Die Autoren möchten das grüne Labor für hilfreiche Gespräche danken. Diese Arbeit wurde zum Teil unterstützt von NIH-Stipendien, R03AG052018 und R01GM124342, E.M.G.

1. Pre-binden Sie Antikörper gegen magnetische Beads
<ol>
	<li>Das Protein A/G magnetische Beads gut mischen und 20 µL des magnetischen Kügelchen je ein Immunopräzipitation (IP) Probe auf einem 1,5 mL-Tube übertragen. Hinweis: Wenn Perlen pipettieren, verwenden Sie weite Bohrung, Low Retention Spitzen.</li>
	<li>Legen Sie das Rohr mit Perlen in einem Magnetstativ und ermöglichen Sie Perlen zu sammeln auf Seite des Rohres zu. Den Überstand zu entfernen.</li>
	<li>Waschen Sie die Perlen 3 Mal mit 1 mL kalte Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS) (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl).</li>
	<li>Perlen und entsprechende Menge des Antikörpers 200 µL des TBS hinzufügen. Drehen Sie bei 8 u/min bei 4 ° c über Nacht Hinweis: Für viele Histon-PTM-Antikörper reicht 1 bis 3 µg des Antikörpers pro IP. Titration Experimente werden jedoch empfohlen, um angemessene Konzentrationen festzustellen. Empfohlenen Konzentrationen gut charakterisierten, kommerzielle Histon-PTM-Antikörper sind oft genau und finden Sie in den veröffentlichten Berichten oder Produkt-Literatur.</li>
	<li>Die Perlen in einem Magnetstativ und Entfernen des Überstands. Waschen Sie sie mit 1 mL TBS.</li>
	<li>Aufschwemmen der Perlen 20 µL des TBS pro IP Probe plus eine zusätzliche 5 µL (Pipettier Fehlerfall) TBS. Hinweis: Die Perlen können kurzfristig bei 4 ° C bis zum Gebrauch gespeichert werden.</li>
</ol>
(2) Hefezellen wachsen
<ol>
	<li>10 mL YPD (10 % Hefeextrakt, 20 % Pepton und 20 % Traubenzucker) mit einer einzigen Kolonie der entsprechenden Sorte zu impfen und bei 30 ° C über Nacht in einem schütteln Inkubator bei 220 u/min zu wachsen.</li>
	<li>Messung die optische Dichte bei 600 nm (OD600) die Hefekultur mit einem Spektralphotometer. Verdünnen Sie die Kultur, die eine OD600 = 0,2 in 100 mL YPD in eine neue Flasche.</li>
	<li>Wachsen die Zellen bei 30 ° C in einem schütteln Inkubator bei 220 u/min, bis sie Mitte des Log-Phase erreichen (OD600 = 0,6-0,8).</li>
</ol>
3. in-Vivo -Vernetzung von Proteinen, DNA
<ol>
	<li>Wenn Kulturen Mid Log-Phase erreichen, hinzugeben Sie 2,7 mL 37 % Formaldehyd direkt auf das Medium für eine Endkonzentration von 1 % Formaldehyd. Übertragen Sie den Kolben auf einen Shaker bei 25 ° C (oder Raumtemperatur) und 50 u/min für 15 min schütteln.</li>
	<li>Das Medium 5 mL 2,5 M Glycin hinzufügen und weiter Schütteln bei 50 u/min bei Raumtemperatur für 5 min um das Formaldehyd zu stillen.</li>
	<li>Transfer der Zellen, um die Zentrifuge Flaschen und drehen Sie die Zellen bei 5800 X g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren Sie überstand.
	<ol>
		<li>Waschen Sie die Zellen mit der resuspending sie in 45 mL kaltem TBS und übertragen Sie die Aussetzung in ein 50 mL konische Röhrchen. Drehen Sie das Rohr auf 2800 X g für 3 min bei 4 ° C. Den Überstand zu entfernen.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen in 10 mL kalten Lysis Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA), 1 % Nonidet Octyl Phenoxypolyethoxylethanol (NP-40) Chip, bei 4 ° C gelagert).</li>
		<li>Drehen Sie die Zellen bei 2800 X g für 3 min bei 4 ° C. Den Überstand zu entfernen. Hinweis: Zellen können mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° C bis zur Weiterverarbeitung gelagert.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. machen Sie Hefe Lysates
<ol>
	<li>Die Zellen in 1 mL kalte ChIP Lysis Puffer mit 1 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF) und 1:1,000 Verdünnung der Hefe-Protease-Inhibitor cocktail aufzuwirbeln. Übertragen Sie die Aussetzung auf eine 2,0 mL-Schraubverschluss-Röhrchen mit 200 µL von Glasperlen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen auf eine Perle schlagen Apparat für high-Speed-Agitation bei 4 ° C und Wulst beat 6 Mal für 30 s. Halten Sie die Zellen auf Eis für mindestens 1 Minute zwischen jede Perle zu schlagen.</li>
	<li>Übertragen Sie auf einer 1,5 mL-Tube mit Gel laden Tipps der lysate. Zentrifugieren der lysate 15.500 x g für 20 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Den Überstand verwerfen und erneut das Pellet in 250 µL MNase Verdauung Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 21 mM CaCl2, 1 % NP-40, bei 4 ° C gelagert) durch sanft auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Die Reaktionen 2,5 µL MNase hinzufügen. Mischen Sie sie sanft durch invertieren 4-6 Mal und es sofort im Wasserbad 37 ° C für 20 min inkubieren. Hinweis: Digest Bedingungen sollten optimiert werden, wenn eine neue Aktie der MNase verwendet wird. Siehe Schritt 10 des Protokolls.</li>
	<li>Legen Sie die Rohre sofort auf Eis, um die Reaktion zu stoppen, und fügen Sie 5 µL 0,5 M EDTA für eine Endkonzentration von 10 mM EDTA. Mischen Sie sie sanft durch Umkehrung.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Reaktion bei 15.500 x g für 15 min bei 4 ° C und übertragen Sie den Überstand auf eine neue 1,5 mL Tube. Hinweis: Lösliche (verdaut) Chromatin werden im Überstand. Die Tablette enthält alles unverdaut und unlöslichen Zellenrückstand.</li>
</ol>
5. Immunoprecipitate (IP) modifiziert Histone
<ol>
	<li>Bestimmen Sie die Konzentration des Proteins der einzelnen MNase veröffentlicht Chromatin-Fraktionen mit einem Bradford-Assay. Fügen Sie 1 mL der Bradford-Reagenz zu jedem der 8 verfügbaren Küvetten plus 1 zusätzliche Küvette für jedes Protein Sample getestet werden.
	<ol>
		<li>Bereiten Sie eine Stammlösung von 2 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA).</li>
		<li>Fügen Sie das entsprechende Volumen um die folgenden Konzentrationen von BSA in 1 mL der Bradford-Reagenz zu erreichen: 0 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 µg/mL, 4 μg/mL, 6 μg/mL, 8 μg/mL und 10 μg/mL. Die zusätzliche Küvetten 2 μL des Bruches MNase veröffentlicht Chromatin hinzufügen.</li>
		<li>Decken Sie die Spitze der einzelnen Küvette mit einem kleinen Stück Parafilm und invertieren die Küvetten 4-6 Mal die Lösung gut mischen. Inkubieren Sie die Küvetten bei Raumtemperatur für 15 min.</li>
		<li>Mit einem sichtbaren Licht Spektralphotometer messen die Extinktion bei 595 nm für die Standardkurve und experimentellen Proben. Hinweis: Verwenden Sie die Küvette ohne BSA (0 μg/mL), das Spektrophotometer vor der ersten Messung leer.</li>
		<li>Zeichnen Sie eine Standardkurve über die Extinktion-Werte für die unterschiedlichen Konzentrationen von BSA auf Software verbunden mit dem Spektralphotometer oder Tabellenkalkulations-Software. Anhand der Standardkurve und den Verdünnungsfaktor verwendet (1: 500), verwenden Sie die Absorption Werte um die Proteinkonzentration für jede der Chromatin Bruchteil Proben zu berechnen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fügen Sie für jede IP 50 µg Gesamt-Protein aus der MNase veröffentlicht Chromatin-Fraktion auf ChIP Lysis Puffer zu einem Endvolumen von 1 mL zu erreichen hinzu. Hinweis: Wenn mehr als eine IP-Adresse pro lysate einrichten, um ein master-Mix von der lysate und ChIP Lysis Puffer und aliquoten 1 mL zu einzelnen Rohre für die IP-Adresse.</li>
	<li>Entfernen Sie 100 µL aus der IP-Mix, als das Eingabesample zu verarbeiten. Fixieren Sie das Eingabesample bei-20 ° C bis Schritt 7.1. Hinweis: Alle verbleibenden Chromatin-Probe kann auch bei-20 ° C eingefroren und bei Bedarf für eine spätere IP verwendet.</li>
	<li>Fügen Sie 20 µL des magnetischen Protein A/G Perlen mit Antikörper gegen jede IP-Probe bereits gebunden.</li></ol>Drehen Sie die Probe mit 8 u/min für 3 h (Standard) oder über Nacht (falls gewünscht) bei 4 ° C.

6. Waschen Sie IPs und eluieren Sie Histon-DNA-komplexen
<ol>
	<li>Die Röhren in einem Magnetstativ und lassen Sie Perlen auf der Seite der Röhre zu sammeln. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Waschen Sie die Perlen nacheinander mit 1 mL eines jeden der Puffer unten.
	<ol>
		<li>Führen Sie jedem Waschgang indem drehen bei 8 u/min für 5 min bei 4 ° C, Perlen in einem Magnetstativ, überstand entfernen und Hinzufügen von nächste Puffer: 2 X - ChIP Lysis Puffer, 2 X - hohe Salz Waschpuffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA 1 % NP-40, bei 4 ° C gelagert), 1 X - LiCI/Reinigungsmittel Waschpuffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 250 mM LiCI, 1 mM EDTA, 1 NP-40 %, 1 % Natrium Deoxycholate, bei 4 ° C gelagert), 1 X - TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, bei 4 ° C gelagert) und 1 X - TE.</li>
		<li>Übertragen Sie mit letzten TE waschen Perlen auf eine neue Röhre mit 0,5 mL TE, übertragen die meisten Perlen, dann eine weitere 0,5 mL TE zu waschen das Rohr und übertragen die restlichen Perlen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fügen Sie 250 µL frisch zubereiteten ChIP Elution Buffer (1 % SDS, 1 mM Nahco33). Wirbel die Lösung kurz. Drehen Sie die Proben bei 8 u/min für 15 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Rohr in einem Magnetstativ und sammeln Sie die Perlen zu. Sorgfältig übertragen Sie den Überstand zu, zu einem neuen Schlauch und vermeiden Sie die Perlen. Hinweis: Das Eluat enthält Immunoprecipitated Proteine und damit verbundenen DNA.</li>
	<li>Hinzu kommt eine weitere 250 µL ChIP Elution Buffer Perlen. Drehen Sie die Proben bei 8 u/min für 15 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Übertragen Sie den Überstand sorgfältig auf das Röhrchen mit der ersten Elution. Entfernen Sie ggf. ein kleineres Volumen (240 µL) für alle IPs zu vermeiden, die Perlen zu stören.</li>
</ol>
7. rückwärts Protein-DNA vernetzt
<ol>
	<li>Die Eingabesamples Auftauen und 400 µL ChIP Elution Buffer zu jeder Eingabe hinzufügen.</li>
	<li>Eingang und IP-Proben fügen Sie 20 µL 5 M NaCl 5 µL von 20 mg/mL Glykogen und 12,5 µL von 20 mg/mL Proteinase K. Mix gut durch invertieren oder Rohre streichen hinzu. Über Nacht inkubieren Sie die Proben im Wasserbad 65 ° C.</li>
</ol>
8. reinigen und DNA zu konzentrieren
<ol>
	<li>Am Eingang und IP-Proben 10 µL von 10mg/mL RNase A hinzufügen. Inkubieren Sie die Proben im Wasserbad 37 ° C für 30 min.</li>
	<li>Die wässrige Lösung 600 µL Phenol: Chlorofrom:isoamyl Alkohol (25:24:1 PCI) hinzufügen und gut mischen. Drehen sie mit 15.500 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
	<ol>
		<li>Entfernen Sie die wässrige Schicht zu einem neuen Schlauch. 600 µL des PCI-Standards hinzufügen und gut mischen. Drehen Sie das Rohr auf 15.500 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die wässrige Schicht auf einen neuen Schlauch. Achtung: Arbeiten in der Dunstabzugshaube und tragen geeigneten persönlichen Schutzausrüstung bei der Arbeit mit PCI. Flüssige und feste Abfälle zu entsorgen, wie institutionelle Richtlinien angewiesen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fügen Sie 0,1 X Volumen von 3M Natriumacetat und 1 mL kalte 100 % Ethanol, die DNA auszufällen. Invertieren den Schlauch 4 - 6 Mal die Lösung gut mischen. Über Nacht bei-20 ° C inkubieren.
	<ol>
		<li>Drehen Sie das Rohr auf 15.500 x g für 20 min bei 4 ° C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette.</li>
		<li>Gewaschen Sie das Pellet in 1 mL kaltem 70 % igem Ethanol werden. Drehen sie bei 15.500 x g für 10 min bei 4 ° C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette.</li>
		<li>An der Luft trocknen Sie die Pellets in der Haube für ca. 20 min (bis es komplett trocken). IP-Proben in 50 µL Nuklease-freies Wasser Aufschwemmen und Eingabesamples in 100 µL Nuklease-freies Wasser Aufschwemmen. Lagern Sie die DNA-Proben bei-20 ° C bis zur Durchführung qPCR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. Quantitative PCR (qPCR) erkennen bereichert genomische Regionen
<ol>
	<li>Machen Sie einen qPCR-master-Mix für jeden Satz von Primern. Eine mögliche Reaktion enthält 5 µL 2 X qPCR-Mix, 0,25 µL 20 µM vorwärts Grundierung und 0,25 µL 20 µM-rückwärts-Primer. Hinweis: Die richtige Grundierung Gestaltung und Prüfung für qPCR Experimente sind an anderer Stelle beschrieben14,15,16.</li>
	<li>DNA-master Mix für jede DNA-Probe zu machen. Eine mögliche Reaktion enthält 0,5 µL DNA und 4.0 µL Nuklease-freies Wasser.</li>
	<li>Jede Vertiefung auf einer qPCR 384-Well-Platte 5,5 µL der entsprechenden Grundierung-master-Mix und 4,5 µL der entsprechenden DNA-master-Mix hinzufügen. Hinweis: Starten Sie mit dem Hinzufügen von 5,5 µL der Primer-Mix in jede Vertiefung. Drehen Sie die Platte 200 X g für 1 min bei Raumtemperatur vor dem Hinzufügen von 4,5 µL DNA-Mix.</li>
	<li>Die Dichtung an der Platte und Spin 200 X g für 1 min bei Raumtemperatur zu halten.</li>
	<li>QPCR mit einem Echtzeit-qPCR-System mit den folgenden Bedingungen durchzuführen: 95 ° C für 3 min; 40 Zyklen von 95 ° C für 10 s, 55 ° C für 30 s; schmelzenden Kurve 65 ° C bis 95 ° C in 0,5 ° C-Schritten, 5 s.</li>
	<li>Für jede Primerpaar berechnet die prozentuale Eingabe der IP-Probe im Vergleich zu den 5 % Eingabesample in der qPCR verwendet. Nutzen Sie Mittel der technischen PCR-Triplicates, um die Berechnungen durchzuführen. Hinweis: Wenn erhebliche Unterschiede in der PCR Triplicates eingehalten wird, ist es am besten, die qPCR mit Augenmerk auf master-Mix Zusammensetzung, Pipettieren Fehler und Kreuzkontaminationen zwischen Brunnen in 384-Well-Platte zu wiederholen.<ol>
		<li>Passen Sie die Cq Werte für die Eingabe zu 100 % durch die Anzahl der Zyklen, die Vertretung des Verdünnungsfaktor von Cq-Rohwerte subtrahieren. Hinweis: Fünf Prozent Eingang steht ein Verdünnungsfaktor 20-fache, das 4,32 Zyklen entspricht (log2 20 = 4.32).</li>
		<li>Berechnen Sie den Eingang als 2 Prozent ^ (CqEingang - CqIP) multipliziert mit 100.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. Bedingungen Sie MNase Digest (empfohlen vor dem ersten vollen ChIP Experiment)
<ol>
	<li>Führen Sie die Schritte 2.1 bis 4.4 des vorhergehenden Protokolls. Scale-up des Protokolls, genug für mehrere Proben von MNase Verdauung des Pellet-Chromatin-haltigen lysate zu generieren. Bei Schritt 4.4 Aufschwemmen der Pellets in 1,25 mL MNase Verdauung Puffer. Aliquot zu 5 Proben Rohre so, dass jeder enthält 250 µL des Chromatins Pellet-Nukleinsäuretablette in MNase Verdauung Puffer.</li>
	<li>Fügen Sie 0, 1,5, 2,5 oder 5 µL MNase für jedes Rohr. Mischen Sie sie sanft durch invertieren 4-6 Mal und sofort die Rohre im Wasserbad 37 ° C für 20 min inkubieren.</li>
	<li>Stopp-Reaktionen sofort Rohre auf dem Eis und Hinzufügen von 5 µL 0,5 M EDTA für eine Endkonzentration von 10 mM.</li></ol>Mischen Sie durch Umkehrung der Lösung vorsichtig.
	<li>Schläuche am 15.500 x g für 15 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand auf eine neue 1,5 mL Tube übertragen.</li>
	<li>1 % Endkonzentration (25 µL der Stammlösung 10 %) und Nahco33 bis 0,1 M Endkonzentration (25 µL der Stammlösung 1 M) zu den Beispielen in den 1,5 mL Röhrchen SDS hinzufügen.</li>
	<li>Die Proben in den 1,5 mL Röhrchen 20 µL 5M NaCl 5 µL von Glykogen und 12,5 µL 20mg/mL Proteinase K hinzugefügt werden. Inkubieren sie bei 65 ° C über Nacht.</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL 10 mg/mL RNaseA. Bei 37 ° C für 30 min inkubieren.</li>
	<li>Die wässrige Lösung 300 µL des PCI-Standards hinzufügen und gut mischen. Drehen Sie mit 15.500 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
	<ol>
		<li>Entfernen Sie wässrige Schicht zu einem neuen Schlauch. 300 µL des PCI-Standards hinzufügen und gut verrühren. Drehen Sie mit 15.500 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Übertragen Sie wässrige Schicht auf einen neuen Schlauch.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fügen Sie 0,1 X Volumen von 3 M Natriumacetat (in der Regel ~ 30 µL) und 1 mL kalte 100 % Ethanol, die DNA auszufällen. Invertieren den Schlauch 4 - 6 mal gut mischen. Über Nacht inkubieren Sie das Rohr bei-80 ° C für 1 h oder-20 ° C.
	<ol>
		<li>Drehen Sie das Rohr auf 15.500 x g für 20 min bei 4° C. Überstand mit einer Pipette vorsichtig zu entfernen.</li>
		<li>Gewaschen Sie die Pellets in 1 mL kaltem 70 % igem Ethanol werden. Drehen Sie mit 15.500 x g für 10 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Lassen Sie die Pellets in die Haube ca. 20 min (oder bis es komplett trocken) an der Luft trocknen. Die Pellets in 30 µL Nuklease-freies Wasser Aufschwemmen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fügen Sie die DNA loading Dye und laufen 20 µL auf ein 2 % Agarose Gel visualisieren verdaut DNA.</li>

<ol>
	<li>Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+Your+Own+Adventure:+The+Role+of+Histone+Modifications+in+Yeast+Cell+Fate.">Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate.</a> J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).</li><li>Suganuma, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+combinatorial+functions+of+histone+modifications.">Signals and combinatorial functions of histone modifications.</a> Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).</li><li>Solomon, M. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation+of+histone+H3+Lys+4+in+coding+regions+of+active+genes.">Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes.</a> P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).</li><li>Pokholok, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+map+of+nucleosome+acetylation+and+methylation+in+yeast.">Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast.</a> Cell. 122 (4), 517-527 (2005).</li><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Paf1+complex+is+required+for+histone+H3+methylation+by+COMPASS+and+Dot1p:+linking+transcriptional+elongation+to+histone+methylation.">The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation.</a> Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).</li><li>South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K4+methyltransferase+Set1+is+involved+in+maintenance+of+ergosterol+homeostasis+and+resistance+to+Brefeldin+A.">H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A.</a> P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).</li><li>Margaritis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+repressive+mechanisms+for+histone+3+lysine+4+methylation+through+promoting+3'-end+antisense+transcription.">Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3'-end antisense transcription.</a> PLoS Genet. 8 (9), e1002952 (2012).</li><li>Jezek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+methyltransferases+Set5+and+Set1+have+overlapping+functions+in+gene+silencing+and+telomere+maintenance.">The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance.</a> Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).</li><li>Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sir2p+and+Sas2p+opposingly+regulate+acetylation+of+yeast+histone+H4+lysine16+and+spreading+of+heterochromatin.">Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin.</a> Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).</li><li>Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+gradient+of+histone+acetylation+established+by+Sas2p+and+Sir2p+functions+as+a+shield+against+gene+silencing.">Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing.</a> Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).</li><li>Rothbart, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Interactive+Database+for+the+Assessment+of+Histone+Antibody+Specificity.">An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity.</a> Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die effiziente Gewinnung von DNA mit geänderten Histone in Hefezellen durch Immunopräzipitation verbunden. Dies wird gefolgt von qPCR mit Primer die Regionen von Interesse festzustellen, lokale Anreicherung oder Erschöpfung der spezifische Histon-Modifikationen zu verstärken. Trotz der vor fast 20 Jahren als eine Methode entwickelt, bleibt ChIP der entscheidende Test für die Untersuchung von Histon Änderungsstand an verschiedenen genomischen Regionen und unter unterschied...

Die dynamische Post-translationale Modifikation (PTM) der Histone ist eine wichtige Regulationsmechanismus für viele DNA-templated Prozesse, einschließlich Transkription, Replikation und DNA-Reparatur1,2. Die Fähigkeit, die Fülle und die präzise Lokalisierung der geänderten Histone mit dieser Prozesse zu bestimmen ist daher entscheidend für ihre Verordnung unter verschiedenen Bedingungen in der Zelle zu verstehen. Die Entwicklung von Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) als eine Methode weitgehend entstammte biochemische Untersuchungen der Interaktionen von Proteinen mit DNA, insbesondere in-vitro- Methoden mit chemischen Vernetzer, gepaart mit zu bewerten die Dynamik der Protein-DNA-Wechselwirkungen in Vivo und in bestimmten Regionen des Genoms3,4,5. Die Weiterentwicklung der quantitativen PCR (qPCR) und Sequenziertechnologien hat auch die Fähigkeit zur ChIP-Experimente mit quantitative Vergleiche und in ganzer Genome, so dass es ein leistungsfähiges Werkzeug für DNA-Protein Interaktionen zu sezieren erweitert. mehrere Ebenen.
Derzeit ist ChIP eine gewünschte Methode für jede Forschungsgruppe Chromatin-vermittelte Regulation des Genoms interessiert, da gibt es keine vergleichbaren Methoden für direkt befragen die physikalische Verbindung zwischen eine modifizierte Histon und einer spezifischen genomischen Locus in Vivo. Obwohl Variationen dieser Methode mit der Sequenzierung der nächsten Generation zuordnen Histon Änderungen im gesamten Genom6,7 verfügbar sind, können diese Ansätze richten verschiedene wissenschaftliche Fragestellungen und deren Umfang, Kosten und technische Ressourcen können für einige Forschungsgruppen zu begrenzen. Darüber hinaus gezielte ChIP-qPCR ist notwendig, diese ergänzen Ansätze durch die Bereitstellung von Methoden, um beide zu optimieren das ChIP-Protokoll vor der Sequenzierung und Ergebnisse aus der epigenomischen-Datasets zu validieren. Massenspektrometrie basierte Ansätze für identifizieren die volle Ergänzung von Histon Marken genomische Regionen zugeordnet auch haben8,9,10,11, doch tauchten diese Ansätze haben einige Einschränkungen in Bezug auf die Regionen des Genoms sondiert werden können und sie erfordern Fachwissen und Instrumentierung, die nicht zur Verfügung, um alle Forschungsgruppen werden. ChIP bleibt daher eine grundlegende Methode für die Analyse, die Fülle und den Vertrieb von Histon-Modifikationen unter unterschiedlichen Bedingungen für alle Forschungsgruppen Epigenetik, Chromatin und die Regulierung der genomischen Funktionen interessiert.
Hier beschreiben wir eine Methode für sein Modell die ChIP mit den angehenden Hefe Saccharomyces Cerevisiae (S. Cerevisiae) um die Verteilung von Histon PTMs im Chromatin zu untersuchen. Dieser Ansatz stützt sich auf eine Reihe von Kernkomponenten des ChIP-Protokolle in Hefe entwickelt und galt auch für diverse Modell Systeme12,13. Wechselwirkungen zwischen geänderten Histone und DNA in der Zelle sind durch Vernetzung mit Formaldehyd konserviert. Nach lysate Vorbereitung sind Chromatin Fragmente in gleichmäßig große Fragmente durch Vergärung mit micrococcal Nuklease solubilisiert. Immunopräzipitation der geänderten Histone erfolgt mit kommerziellen oder Labor erzeugten Antikörper und alle damit verbundenen DNA isoliert und analysiert für die Anreicherung an bestimmten genomische Regionen mit qPCR (Abbildung 1). Für viele Histon-Modifikationen reicht die Menge an DNA erhalten aus diesem Protokoll mehr als 25 verschiedenen genomic Loci von qPCR getestet.
Diese ChIP-Methode ist sehr vielseitig für die Überwachung der Verteilung einer einzelnen Histon-Modifikation über mehrere mutierte Stämme oder Umweltbedingungen oder in Wildtyp-Zellen bei einer Reihe von genomic Loci zu Testzwecken mehrere Histon-Modifikationen. Darüber hinaus sind zahlreiche Komponenten des Protokolls leicht einstellbar, Erkennung von entweder hoch - oder niedrigen-reichlich vorhandene Histon-Marken zu optimieren. Schließlich bietet angehenden Hefe ChIP der geänderten Histone bei die Möglichkeit, wichtige Kontrollen für Antikörperbesonderheit, die weitgehend in andere Systeme nicht verfügbar sind. Nämlich Hefestämme erzeugt werden können, den Punktmutationen in Histon Rückstände zu tragen, die für eine Änderung ausgerichtet sind, und in einigen Fällen gibt es nur ein einziges Enzym, die Änderung auf einen bestimmten Histon-Rückstand katalysiert (zB. Histon Lysin Methyltransferasen). Daher kann ChIP durchgeführt werden, entweder die Histon Mutant oder Enzym Löschung Stämme, inwieweit assay auf die unspezifische Bindung des Antikörpers kann auftreten und falsch positive Ergebnisse generieren. Diese Kontrolle ist besonders wertvoll für die neu entwickelten Antikörper und kann auch verwendet werden, um Antikörper Spezifität für konservierte Histon Änderungen vor ihrer Verwendung in anderen Systemen zu überprüfen. Dieser Ansatz ergänzt andere Methoden um Antikörperbesonderheit zu testen, die Unterscheidung zwischen den verschiedenen Modifikation Staaten (z. B. Mono-, di- und Tri-Methylierung), einschließlich Sondierung Arrays modifizierte Peptide und westliche Flecken der Histone durchführen oder Nukleosomen mit definierten Modifikationen. Insgesamt ist ChIP in der angehenden Hefe eine leistungsfähige Methode für die Bewertung der Dynamik der Histon PTMs im gesamten Genom und sezieren die Mechanismen ihrer Regulierung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="876">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:301px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:164px;">Y20025-1000.0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Peptone</td>
			<td style="width:301px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:164px;">P20250-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Dextrose</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">BP350-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Glycine</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific</td>
			<td>AC12007-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Tris</td>
			<td style="width:301px;">Amresco</td>
			<td style="width:164px;">0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">NaCl</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:164px;">74385</td>
			<td>Equivalent to NP-40</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">MgCl</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">S25533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:244px;">CaCl2</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:164px;">20899-25G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">LiCl</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">AC413271000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:301px;">Amresco</td>
			<td style="width:164px;">M107-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Sodium Deoxycholate</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:164px;">30970-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Sodium Acetate</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:164px;">S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:244px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">S25533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Yeast protease inhibitor cocktail</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10190-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:301px;">VWR Life Science</td>
			<td>97064-824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Ethanol</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:164px;">E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:301px;">VWR</td>
			<td style="width:164px;">100720-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Micrococcal Nuclease</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Glycogen</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Proteinase K</td>
			<td>Research Products International (RPI)</td>
			<td>P50220-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">RNase A&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#160;Bradford Assay Reagent</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">23238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#160;BSA Standard 2 mg/mL</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td>23210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#945; H4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>04-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#945; H4K16ac</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ABE532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#945; H3</td>
			<td style="width:301px;">Abcam</td>
			<td style="width:164px;">ab1791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#945; H3K4me2</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#160;High Rox qPCR Mix</td>
			<td>Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix</td>
			<td>ACC-PR2000-L-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Protein A/G Magnetic Beads</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td>88803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">magnetic stand for 1.5mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI-21359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Acid-Washed Glass Beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:164px;">G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#160;Microtube Homogenizer</td>
			<td style="width:301px;">Benchmark</td>
			<td>D1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z763837-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Gel loading tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Cuvettes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">50-476-476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Parafilm</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">384-Well PCR Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB-1384W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#160;Gyratory Floor Shaker</td>
			<td style="width:301px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:164px;">Model G10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">ND-2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">&#160;Real-Time PCR Detection System</td>
			<td style="width:301px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:164px;">1855485</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin immunoprecipitation (chip) of histone modifications from saccharomyces cerevisiae

Histon post-translationalen Modifikationen (PTMs), wie Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung, sind dynamisch geregelt durch eine Reihe von Enzymen, die hinzufügen oder entfernen Sie diese Zeichen in Reaktion auf Signale, die von der Zelle. Diese PTMS sind wichtige Mitwirkende bei der Regulierung von Prozessen wie gen-Expressions und DNA zu reparieren. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) ist eine instrumentale Ansatz für sezieren die Fülle und die Lokalisierung von vielen Histon PTMs im gesamten Genom als Reaktion auf verschiedene Störungen in der Zelle gewesen. Hier ist eine vielseitige Methode zur Durchführung von ChIP posttranslational modifizierte Histone aus der angehende Hefe Saccharomyces Cerevisiae (S. Cerevisiae) beschrieben. Diese Methode beruht auf der Vernetzung von Proteinen und DNA mit Formaldehyd Behandlung von Hefekulturen, Generierung von Hefe Lysates durch Wulst schlagen, Solubilisierung der Chromatin-Fragmente von micrococcal Nuklease und Immunopräzipitation der Histon-DNA -komplexe. DNA, verbunden mit dem Histon-Zeichen von Interesse ist gereinigt und quantitative PCR-Analysen, seine Anreicherung an mehrere Loci während des Genoms zu bewerten unterzogen. Repräsentative Experimente sondieren die Lokalisierung der Histon-Marken H3K4me2 und H4K16ac in Wildtyp und Mutanten Hefe werden diskutiert, um Datenanalyse und Interpretation zu demonstrieren. Diese Methode eignet sich für eine Vielzahl von Histon PTMs und kann mit verschiedenen mutierte Stämme oder in Gegenwart von verschiedenen Umweltbelastungen, so dass es ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Untersuchung von Veränderungen in der Chromatin-Dynamik unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt werden.

Ein wesentlicher Bestandteil dieses Protokolls wird die Konzentration der micrococcal Nuklease (MNase) verwendet, um das Chromatin in lösliche Fragmente zu verdauen, wie in Schritt 10 beschrieben optimiert. Dies ist wichtig für den Erhalt der hochauflösenden Daten über die Verteilung der Histon-Modifikationen an genomischen Regionen von Interesse. Ein MNase Titration sollte durchgeführt werden, um festzustellen, die am besten geeignete Konzentration in erster Linie Mono-Nukleosomen m...

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Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Histon-Modifikationen von Saccharomyces cerevisiae

Hier beschreiben wir ein Protokoll für Chromatin Immunopräzipitation der geänderten Histone aus der angehende Hefe Saccharomyces Cerevisiae. Immunoprecipitated DNA wird anschließend für die quantitative PCR verwendet, um die Fülle und die Lokalisierung von Histon post-translationalen Modifikationen während des Genoms zu befragen.

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

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Genetics

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Unit 1

DNA and Chromosome Structure

SCIENTISTS IN ACTION

12.6K Aufrufe.  University of Maryland. Hier beschreiben wir ein Protokoll für Chromatin Immunopräzipitation der geänderten Histone aus der angehende Hefe Saccharomyces Cerevisiae. Immunoprecipitated DNA wird anschließend für die quantitative PCR verwendet, um die Fülle und die Lokalisierung von Histon post-translationalen Modifikationen während des Genoms zu befragen.

Serie: Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

Analyse des c-KIT-Liganden-Promotors unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Forschung

Genetik

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) in Maus-T-Zell-Linien

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Erzeugung von nativen Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Bibliotheken für Nukleosom Dichteanalyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Protokoll für Low-Fülle embryonalen Proben

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae Beschriftung mit 4-Thiouracil und Quantifizierung der metabolischen synthetisiert neu mRNA als Proxy für RNA-Polymerase II Aktivität

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

Chromatin Immunopräzipitation der murinen braunen Fettgewebe

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

Chromatin Immunoprecipitation Assay mit Mikrokokken-Nukleasen in Säugetierzellen

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription factors, histone modifications, and other DNA-associated proteins. ChIP-seq data can also be used to find differential binding of transcription factors in different environmental conditions or cell types. Initially, ChIP was performed through hybridization on a microarray (ChIP-chip); however, ChIP-seq has become the preferred method through technological advancements, decreasing financial barriers to sequencing, and massive amounts of high-quality data output. Techniques of performing ChIP-seq with bacterial biofilms, a major source of persistent and chronic infections, are described in this protocol. ChIP-seq is performed on Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm and planktonic cells, targeting the master biofilm regulator, CsgD, to determine differential binding in the two cell types. Here, we demonstrate the appropriate amount of biofilm to harvest, normalizing to a planktonic control sample, homogenizing biofilm for cross-linker access, and performing routine ChIP-seq steps to obtain high quality sequencing results.

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

Chromatin immunoprecipitation coupled with next-generation sequencing (ChIP-seq) is a method used to establish interactions between transcription factors and the genomic sequences they control. This protocol outlines techniques for performing ChIP-seq with bacterial biofilms, using Salmonella enterica serovar Typhimurium bacterial biofilm as an example.

Entdeckung von CsgD-Regulierungszielen im Salmonellen-Biofilm mit Chromatin-Immunpräzipitation und Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing (ChIP-seq) is widely used to identify genome-wide binding locations of DNA-binding proteins. However, the ChIP-seq method is limited by its heterogeneity in length of sonicated DNA fragments and non-specific background DNA, resulting in low mapping resolution and uncertainty in DNA-binding sites. To overcome these limitations, the combination of ChIP with exonuclease digestion (ChIP-exo) utilizes 5&#8217; to 3&#8217; exonuclease digestion to trim the heterogeneously sized immunoprecipitated DNA to the protein-DNA crosslinking site. Exonuclease treatment also eliminates non-specific background DNA. The library-prepared and exonuclease-digested DNA can be sent for high-throughput sequencing. The ChIP-exo method allows for near base-pair mapping resolution with greater detection sensitivity and reduced background signal. An optimized ChIP-exo protocol for mammalian cells and next-generation sequencing is described below.

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Precise determination of protein-binding locations across the genome is important for understanding gene regulation. Here we describe a&#160;genomic mapping method that treats chromatin-immunoprecipitated DNA with exonuclease digestion (ChIP-exo) followed by high-throughput sequencing. This method detects protein-DNA interactions with near base-pair mapping resolution and high signal-to-noise ratio in mammalian neurons.

Hochauflösende Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in Mausstammzell-abgeleiteten Neuronen mit Chromatin-Immunpräzipitation-Exonuklease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...