Forschung durch die Natural Science and Engineering Research Council of Canada unterstützt.

Ein. Einführung <ol><li> Die MacIntosh-Labor wurde mit der medialen Gastrocnemius Muskel-Präparat für mehrere Jahre, und davor die ganze gastrocnemius Muskel-Präparat, wie bei Dr. Phil Gardiner entwickelt. 1 </li></ol> 2. Anästhesie <ol><li> Erwachsenen Sprague-Dawley Ratten (200-300 g) werden üblicherweise in unserem Labor für das Studium der kontraktilen Eigenschaften in situ verwendet. Die Ratte in einem Plexiglas-Geräte eingeschränkt werden, im Handel erhältlich, oder durch Abdecken mit einem Handtuch, und halten. </li><li> Wir verwenden Ketamin / Xylazin, (100 mg · ml -1, jeweils) in 85:15 gemischt und Verwalten 0,1 ml pro 100 g Ratten intramuskulär 2,3 Gewichtsprozent. Natriumpentobarbital (50-60 mg · kg -1, intraperiteneal) oder Isofluran (2-3,5%, inhalativen) kann auch 4 verwendet werden. </li><li> Während der Narkose wird mit Wirkung kann eine genaue Gewicht erhalten werden und die linke Hinterpfote Gliedmaßen rasiert. Dies ist auch ein guter time sicher sein, alle Elektronik eingeschaltet und bereit. Dazu zählen auch Rechner, DMS-Messverstärker, Ölheizung und andere. </li><li> Überprüfen Sie für die Rückkehr der Reflex in regelmäßigen Abständen und ergänzen die Narkose nach Bedarf (0,05 bis 0,1 ml pro 100 g). </li></ol> 3. Initiieren Chirurgie <ol><li> Wir verwenden eine Plexiglas-Plattform, auf der die Ratte für eine Operation zu immobilisieren. Einfache Klebeband macht den Job. Achten Sie darauf, das Tier von links Hinterlauf wird nach rechts Vorderbein gestreckt. Fügen Sie einen Tropfen Schmiermittel auf die Augen. Wir verwenden Paraffinöl. Andernfalls werden die Augen austrocknen mit Ketamin-Anästhesie. </li><li> Eine kleine OP-Leuchte ist nützlich. Dieser gibt genug Wärme, um zu helfen das Tier warm. Alternativ kann ein wasserlösliches Wärmedecke verwendet werden. Vergewissern Sie sich, Hornhaut oder Zehen-Pinch-Reflexe fehlen bevor Sie fortfahren. Steriler Technik ist nicht notwendig, da dieses Verfahren akut. Das Tier wird nicht aus der Narkose erholen. Wir einschläfern die Ratte mit BetäubungÜberdosierung (0,2 ml, intrakardialen), wenn alle Prozeduren beendet sind. </li><li> Der erste Einschnitt durch die Haut von der Ferse zur Wirbelsäule. Wir verwenden Schere, da die Tiefe des Schnitts gesteuert werden kann und die Schere verwendet, um die Haut vor den darunter liegenden Geweben zu trennen. Ratten haben exzellente Hämostase, so lange, wie Sie große Blutgefäße zu vermeiden, Blutungen begrenzt. Die offenen Flächen mit isotonischer Kochsalzlösung getränkten Gaze abgedeckt, wann immer möglich. </li><li> Nachdem die Haut von der darunterliegenden Bindegewebes getrennt wird, wird die oberflächliche Muskelschicht geschnitten. Achten Sie darauf, nicht zu gehen zu tief, man will nicht den Ischiasnerv oder Blutgefäßen oder den Muskel von Interesse beschädigen. Beginnen Sie über den Musculus gastrocnemius und schneiden proximal entlang der gleichen Linie wie die Hautschnitt. Peek unter zu finden und zu vermeiden den Ischiasnerv. Sobald Sie sehen, die Nerven haben, können Sie den Weg mit Ihrem Einschnitt folgen, sondern bleiben deutlich über dem Nerv. Es gibt eine klare Naht zwischen muszeuge. Dieses, und entlang dieser Naht in Richtung des Knies. Achten Sie auf und vermeiden Blutgefäße. </li></ol> 4. Bereiten Pilotbohrung in Femur für Knochen pin <ol><li> Durchtrennung der dünnen Schicht des Muskels über die Schwanzvene des Femurs, Aussetzen der blanken Knochen. Verwendung eines handgehaltenen Drehwerkzeug, bohren oder Schiebezange, (0,9 mm Kohlenstoffstahl bur), stellen eine kleine Vorbohrung durch die Rinde, und gerade in die Medulla. Nicht zu tief zu bohren, oder übermäßigen Blutungen führen wird. Dieses Loch wird später verwendet werden, um einen Knochen Pin platzieren, um die Oberschenkel auf dem myograph Basis immobilisieren. </li></ol> 5. Isolieren Innervation des medialen M. gastrocnemius <ol><li> Der nächste Schritt erfordert ein Binokular. Suchen Sie die Stelle, wo der Kniekehle Nerven verschwindet hinter der medialen M. gastrocnemius. Vorsichtig aus die verschiedenen Zweige verteilt, und schneiden Sie alles, was nicht innervieren nicht die mediale Gastrocnemius Muskel. Innervation durch Mikrostimulation bestimmt werden. Auf this der Bühne, auch sicherstellen, dass die oberflächlichen Filialen der Ischiasnerv geschnitten werden. </li><li> Jetzt klar das Bindegewebe vom Ischiasnerv, so kann es in den Nerven Manschette (später) aufgeschoben werden. Achten Sie darauf, um den Nerv zu schonen. Jede Strecke des Nerven kann zu Unerregbarkeit führen und beenden das Experiment vorzeitig. </li></ol> 6. Isolieren Sie die Achillessehne und Gastrocnemius <ol><li> Stumpf mit gelegentlichen Hilfe von Schere, kann die Gastrocnemius-Muskel von anderen Geweben zu trennen. Die Sehne des M. plantaris kann unter der Achillessehne gezogen werden, gebunden und geschnitten. Die Krawatte wird lediglich verwendet, um beim Festhalten der Sehne und kann weggeschnitten werden direkt nach der Sehne geschnitten wird und der ausgewählt ist aus der plantaris gastrocnemius eine wesentliche Länge abgetrennt. Legen Sie eine Nr. 1 Seidenligatur um die Achillessehne und Krawatte in einem quadratischen Knoten. Nicht zu straff zu ziehen, oder die Sehne beschädigt wird. Wir verwenden Knochen rongeurs die calcan geschnitten<html> eus, so dass ein kleines Stück Knochen noch an der Achillessehne befestigt. Halten Sie die Schnittflächen horizontal zu sein, dass die Knochen geschnitten wird, nicht nur die Sehne. Dies gewährleistet die Achillessehne der myograph kann angebracht später. </li><li> Entlang der Unterseite des Gastrocnemius können die Soleus gesehen werden. Auch hier kann stumpf verwendet, um den M. soleus von der M. gastrocnemius zu trennen. Wir wollen die mediale Gastrocnemius isolieren, so ist es der einzige Muskel noch an der Achillessehne befestigt. Schneiden Sie die soleus Sehne, in der Nähe des distalen Ende. Dann können Sie trennen die medialen und lateralen Gastrocnemius Muskeln, und schneiden Sie die seitlichen Sehne, so dass nur die mediale Gastrocnemius an der Achillessehne. Ziehen des Musculus gastrocnemius laterale auswärts von der medialen zusammen etwa 50% seiner Länge. Jenseits dieser Länge schneiden sich die Fasern und Schäden werden von weiterem Ziehen führen. Überprüfen Sie, ob der Muskel ist frei von Bindegewebe. </li></ol>e &quot;&gt; 7. Schneiden Sie die Tibia <ol><li> Legen Sie eine Ligatur um den Schaft, knapp oberhalb der Mitte. Dies muss dicht sein, ohne Eingriff in das Gewebe. Eine zweite Schleife vor dem Heften verhindert ein Verrutschen. Wieder mit einem quadratischen Knoten zu sichern. </li><li> Mit einer kleinen Säge, schneiden Sie die Unterschenkel entfernt. Dieser Schnitt sollte etwa in der Mitte des Schienbeins sein. </li><li> Legen Sie eine scharfe Sonde in der Medulla der Tibia. Diese Sonde wird verwendet, um die Tibia auf der Basis myograph immobilisieren. </li><li> Befestigen 2 Elastiken auf die Haut, mit Michel Clips. Diese und weitere Gummizüge wird verwendet, um die Haut zu halten rund um die Muskel einen Behälter, der mit warmen Paraffinöl gefüllt werden bilden. </li></ol> [OPTIONAL] 8. Legen sonometric Kristalle (optionaler Schritt) 5 <ol><li> Legen Sie das Tier auf einem Heizkissen bei niedrigen Einstellung. Eine Rektalsonde können falls nicht bereits zu diesem Zeitpunkt eingefügten eingefügt werden. Verwenden Sie einen kleinen Tropfen Paraffinöl zu schmieren. </li><li>Verwendung Mikrostimulation, identifizieren die Enden eines fascicle innerhalb des Muskels. Poke eine 21-Gauge-Nadel in die Website sowohl der Ursprung und Ansatz des Muskels. </li><li> Schieben Sie eine sonometric Kristall in das Loch mit der Nadel und Dichtung mit vet-Bindung chirurgische Kleber hergestellt. Verwenden Sie einen sehr kleinen Tropfen Kleber; darauf achten, dass es richtig ist, über den Kristall platziert. Auftragen des Klebstoffs auf einem Stück Papier Schnitt mit einem spitzen Winkel hilft bei der Verklebung genau. Wir setzen ein zusätzliches Einkristall in der Insertion des fascicle welche durch Mikrostimulation identifiziert wurde. </li></ol> [WEITER] 9. Montieren Sie in der Vorrichtung (siehe Abbildung 1) <ol><li> Positionieren Sie die Ratte auf dem myograph Basis, mit dem Tibia-Sonde orientiert Hebel. Legen Sie die Sonde in die Halterung, um das Bein zu immobilisieren. </li><li> Ziehen Sie die Haut an den Seiten, um einen Behälter zu bilden und befestigen Sie sie mit Gummibändern. </li><li> Set Bohrkrone (1/16 inch th) in den Femur, mit dem PilotLoch, das während der OP-Vorbereitung erstellt wurde. Stellen Sie sicher, dass Sie die Oberschenkel auf dem vorderen Teil unterstützt, wie Sie den Bohrer (in einem Stift vice) als Bruch des Oberschenkelknochens platzieren führen kann, endet das Experiment vorzeitig. Bringen Sie den Pin vice zu einem Cross-bar, um die Oberschenkel zu immobilisieren. </li><li> Setzen Sie den distalen Stumpf der Ischiasnerv durch den Nerven stimulierend Manschette (Kathode in Richtung Muskel) und tuck wieder nahe am Ursprung des Muskels. Verbinden Sie den Stimulator auf diese Drähte. </li><li> Bringen Sie die Achillessehne auf den Hebel, die DMS-Sensoren drauf hat. Tie snuggly, aber lassen Sie etwas Platz für eine spätere Einstellung. Sicherstellen, daß die Ausrichtung des Muskels ist senkrecht mit dem Hebel. </li><li> Füllen Sie den Behälter von der Haut mit warmen Paraffinöl gebildet. </li><li> Schalten Sie die Wärmelampe und Position Schilde Alufolie über den Kopf des Tieres gemacht und den Kraftaufnehmer. Zusätzliche Folienabschirmungen kann notwendig sein, um sicherzustellen, die Kerntemperatur des Tieres nicht EXCEed 38 ° C. Die Länge des Muskels kann eingestellt werden, bis Durchhang des Strangs von der Verbindung zwischen den medialen gastrocnemius und den Kraftaufnehmer entfernt wird. </li></ol> 10. Stellen Sie maximale Spannung und Bezugslänge <ol><li> Während der Muskel wird aufgewärmt, richten Sie den Stimulator und testen Sie die Stimulation Spannung. Es ist wichtig zu sein, dass die Stimulation in sehr kurzen Impulsdauer gesetzt wird. Wir verwenden 50 ms. Maximale Spannung sollte weniger als 1 V. Ab 0,5 V, erhöhen Spannung bis twitch Amplitude nicht erhöht. Maximal Spannung ist die niedrigste Spannung, die alle motorischen Einheiten aktiviert. Wir in der Regel auf das Doppelte der maximalen Spannung zu stimulieren, oder 3 V je nachdem, was höher ist. </li><li> Typischerweise werden Experimente mit dem Muskel an der Länge, die den größten twitch Kontraktion gibt beginnen. Ein Zucken ist mit einem einzelnen Stimulationsimpuls erhalten. Der Muskel Länge durch ca. 1 mm für einen anderen twitch erhöht. Dies wird solange wiederholt Amplitude twitchsteigt. Sobald twitch Amplitude abnimmt, wird die Länge zu dem, der die größte Amplitude hat twitch zurückzusenden. </li><li> Nach dieser anfänglichen Einstellung der Länge, testen wir das System mit dem, was wir als eine &quot;Konditionierung tetanische Kontraktion&quot;. Der Stimulator wird, um Impulse bei 200 Hz liefern für 500 ms. Lieferung dieses Stimulation wird in einem völlig verschmolzen tetanische Kontraktion führen. Die Kraft, die durch den Muskel erzeugt wird anziehen alle Verbindungen, einschließlich der Knoten auf den Muskel. Nach einer geeigneten Rest für Dissipation Potenzierung 4 ist die Referenzlänge des Muskels zurückgesetzt (siehe Teil 9.2). Normalerweise wird die Klimaanlage tetanische Kontraktion wird einige fascicle Länge Verkürzung erlaubt haben, so der Muskel wird gedehnt ein wenig, um wieder auf die Länge, die den größten Amplitude twitch Kontraktion gibt werden. </li></ol> 11. Initiieren Sie das Experiment <ol><li> Ein typisches Experiment gehören Länge Abgleichent-und / oder Stimulation mit einer Vielzahl von Mustern von Stimulation. Die Datenerhebung kann es sich nur Kraft oder Kraft, mit der Länge, Faszikel Länge und Elektromyogramm. </li></ol> [OPTIONAL] 12. Force-Frequenz-Verhältnis 2 <ol><li> Stellen Sie den Zug Dauer lang genug, um ein Plateau von Gewalt bei einer beliebigen Frequenz von Interesse zu erreichen. Die maximale isometrische Kraft in der medialen gastrocnemius bei 200 Hz erreicht. Zug Dauer muss mindestens 200 ms betragen, mehr ist besser für niedrigere Frequenzen, sondern in gewisser Ermüdungserscheinungen führen, wenn mehrere Kontraktionen verwendet werden, um das gesamte Spektrum der Kraft-Frequenz-Beziehung zu bestimmen. Wir verwenden in der Regel Kontraktionen bei 0, 20, 40, 60, 80, 100 und 200 Hz. Dieser Bereich von Frequenzen ermöglicht die volle Bandbreite der Kraft-Frequenz-Beziehung beschrieben werden. Eine geeignete Pause zwischen den Kontraktionen muss erlaubt Ermüdung zu vermeiden (1-10 min). </li></ol> 13. Force-Länge relationship 6 <ol><li> Wobei die geschätzte optimale Länge festgelegt wurde, kann eine kraftschlüssige Beziehung Länge durch systematische Anpassung der Länge des Muskels von -4 mm bis 4 mm mit einem Servo-Motor-Vorrichtung bestimmt werden. Dies sollte mit maximaler Stimulation (200 Hz) werden, aber wir haben festgestellt, dass sehr kurze Kontraktionen werden das gleiche gilt optimale Länge 7 zu ergeben. Submaximalen Kontraktionen, wie Zuckungen, können verwendet werden, aber dies wird eine unterschiedliche Länge-Abhängigkeit der Stärke 8 zu ergeben. </li><li> Ein wichtiger Aspekt der Bestimmung der Kraft-Länge Beziehung ist die Notwendigkeit, den passiven Kraft am fascicle Länge, bei der die gemessene Kraft tritt abzuschätzen. Aktiven Kraft wird als die Differenz zwischen der gesamten Kraft und der entsprechende passive Kraft berechnet. Da die parallelen elastischen Strukturen der passiven Kraft ertragen und diese sind in Reihe mit den Serie elastischen Strukturen muss die passive Kraft Beitrag zur gesamten Kraft der Reihe abnehmen elastic Strukturen während einer Kontraktion 3 gestreckt. Sobald das passive Kraft für alle relevanten Muskellängen bekannt ist, kann der entsprechende passive Kraft, mit kontinuierlichen Messung der Länge unter Verwendung fascicle sonomicrometry oder durch Schätzung der Übereinstimmung des Messsystems und die In-Reihe-Strukturen des Muskel-Sehnen-Einheit geschätzt werden. Wenn dies nicht geschieht, werden die optimale Länge der Vorbereitung und Kraftspitzen, unterschätzt. </li></ol> 14. Kraft-Geschwindigkeits-Beziehung 9 <ol><li> Wenn Sie möchten, dass die Kraft-Geschwindigkeits-Beziehung zu bestimmen, müssen Sie die Kraftaufnehmer zu einem System, das die Kontrolle über entweder Last oder Geschwindigkeit der Längenänderung ermöglicht befestigen. Die einfachste und kostengünstigste Methode ist, um den Luftdruck zu verwenden, um Verkürzung zu einer kontrollierten Last zu beschränken. In unserem System wird der Muskel an dem Hebel auf einer Seite des Drehpunkts befestigt ist und der Luftdruck behindert Längenänderung auf der anderen Seite. Eine Länge Sensor needs auf Arbeitnehmer, so dass Sie in der Lage, um die Änderung im Muskel Länge während isotonische Kontraktionen zu erkennen sind. Diese Anordnung ermöglicht afterloaded Kontraktionen mit pneumatischen Widerstand. Dual-Tanks können isometrische Kontraktion mit Freisetzung in einer isotonischen Belastung ermöglichen. Insgesamt 15-20 Kontraktionen sollte erhalten werden, mit Belastungen von fast unbelasteten maximale isometrische Kraft. Beim Anpassen der Daten an eine Gleichung, sollte Lasten über 90% des nicht isometrische 9 verwendet werden. </li></ol> 15. Repräsentative Ergebnisse: Beispiel Kontraktionen sind in Abbildung 2 dargestellt. Diese Kontraktionen wurden erhalten, um die Kraft-Frequenz-Beziehung zu illustrieren. Berechnung der Peak aktive Kraft dieser Kontraktionen und Auftragen der aktiven Kraft gegen die Frequenz, Abbildung ergibt 3; die Kraft-Frequenz-Beziehung. Die Daten in Abbildung 2 dargestellt, kann der Gleichung angepasst werden: AF = c / (1 + e ((aF) / b) + d); AF ist aktiven Kraft, F Frequenz und a,<html> b, c und d Konstanten sind. Für die Ratte gastrocnemius mediale ist die halbmaximale Frequenz der Stimulation typischerweise 50-60 Hz in nicht ermüdet Muskels 2. Ergebnisse werden eng an der Linie durch die obige Gleichung beschrieben. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3167/3167fig1.jpg" /> Abbildung 1 Vorrichtung und Muskel-Set-up:. Pneumatische set-up auf der linken Seite angezeigt, isometrische auf der rechten Seite. Der Hebel-System auf der linken Seite angezeigt wird, um der Übersetzung Tisch befestigt, wenn dynamische Kontraktionen gewünscht werden (in Anlehnung an 13). Der Schrittmotor wird durch einen Computer (aus 14) gesteuert wird. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3167/3167fig2.jpg" /> . Abbildung 2 Überlagerte isometrische Kontraktionen: 20, 40, 60, 80, 100 und 200 Hz. Die Amplitude des 200 Hz Kontraktion 8,13 N. les/ftp_upload/3167/3167fig3.jpg &quot;/&gt; . Abbildung 3 Force-Frequenz-Verhältnis: Active Kraft der Kontraktionen in Abbildung 2 aufgetragen werden und die Linie repräsentiert die Linie der beste Passform.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Gute Qualität kontraktilen Ergebnisse mit Vorsicht in OP-Vorbereitung erhalten werden, sicher in der Vorrichtung und gute Qualität Elektronik Montage. Wenn ein Student lernt diese Operation enthalten einige gemeinsame rutscht: Dehnen der Ischiasnerv, Störung der Durchblutung und starke Blutungen. Der Nerv muss mit Vorsicht behandelt werden, um Schäden zu verhindern. Sie werden wissen, haben die Nerven beschädigt werden, wenn die maximale Kraft bei tetanische optimale Länge ist wesentlich geringer als die in Abbildung 3, oder wenn die Stimulation Spannung benötigt, um zu aktivieren maximal alle Motoreinheiten größer als 5 Volt gezeigt. Es ist relativ einfach, die Blutgefäße dient dieses Muskels während der Operation zu vermeiden. Unterbrechung dieser Gefäße kann auftreten, wenn der Bohrer wird im kaudalen Oberfläche des Oberschenkelknochens gelegt. Wenn die Vorbohrung ist nicht auf die flache Oberfläche des Oberschenkelknochens, kann der Bohrer rutschen. Wenn dies geschieht, besteht die Möglichkeit, dass die Poplitealgefäße gestört zu werden. WennBlutlachen rund um die Muskeln nach dem Set-up, ist es ein Zeichen, dass Sie diese Schiffe gestört. Übermäßige Blutungen können auch auftreten, wenn eine große Vene wird geschnitten und nicht gebunden. Großen Venen aufpassen sind diejenigen, um den Knöchel. Die in situ-Muskel-Präparat ist ein wertvoller Ansatz zur Erforschung des Muskels kontraktilen Eigenschaften. Individuelle motorischen Einheiten können 10 aktiviert werden, aber in der Regel alle motorischen Einheiten synchron aktiviert. Dies ist ein Nachteil gegenüber der Normalen, die durch asynchrone Aktivierung freiwilligen Motoreinheit Rekrutierung auftritt, stellt so eine Einschränkung. Doch auf der positiven Seite, ermöglicht synchrone Ansteuerung Quantifizierung von einer durchschnittlichen Reaktionszeit aller motorischen Einheiten. Es gibt zwei Ansätze, die verwendet wurden, um eine synchrone Aktivierung vermeiden. Eine besteht darin, eine Elektrode Manschette mit mehreren Paaren von stimulierender Leiter verwendet werden. Dies ermöglicht die Aktivierung eines Teils der Motoreinheiten mit jedem Paar,und Stimulation kann durch die Paare drehen, um asynchrone Aktivierung zu erreichen. Diese Methode der Aktivierung kann mit anodischer Block 11 kombiniert werden, um zu versuchen Motoreinheiten in der entsprechenden Reihenfolge zu aktivieren entsprechend der Größe 12 Prinzip. Bei diesem Ansatz werden alle Motoreinheiten mit einem proximalen Paar Elektroden aktiviert wird, und ein Block mit Gleichstrom Stimulation auferlegt. Die Amplitude der Impulse für die Block kann moduliert werden, um Motoreinheiten für die Aktivierung nicht erwünscht ist hemmen. Anscheinend ist der Block betrifft große Axone bei der niedrigsten Spannung und progressiv wirkt kleinere Einheiten. Die in situ-rat gastrocnemius Muskel-Präparat ist eine wertvolle physiologische Ansatz zur Erforschung der Skelettmuskulatur Kontraktion und biochemischen Eigenschaften in Gesundheit und Krankheit.

<table border="1"><tbody><tr><th> Bezeichnung des Geräts </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Haarschneidemaschine </td><td></td><td></td><td> Gute Qualität pet clippers </td></tr><tr><td> Operationsleuchte </td><td> Dyna-Lume </td><td></td><td> Jede von mehreren tun </td></tr><tr><td> Myograph </td><td></td><td></td><td> Custom built </td></tr><tr><td> Stimulator </td><td> Gras </td><td> S-88 </td><td> Jede von mehreren tun </td></tr><tr><td> DMS-Messverstärker </td><td> CWE </td><td> PM-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Registrierfernthermometer </td><td> YSI </td><td> YSI-400 </td><td></td></tr><tr><td> Roboter-Plattform </td><td> Arrick Robotics </td><td> MD-2 </td><td></td></tr><tr><td> Sonometric Verstärker </td><td> Sonometrics </td><td> Sonolab </td><td></td></tr><tr><td> Computer und Datenerfassung </td><td> PC mit NI board </td><td></td><td> Kundenspezifische Software (LabVIEW) </td></tr><tr><td> Heizblock </td><td> Lab-line </td><td> Multi-Block </td><td></td></tr><tr><td> Nervenmanschette </td><td></td><td></td><td> Maßgeschneiderte </td></tr><tr><td> Mikrostimulator </td><td></td><td></td><td> Maßgeschneiderte </td></tr></tbody></table>

procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties

Es gibt viele Umstände, in denen es wünschenswert ist, den Kontraktionsreaktion der Skelettmuskulatur unter physiologischen Bedingungen erhalten: normalen Verkehr, intakten ganzen Muskel, bei Körpertemperatur. Dies beinhaltet die Untersuchung der kontraktilen Antworten wie posttetanic Potenzierung, Treppenhaus und Müdigkeit. Darüber hinaus können die Folgen von Krankheit, Nichtgebrauch, Verletzungen, Training und medikamentöse Behandlung von Interesse sein. Dieses Video zeigt, geeignete Verfahren zur Einrichtung und Verwendung dieser wertvollen Muskel-Präparat. Zum Einrichten dieser Vorbereitung, so muss das Tier betäubt, und die mediale M. gastrocnemius wird chirurgisch getrennt, mit der Ursprung intakt. Es muss darauf geachtet, um das Blut und Nerven versorgt zu halten. Ein langer Abschnitt der Ischiasnerv des Bindegewebes gelöscht und durchtrennt proximal. Alle Zweige der distalen Stumpf, die nicht innervieren nicht die mediale Gastrocnemius Muskel durchtrennt werden. Der distale Nervenstumpf ist Inserted in eine Manschette mit Edelstahl-stimulierenden Drähten aufgereiht. Das Fersenbein durchtrennt, so dass ein kleines Stück Knochen noch an der Achillessehne befestigt. Sonometric Kristalle und / oder Elektroden für Elektromyographie eingeführt werden kann. Immobilisierung durch Metall-Sonden in den Femur und Tibia verhindert eine Bewegung des Muskels Ursprungs. Die Achillessehne ist an dem Kraftaufnehmer befestigt ist und das gelöste Haut besteht an den Seiten gezogen wird, um einen Behälter, der mit erwärmtem Paraffinöl gefüllten bilden. Das Öl verteilt die Wärme gleichmäßig und minimiert Verdunstungskälte. Eine Wärmelampe auf den Muskel gerichtet, und der Muskel-und Ratten sind erwärmen gelassen bis 37 ° C. Während es warm ist, können maximale Spannung und die optimale Länge bestimmt werden. Dies sind wichtige Randbedingungen für jedes Experiment auf intakten ganzen Muskel. Das Experiment kann auch die Bestimmung von Standard-kontraktile Eigenschaften, wie die Kraft-Frequenz-Verhältnis, Kraft-length Beziehung und Kraft-Geschwindigkeits-Beziehung. </p&gt; Mit Sorgfalt bei chirurgischen Isolierung, Immobilisierung des Ursprungs des Muskels und Ausrichtung des Muskel-Sehnen-Einheit mit dem Kraftaufnehmer und richtige Datenanalyse, können qualitativ hochwertige Messungen mit diesem Muskel-Präparat erhalten werden.

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Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Dieses Video zeigt die OP-Vorbereitung und Verfahren benötigt, um die kontraktilen Antworten der Ratte medialen Gastrocnemius Muskel-Präparat zu studieren<em&gt; In situ</em&gt;. Dieses Präparat ermöglicht die Messung der Skelettmuskulatur kontraktilen Eigenschaften unter physiologischen Bedingungen. Das Tier narkotisiert und der Muskel vom umgebenden Gewebe an seinem distalen Ende getrennt. Der Achillessehnenbereich ist mit einem Kraftaufnehmer befestigt, der eine Messung des Muskels Kontraktionsreaktion bei 37 Grad C mit einer intakten Zirkulation.

Verfahren für die Ratte<em&gt; In situ</em&gt; Skeletal Muscle kontraktilen Eigenschaften

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

28.5K Aufrufe.  University of Calgary. Dieses Video zeigt die OP-Vorbereitung und Verfahren benötigt, um die kontraktilen Antworten der Ratte medialen Gastrocnemius Muskel-Präparat zu studieren In situ. Dieses Präparat ermöglicht die Messung der Skelettmuskulatur kontraktilen Eigenschaften unter physiologischen Bedingungen. Das Tier narkotisiert und der Muskel vom umgebenden Gewebe an seinem distalen Ende getrennt. Der Achillessehnenbereich ist mit einem Kraftaufnehmer befestigt, der eine Me...

Serie: Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

In-vivo-Mikro-Zirkulation Measurement im Skelettmuskel von Intra-vital-Mikroskopie

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Forschung

Biologie

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Ex Vivo Beurteilung der Kontraktilität, Müdigkeit und Alternans in isolierten Skelettmuskulatur

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Laser-Schädigung der Zebrafisch Embryonale Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Erkennung und Analyse von DNA-Schädigungen in Maus-Skelettmuskel<em&gt; In-situ-</em&gt; Verwenden der TUNEL-Methode

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of serially linked sarcomeres, the smallest contractile units in muscle. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in patients with mutations in genes encoding for sarcomeric proteins. The study of myofibril mechanics allows for the assessment of actin-myosin interactions without potential confounding effects of damaged, adjacent myofibrils when measuring the contractility of single muscle fibers. Ultrastructural damage and misalignment of myofibrils might contribute to impaired contractility. If structural damage is present in the myofibrils, they likely break during the isolation procedure or during the experiment. Furthermore, studies in myofibrils provide the assessment of actin-myosin interactions in the presence of the geometrical constraints of the sarcomeres. For instance, measurements in myofibrils can elucidate whether myofibrillar dysfunction is the primary effect of a mutation in a sarcomeric protein. In addition, perfusion with calcium solutions or compounds is almost instant due to the small diameter of the myofibril. This makes myofibrils eminently suitable to measure the rates of activation and relaxation during force production. The protocol described in this paper employs an optical force probe based on the principle of a Fabry-P&#233;rot interferometer capable of measuring forces in the nano-Newton range, coupled to a piezo length motor and a fast-step perfusion system. This setup enables the study of myofibril mechanics with high resolution force measurements.

Presented here is a protocol to assess the contractile properties of striated muscle myofibrils with nano-Newton resolution. The protocol employs a setup with an interferometry-based, optical force probe. This setup generates data with a high signal-to-noise ratio and enables the assessment of the contractile kinetics of myofibrils.

Isolieren von Myofibrils von Skelettmuskelbiopsien und Bestimmung der Kontraktilenfunktion mit einem Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in muscle homeostasis, injury, and repair. Current protocols for FAPs identification and isolation use flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS) and studies evaluating their function in vivo to date have been undertaken exclusively in mice. The larger inherent size of the rat allows for a more comprehensive analysis of FAPs in skeletal muscle injury models, especially in severely atrophic muscle or when investigators require substantial tissue mass to conduct multiple downstream assays. The rat additionally provides a larger selection of muscle functional assays that do not require animal sedation or sacrifice, thus minimizing morbidity and animal use by enabling serial assessments. The flow cytometry/FACS protocols optimized for mice are species specific, notably restricted by the characteristics of commercially available antibodies. They have not been optimized for separating FAPs from rat or highly fibrotic muscle. A flow cytometry/FACS protocol for the identification and isolation of FAPs and MPs from both healthy and denervated rat skeletal muscle was developed, relying on the differential expression of surface markers CD31, CD45, Sca-1, and VCAM-1. As rat-specific, flow cytometry-validated primary antibodies are severely limited, in-house conjugation of the antibody targeting Sca-1 was performed. Using this protocol, successful Sca-1 conjugation was confirmed, and flow cytometric identification of FAPs and MPs was validated by cell culture and immunostaining of FACS-isolated FAPs and MPs. Finally, we report a novel FAPs time-course in a prolonged (14 week) rat denervation model. This method provides the investigators the ability to study FAPs in a novel animal model.

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

This protocol outlines a method to isolate Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) from rat skeletal muscle. Utilization of the rat in muscle injury models provides increased tissue availability from atrophic muscle for the analysis and a larger repertoire of validated methods to assess muscle strength and gait in free-moving animals.

Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung von fibro-adipogenen Vorläufern (FAPs) und myogenen Vorläufern (MPs) in der Skelettmuskulatur der Ratte

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions can be converted back to NO in mammals through a two-step reduction mechanism: nitrate being reduced to nitrite (NO2-) mostly by oral commensal bacteria, then nitrite being reduced to NO by several mechanisms including via heme- or molybdenum-containing proteins. This reductive nitrate pathway contributes to enhancing NO-mediated signaling pathways, particularly in the cardiovascular system and during muscular exercise. The levels of nitrate in the body before such utilization are determined by two different sources: endogenous NO oxidation and dietary nitrate intake, principally from plants. To elucidate the complex NO cycle in physiological circumstances, we have examined further the dynamics of its metabolites, nitrate and nitrite ions, which are relatively stable compared to NO. In previous studies skeletal muscle was identified as a major storage organ for nitrate ions in mammals, as well as a direct source of NO during exercise. Therefore, establishing a reliable methodology to measure nitrate and nitrite levels in skeletal muscle is important and should be helpful in extending its application to other tissue samples. This paper explains in detail the preparation of skeletal muscle samples, using three different homogenization methods, for nitrate and nitrite measurements and discusses important issues related to homogenization processes, including the size of the samples. Nitrate and nitrite concentrations have also been compared across four different muscle groups.

We present protocols for three different methods for the homogenization of four different muscle groups of rat skeletal muscle tissue to measure and compare the levels of nitrate and nitrite. Furthermore, we compare different sample weights to investigate whether tissue sample size affects the results of homogenization.

Herstellung von Ratten-Skelettmuskelhomogenaten für Nitrat- und Nitritmessungen

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

Quantifizierung der Fettinfiltration der Skelettmuskulatur durch Dezellularisierung

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic disorders, and dystrophies. Clinically in human populations, fatty infiltration is assessed using noninvasive methods, including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound (US). Although some studies have used CT or MRI to quantify fatty infiltration in mouse muscle, costs and insufficient spatial resolution remain challenging. Other small animal methods utilize histology to visualize individual adipocytes; however, this methodology suffers from sampling bias in heterogeneous pathology. This protocol describes the methodology to qualitatively view and quantitatively measure fatty infiltration comprehensively throughout intact mouse muscle and at the level of individual adipocytes using decellularization. The protocol is not limited to specific muscles or specific species and can be extended to human biopsy. Additionally, gross qualitative and quantitative assessments can be made with standard laboratory equipment for little cost, making this procedure more accessible across research laboratories.

Autor im Rampenlicht: Dezellularisierungsbasierte Quantifizierung der Fettinfiltration der Skelettmuskulatur  

The present study describes decellularization-based methodologies for visualizing and quantifying intramuscular adipose tissue (IMAT) deposition through intact muscle volume, as well as quantifying metrics of individual adipocytes that comprise IMAT.