Bar, 80ms. D, Beispiel Kraft-Frequenz-Kurve von Daten in A gezeigt abgeleitet. Die Form der Kraft-Frequenz-Kurve ist charakteristisch für Muskelkraft, und kann zwischen den Muskeln von verschiedenen Tieren verglichen werden. <img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Beispiel für niedrige Frequenz Ermüdungsanalyse. A, Decremental Spannungen über einen Zeitraum von niederfrequenten stimulation.Examples von Impulsfolgen bei angegebenen Zeitpunkten (B, C, D) erzeugt werden unten gezeigt. E, Beispiel für niederfrequente Ermüdungskurve von Daten in A gezeigt abgeleitet. Die Form der niederfrequenten Ermüdungskurve ist charakteristisch für Muskelkraft, und kann zwischen den Muskeln von verschiedenen Tieren verglichen werden.

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	<li>Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+dose+formoterol+administration+improves+muscle+function+in+dystrophic+mdx+mice+without+increasing+fatigue.">Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue.</a> Neuromuscul Disord. 17, 47-55 (2007).</li><li>Messina, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+overexpression+via+adeno-associated+virus+gene+transfer+promotes+skeletal+muscle+regeneration+and+enhances+muscle+function+in+mdx+mice.">VEGF overexpression via adeno-associated virus gene transfer promotes skeletal muscle regeneration and enhances muscle function in mdx mice.</a> FASEB J. 21, 3737-3746 (2007).</li><li>Danieli-Betto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+1-phosphate+protects+mouse+extensor+digitorum+longus+skeletal+muscle+during+fatigue.">Sphingosine 1-phosphate protects mouse extensor digitorum longus skeletal muscle during fatigue.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 288, C1367-C1373 (2005).</li><li>MacIntosh, B. R., Willis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-frequency+relationship+and+potentiation+in+mammalian+skeletal+muscle.">Force-frequency relationship and potentiation in mammalian skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 88, 2088-2096 (2000).</li><li>Hayes, A., Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+clenbuterol-treated+mdx+muscle+are+enhanced+by+low-intensity+swimming.">Contractile properties of clenbuterol-treated mdx muscle are enhanced by low-intensity swimming.</a> J Appl Physiol. 82, 435-439 (1997).</li><li>Coulton, G. R., Curtin, N. A., Morgan, J. E., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mdx+mouse+skeletal+muscle+myopathy:+II.+Contractile+properties.">The mdx mouse skeletal muscle myopathy: II. Contractile properties.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 299-314 (1988).</li><li>Danieli-Betto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+alpha-sarcoglycan+differently+affects+fast-+and+slow-twitch+skeletal+muscles.">Deficiency of alpha-sarcoglycan differently affects fast- and slow-twitch skeletal muscles.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 289, R1328-R1337 (2005).</li><li>Chan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+for+speed:+contractile+properties+of+isolated+whole+EDL+muscle+from+an+alpha-actinin-3+knockout+mouse.">A gene for speed: contractile properties of isolated whole EDL muscle from an alpha-actinin-3 knockout mouse.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295, C897-C904 (2008).</li><li>Personius, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grip+force,+EDL+contractile+properties,+and+voluntary+wheel+running+after+postdevelopmental+myostatin+depletion+in+mice.">Grip force, EDL contractile properties, and voluntary wheel running after postdevelopmental myostatin depletion in mice.</a> J Appl. , (2010).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euthanasia.">Euthanasia.</a> Curr Protoc Immunol. Chap 1, (2006).</li><li>Beekley, M. D., Wetzel, P., Kubis, P., Gros, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+skeletal+muscle+fibre+bundles+from+mice+deficient+in+carbonic+anhydrase+II.">Contractile properties of skeletal muscle fibre bundles from mice deficient in carbonic anhydrase II.</a> Pflugers Arch. 452, 453-463 (2006).</li></ol>

Wir beschreiben eine detaillierte Vorgehensweise bei der Bewertung myo-mechanischen Eigenschaften in explantierten Hinterlauf Muskel von der Maus. Die EDL, während schwieriger, wegen seiner hinteren Position hinter dem M. tibialis anterior zu sezieren, ist leichter zu beurteilen als die tibialis anterior wegen seiner prominenten Sehnenansätze bis zum Knöchel-und Kniegelenke. Diese Sehnen erleichtern in den Muskel Streifen Myographions Montage. Im Gegensatz dazu hat die leichter zugänglich tibialis anterior eine breite, fast atendinous Befestigung am Kniegelenk, so dass es außerordentlich schwierig, beide ohne die Muskeln zu zerlegen und montieren sicher in der Myographions. Wir weisen auch darauf hin, dass schnell die Montage der Muskel in ein mit Sauerstoff angereichertes Bad in einem physiologischen Puffer und Temperatur ist von wesentlicher Bedeutung für die Erhaltung der Muskulatur der mechanischen Eigenschaften. Wir haben festgestellt, dass wir diese Analyse für bis zu 30 Minuten wiederholen, ohne signifikante Veränderungen im Muskel Reaktion unter diesen Bedingungen. Schließlich ist es wichtig, dass die Muskelfasern nicht während der Präparation und Befestigung Verfahren berührt werden, da dies negative Auswirkungen auf die Muskelfunktion haben kann, und das Ergebnis in Unterschätzung der myo-mechanische Kraft. Durch die folgenden Verfahren, bietet diese Analyse ein robustes quantitative Ansatz zur Bewertung der Auswirkungen der genetischen Veränderung auf die Muskelfunktion 6,7,8,9, sowie Vergleich zwischen therapeutischen Interventionen in Mausmodellen von Muskelerkrankungen 1,2,3,5 .

Lösungen und Medien Ringer-Laktat-Lösung <ul><li> 100 mM NaCl </li><li> 30 mM CH3CH (OH) COONa (Natriumlactat) </li><li> 4 mM KCl </li><li> 1 mM CaCl 2 · 2H 2 O (Calciumchlorid Dihydrat) <ul><li> pH-Wert einstellen auf 6,75 </li></ul></li></ul> Krebs Henseleit-Lösung <ul><li> 118 mm NaCl </li><li> 4,7 mM KCl </li><li> 1,25 mM CaCl 2 </li><li> 1,2 mM MgCl 2 </li><li> 1,2 mM KH 2 PO 4 </li><li> 25 mM NaHCO 3 </li><li> 11 mM Glukose <ul><li> pH-Wert auf 7,2-7,4 durch Äquilibrieren mit O 2 / CO 2 (95% / 5%) Gas </li></ul></li></ul> Pentobarbital <ul><li> 5 mg / mL funktionierende Lösung in sterilem Wasser </li></ul>

myo-mechanical analysis of isolated skeletal muscle

Zur Beurteilung der in vivo-Effekte von therapeutischen Interventionen für die Behandlung von Muskelerkrankungen 1,2,3, sind quantitative Methoden notwendig diese Maßnahme Krafterzeugung und Ermüdbarkeit bei behandelten Muskeln. Wir beschreiben eine detaillierte Vorgehensweise bei der Bewertung myo-mechanischen Eigenschaften in frisch explantierten Hinterlauf Muskel von der Maus. Wir beschreiben die atraumatische Ernte der Maus extensor digitorum longus, der Montage der Muskel in einem Muskel Streifen Myographions (Model 820MS; Danish Myo Technology) und die Messung der maximalen zucken und tetanischen Spannung, Kontraktion der Zeit, und Halb-Relaxationszeit, mit einem Rechteckimpuls Stimulator (Modell S48; Grass Technologies). Mit diesen Messungen zeigen wir die Berechnung der spezifischen zucken und tetanischen Spannung normiert auf Muskel-Querschnittsfläche, die twitch-to-tetanische Spannungsverhältnis, 4 die Kraft-Frequenz-Beziehung-Kurve und der niedrigen Frequenz Ermüdungskurve. Diese Analyse stellt eine Methode zur quantitativen Vergleich zwischen therapeutischen Interventionen in Mausmodellen von Muskelerkrankungen 1,2,3,5, sowie Vergleich der Auswirkungen der genetischen Veränderung auf die Muskelfunktion 6,7,8,9.

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Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

Zur Beurteilung der<em&gt; In vivo</em&gt; Effekte von therapeutischen Interventionen für Muskelerkrankungen, sind Methoden notwendig, um Krafterzeugung und Ermüdbarkeit bei behandelten Muskeln zu quantifizieren. Wir Detail einen Ansatz zur Bewertung von myo-mechanischen Eigenschaften in explantierten Maus Hinterlauf Muskel. Diese Analyse liefert ein robustes Konzept für die Quantifizierung der Auswirkungen der genetischen Veränderung auf die Muskelfunktion, sowie Vergleich der Therapien in Mausmodellen der Muskelerkrankung.

Myo-mechanischen Analyse von isolierten Skelettmuskel

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

myo-mechanical-analysis-of-isolated-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Medicine

26.7K Aufrufe.  University of California San Francisco. Zur Beurteilung der In vivo Effekte von therapeutischen Interventionen für Muskelerkrankungen, sind Methoden notwendig, um Krafterzeugung und Ermüdbarkeit bei behandelten Muskeln zu quantifizieren. Wir Detail einen Ansatz zur Bewertung von myo-mechanischen Eigenschaften in explantierten Maus Hinterlauf Muskel. Diese Analyse liefert ein robustes Konzept für die Quantifizierung der Auswirkungen der genetischen Veränderung auf die Muskelfunktion, sowie Ver...

Serie: Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably adaptable to environmental factors1 such as hypertrophy by resistance exercise and atrophy by disuse. It thereby exhibits remodeling and adaptations to stressors (heat, ischemia, heavy metals, etc.)2,3. Damage can occur to muscle by a muscle exerting force while lengthening, the so-called eccentric contraction4. The contractile proteins can be damaged in such exertions and need to be repaired, degraded and/or resynthesized; these functions are not part of the contractile proteins, but of other much less abundant proteins in the cell. To determine what subset of proteins is involved in the amelioration of this type of damage, a global proteome must be established prior to exercise5 and then followed subsequent to the exercise to determine the differential protein expression and thereby highlight candidate proteins in the adaptations to damage and its repair. Furthermore, most studies of skeletal muscle have been conducted on the male of the species and hence may not be representative of female muscle. 
In this article we present a method for extracting proteins reproducibly from male and female muscles, and separating them by two-dimensional gel electrophoresis followed by high resolution digital imaging6. This provides a protocol for spots (and subsequently identified proteins) that show a statistically significant (p &lt; 0.05) two-fold increase or decrease, appear or disappear from the control state. These are then excised, digested with trypsin and separated by high-pressure liquid chromatography coupled to a mass spectrometer (LC/MS) for protein identification (LC/MS/MS)5. This methodology (Figure 1) can be used on many tissues with little to no modification (liver, brain, heart etc.).

A straight-forward set of methods to isolate and determine the identity of the most abundant proteins expressed in skeletal muscle. About 800 spots are discerned on a two-dimensional gel from 10 mg muscle; this allows for the determination of gender-specific protein expression. These methods will give equivalent results in most tissues.

Skeletal Muscle Gender Dimorphismus von Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably ...

Forschung

Medizin

Tibial Nerve Transection - A Standardized Model for Denervation-induced Skeletal Muscle Atrophy in Mice

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. Although originally developed and used extensively in the rat due to its larger size, the tibial nerve in mice is big enough that it can be easily manipulated with either crush or transection, leaving the peroneal and sural nerve branches of the sciatic nerve intact and thereby preserving their target muscles. Thus, this model offers the advantages of inducing less morbidity and impediment of ambulation than the sciatic nerve transection model and also allows investigators to study the physiologic, cellular and molecular biologic mechanisms regulating the process of muscle atrophy in genetically engineered mice. The tibial nerve supplies the gastrocnemius, soleus and plantaris muscles, so its transection permits the study of denervated skeletal muscle composed of fast twitch type II fibers and/or slow twitch type I fibers. Here we demonstrate the tibial nerve transection model in the C57Black6 mouse. We assess the atrophy of the gastrocnemius muscle, as a representative muscle, at 1, 2, and 4 weeks post-denervation by measuring muscle weights and fiber type specific cross-sectional area on paraffin-embedded histologic sections immunostained for fast twitch myosin.

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of skeletal muscle atrophy. The model surgical protocol is described and demonstrated in C57Black6 mice. &#160;

Tibialisnerv Durchtrennung - ein standardisiertes Modell für Denervation-induzierte Skelettmuskelatrophie in Mice

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly effective. This video describes the percutaneous biopsy technique using a modified Bergstr&#246;m needle to obtain skeletal muscle tissue samples from the vastus lateralis of human subjects. The Bergstr&#246;m needle consists of an outer cannula with a small opening (&#8216;window&#8217;) at the side of the tip and an inner trocar with a cutting blade at the distal end. Under local anesthesia and aseptic conditions, the needle is advanced into the skeletal muscle through an incision in the skin, subcutaneous tissue, and fascia. Next, suction is applied to the inner trocar, the outer trocar is pulled back, skeletal muscle tissue is drawn into the window of the outer cannula by the suction, and the inner trocar is rapidly closed, thus cutting or clipping the skeletal muscle tissue sample. The needle is rotated 90&#176;&#160;and another cut is made. This process may be repeated three more times. This multiple cutting technique typically produces a sample of 100-200 mg or more in healthy subjects and can be done immediately before, during, and after a bout of exercise or other intervention. Following post-biopsy dressing of the incision site, subjects typically resume their activities of daily living right away and can fully participate in vigorous physical activity within 48-72 hr. Subjects should avoid heavy resistance exercise for 48 hr to reduce the risk of herniation of the muscle through the incision in the fascia.

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&amp;#246;m Technique

The purpose of this video is to present the modified Bergstr&#246;m skeletal muscle biopsy technique on human subjects.

Menschlichen Skelettmuskelbiopsie Verfahren unter Verwendung der modifizierten Technik Bergström

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Quantitative Magnetic Resonance Imaging of Skeletal Muscle Disease

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of living systems. Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using qMRI methods. The MRI acquisition protocol begins with localizer images (used to locate the position of the body and tissue of interest within the MRI system), quality control measurements of relevant magnetic field distributions, and structural imaging for general anatomical characterization. The qMRI portion of the protocol includes measurements of the longitudinal and transverse relaxation time constants (T1 and T2, respectively). Also acquired are diffusion-tensor MRI data, in which water diffusivity is measured and used to infer pathological processes such as edema. Quantitative magnetization transfer imaging is used to characterize the relative tissue content of macromolecular and free water protons. Lastly, fat-water MRI methods are used to characterize fibro-adipose tissue replacement of muscle. In addition to describing the data acquisition and analysis procedures, this paper also discusses the potential problems associated with these methods, the analysis and interpretation of the data, MRI safety, and strategies for artifact reduction and protocol optimization.

Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using non-invasive magnetic resonance imaging methods.

Quantitative Magnetresonanztomographie von Skelettmuskelerkrankung

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and well tolerated technique. The Weil-Blakesley conchotome has a sharp biting tip with a 4 - 6 mm wide hollow. It is inserted through a 5 - 10 mm skin incision and can be maneuvered for controlled tissue penetration. The tip is opened and closed within the tissue and then rotated through 90 -180&#176; to cut the muscle. The amount of muscle obtained following repeated sampling can vary from 20 mg to 290 mg which can be processed for both histology and molecular studies. The wound needs to be kept dry and vigorous physical activity kept to a minimum for approximately 72 hr although normal levels of activity can restart immediately following the procedure. This procedure is safe and effective when close attention is paid to the selection of subjects, full asepsis and post procedure care. &#160;Both right and left vastus lateralis are suitable for biopsy dependent on participant preference.

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

This video demonstrates the technique of percutaneous muscle biopsy of the human vastus lateralis using the Weil-Blakesley conchotome.

Mensch<em&gt; Vastus lateralis</em&gt; Skeletal Muscle Biopsy die Weil-Blakesley Conchotom Verwendung

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

Induction and Assessment of Exertional Skeletal Muscle Damage in Humans

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery in humans. Herein we discuss the design of an eccentric exercise protocol to induce damage in the quadriceps muscles, marked by changes in strength, soreness, and plasma creatine kinase levels. This method is simple, ethical, and widely applicable since it is performed in human participants and eliminates the interspecies translation of the results. Subjects perform 300 maximal eccentric contractions of the knee extensor muscles at a speed of 120&#176;/sec on an isokinetic dynamometer. The extent of the damage is measurable using relatively non-invasive isokinetic and isometric measures of strength loss, soreness, and plasma creatine kinase levels over several days following the exercise. Therefore, its application can be directed to specific populations in an attempt to identify mechanisms for muscle adaptation and regeneration.

This article describes a safe and reliable method to induce and quantify exertional skeletal muscle damage in human subjects.

Induktion und Beurteilung der belastungsSkelettMuskelSchäden beim Menschen

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery ...

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of myosin heavy chain (MyHC) isoforms has emerged as a finer discriminator of fiber-type. Type I, type IIA, type IIX and type IIB fibers can now be identified with precision based on their MyHC profile; however, manual analysis of these data can be slow and down-right tedious. In this regard, rapid, accurate assessment of fiber-type composition and morphology is a very desirable tool. Here, we present a protocol for state-of-the-art immunohistochemical staining of MyHCs in frozen sections obtained from mouse hindlimb muscle in concert with a novel semi-automated algorithm that accelerates analysis of fiber-type and fiber morphology. As expected, the soleus muscle displayed staining for type I and type IIA fibers, but not for type IIX or type IIB fibers. On the other hand, the tibialis anterior muscle was composed predominantly of type IIX and type IIB fibers, a small fraction of type IIA fibers and little or no type I fibers. Several image transformations were used to generate probability maps for the purpose of measuring different aspects of fiber morphology (i.e., cross-sectional area (CSA), maximal and minimal Feret diameter). The values obtained for these parameters were then compared with manually-obtained values. No significant differences were observed between either mode of analysis with regards to CSA, maximal or minimal Feret diameter (all p &#62; 0.05), indicating the accuracy of our method. Thus, our immunostaining analysis protocol may be applied to the investigation of effects on muscle composition in many models of aging and myopathy.

Immunohistochemical staining of myosin heavy chain isoforms has emerged as the state-of-the-art discriminator of skeletal muscle fiber-type (i.e., type I, type IIA, type IIX, type IIB). Here, we present a staining protocol along with a novel semi-automated algorithm that facilitates rapid assessment of fiber-type and fiber morphology.

Semi-automatische Analyse von Maus Skelettmuskulatur Morphologie und Fasertyp Zusammensetzung

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

Skeletal Muscle Neurovascular Coupling, Oxidative Capacity, and Microvascular Function with 'One Stop Shop' Near-infrared Spectroscopy

Exercise represents a major hemodynamic stress that demands a highly coordinated neurovascular response in order to match oxygen delivery to metabolic demand. Reactive hyperemia (in response to a brief period of tissue ischemia) is an independent predictor of cardiovascular events and provides important insight into vascular health and vasodilatory capacity. Skeletal muscle oxidative capacity is equally important in health and disease, as it determines the energy supply for myocellular processes. Here, we describe a simple, non-invasive approach using near-infrared spectroscopy to assess each of these major clinical endpoints (reactive hyperemia, neurovascular coupling, and muscle oxidative capacity) during a single clinic or laboratory visit. Unlike Doppler ultrasound, magnetic resonance images/spectroscopy, or invasive catheter-based flow measurements or muscle biopsies, our approach is less operator-dependent, low-cost, and completely non-invasive. Representative data from our lab taken together with summary data from previously published literature illustrate the utility of each of these end-points. Once this technique is mastered, application to clinical populations will provide important mechanistic insight into exercise intolerance and cardiovascular dysfunction.

Skeletal Muscle Neurovascular Coupling, Oxidative Capacity, and Microvascular Function with &#039;One Stop Shop&#039; Near-infrared Spectroscopy

Here, we describe a simple, non-invasive approach using near-infrared spectroscopy to assess reactive hyperemia, neurovascular coupling and skeletal muscle oxidative capacity in a single clinic or laboratory visit.

Skelettmuskulatur neurovaskuläre Kopplung, Oxidative Kapazität und mikrovaskuläre Funktion mit "One Stop Shop" Nah-Infrarot-Spektroskopie

Exercise represents a major hemodynamic stress that demands a highly coordinated neurovascular response in order to match oxygen delivery to metabolic ...

Obtaining Quality Extended Field-of-View Ultrasound Images of Skeletal Muscle to Measure Muscle Fascicle Length

Muscle fascicle length, which is commonly measured in vivo using traditional ultrasound, is an important parameter defining a muscle&#8217;s force generating capacity. However, over 90% of all upper limb muscles and 85% of all lower limb muscles have optimal fascicle lengths longer than the field-of-view of common traditional ultrasound (T-US) probes. A newer, less frequently adopted method called extended field-of-view ultrasound (EFOV-US) can enable direct measurement of fascicles longer than the field-of-view of a single T-US image. This method, which automatically fits together a sequence of T-US images from a dynamic scan, has been demonstrated to be valid and reliable for obtaining muscle fascicle lengths in vivo. Despite the numerous skeletal muscles with long fascicles and the validity of the EFOV-US method for making measurements of such fascicles, few published studies have utilized this method. In this study, we demonstrate both how to implement the EFOV-US method to obtain high quality musculoskeletal images and how to quantify fascicle lengths from those images. We expect that this demonstration will encourage the use of the EFOV-US method to increase the pool of muscles, both in healthy and impaired populations, for which we have in vivo muscle fascicle length data.

This study describes how to obtain high quality musculoskeletal images using the extended field-of-view ultrasound (EFOV-US) method for the purpose of making muscle fascicle length measures. We apply this method to muscles with fascicles that extend past the field-of-view of common traditional ultrasound (T-US) probes.