Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des NIH (5T32GM008275-22) und ein American Heart Association Promotionsstipendium (EAS) unterstützt, ein Chemie-Biologie-Schnittstelle Stipendium der NIH (2T32GM071339-06A1) (zu MED) und Zuschüsse aus dem NIH (1DP2OD002177-01 und NS067354-0110), Die Ellison Medical Foundation und The Bill and Melinda Gates Foundation (JS).

1. Expression von Hsp104 <ol><li> Das Plasmid für die Reinigung in E. beschäftigt coli, pPROEX-HTB-Hsp104 enthält die Hsp104 offene Leserahmen unter der induzierbaren Kontrolle des trc-Promotors 26. Das Plasmid produziert Hsp104 mit einem N-terminalen His 6-Tag, das durch TEV-Protease-Spaltung entfernt werden können. Transform pPROEX-HTB-Hsp104 in Codon-optimierten E. coli BL21-CodonPlus-RIL Zellen (Stratagene, Agilent Technologies) mit einer typischen bakteriellen Transformation Verfahren (zB nach den Anweisungen des Herstellers). Es ist wichtig, um eine Codon-optimierten E. Benutzung coli-Stamm, weil Hsp104 hat eine ungewöhnliche Codon Bias. </li><li> Impfen einen 100 2xYT Kultur (USB. Rezept: 16g / L Caseinpepton, 10 g / L Hefeextrakt, 5 g / L NaCl, pH 7,0) mit 100μg/mL Ampicillin und Chloramphenicol 34μg/mL mit frischen Transformanten ergänzt und wachsen Nacht bei 37 ° C unter Schütteln bei 200rpm. </li><li> Impfen 10mL der Übernacht-Kultur in 6 X 1L 2xYT mit 100μg/mL Ampicillin und Chloramphenicol 34μg/mL in 2L Flaschen. Schütteln bei 250rpm bei 37 ° C bis OD 600 = 0,4-0,6. Aufhören zu zittern und Absenken der Temperaturen auf 15 ° C. Lassen Zellen äquilibrieren unaufgeregt für 30min in den Brutkasten, bis es 15 ° C erreicht Sobald 15 ° C erreicht ist induzieren Proteinexpression durch Zugabe von IPTG zu einer Endkonzentration von 1 mM. Fortsetzen Schütteln bei 250rpm über Nacht (12-16 Stunden). </li></ol> 2. Zellernte und Lyse <ol><li> Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation (in einem vorgekühlten Rotor) bei 4.000 min für 20 Minuten bei 4 ° C (wir verwenden einen Sorvall RC 3BP + Zentrifuge). Nachfolgende Schritte müssen sofort ausgeführt werden, da Hsp104 Aktivität ist vermindert, wenn E. coli-Zellen werden eingefroren. Darüber hinaus sollten alle nachfolgenden Schritte auf Eis oder bei 4 ° C durchgeführt werden </li><li> Resuspendieren Zellpellets in vorgekühlte (auf Eis) 10 ml Lysepuffer (40 mM HEPES-KOH pH 7,4, 500 mM KCl, 20 mM MgCl 2, 2,5% (w / v) Glycerin, 20 mM Imidazol, 5 &amp;mgr; M Pepstatin A, komplette Protease-Inhibitor-Cocktail (1 EDTA -freie tablet/50mL) und 2mM β-Mercaptoethanol). </li><li> Lyse-Zellen mit einem Französisch drücken (Emulsiflex) Homogenisator, dass ein Wärmetauscher in Eiswasser getaucht verwendet. Vor dem Gebrauch sicherstellen, dass alle Zellklumpen wurden gelöst. Nach Gleichgewichtseinstellung Homogenisator mit Lysepuffer, ist zwei Durchgängen durch den Zylinder mit einem Druck von 15.000-18.000 psi ausreichend für die vollständige Lyse. Wenn ein Französisch Presse ist nicht vorhanden, kann der Inkubation mit Lysozym mit anschließender Ultraschallbehandlung verwendet werden (siehe Diskussion) werden. Speichern Sie eine kleine Auswahl von lysierten Zellen für die SDS-PAGE-Analyse (1μL) (Lysate in Abb. 2).. </li><li> Entfernen Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 16.000 rpm für 20 Minuten bei 4 ° C (wir verwenden einen Sorvall RC5C + centifuge). Bewahren Überstand für den nächsten Schritt, und speichern Sie eine kleine Probe (1μL) der Überstand für die SDS-PAGE-Analyse (Ni Laden in Abb. 2).. </li></ol> 3. Hsp104 Purification <ol><li> Mix Überstand aus Schritt 2.4 mit 12ml (2 ml Ni-Sepharose Kügelchen pro 1L von Zellen) von 50% Gülle Lysepuffer äquilibrierte Ni-Sepharose-Beads (GE). </li><li> Drehen Probe langsam für 3 Stunden bei 4 ° C, so dass Ni-Sepharose gleichmäßig suspendiert und Schaumbildung auf ein Minimum reduziert bleibt. Kürzere Inkubationszeiten sind möglich, aber Ausbeute verringern. Bei 4 ° C in Gegenwart von Protease-Inhibitoren, kommt wenig Abbau und eine 3-stündige Ni-Sepharose Inkubationszeit nicht verringert Aktivität des Endprodukts. Sammeln Ni-Sepharose durch Zentrifugation für 2 min bei 4 ° C bei 2.000 rpm (Eppendorf 5810R-Zentrifuge). Speichern Sie eine kleine Auswahl der Überstand für die SDS-PAGE-Analyse (1μL) und entsorgen Sie den Rest (Ni Flow-Through (FT) in Abb. 2).. </li><li> Waschen Sie die abgerufenen Ni-Sepharose mit 25 Säulenvolumen Waschpuffer (40 mM HEPES-KOH pH 7,4, 150 mM KCl, 20 mM MgCl 2, 2,5% (w / v) Glycerin, 20 mM Imidazol, 2 mM β-Mercaptoethanol), 5 Säulenvolumen Waschpuffer mit 1 M KCl, um Verunreinigungen elektrostatisch auf Hsp104 gebunden, und 25 Säulenvolumen Waschpuffer zu entfernen. Sammeln Ni-Sepharose nach jedem Waschen durch Zentrifugation für 2 min bei 4 ° C bei 2.000 rpm (Eppendorf 5810R-Zentrifuge). Nach jedem Waschen und Zentrifugation Zyklus, zu entfernen Puffer durch Aspiration. </li><li> Um Hsp104, mischen Ni-Sepharose mit 1 ml Elutionspuffer (40 mM HEPES-KOH pH 7,4, 150 mM KCl, 20 mM MgCl 2, 2,5% (w / v) Glycerin, 350mm Imidazol, 2 mM β-Mercaptoethanol) pro 1 ml Ni-Sepharose und eluieren Drehen bei 4 ° C für 20 Minuten. Die hohe Imidazol-Konzentration stört das Ni bead-His 6-Interaktion. Nehmen Sie Ni-Sepharose mit leeren 1,2 ml Spin-Säulen (Bio-Rad) durch Zentrifugation für 2 min bei 4 ° C bei 2.000 rpm (Eppendorf 5810R-Zentrifuge). Speichern 1μL Eluat für SDS-PAGE-Analyse (Ni-Eluat in Abb. 2).. Für jeden Liter-Zellen, ist ~ 15 mg Hsp104 bei diesem Schritt erhalten. </li><li> Buffer Austausch Eluat in Buffer Q (20 mM Tris-HCl pH 8, 0,5 mM EDTA, 5 mM MgCl 2, 50mM NaCl) mit MWCO 30.000 Amicon Ultra (Millipore) 15mL Zentrifugenkonzentrator Einheiten. Zunächst konzentrieren Protein ~ 1.5ml fügen Sie dann 14.5mL von Buffer Q-Protein 10-fach verdünnt. Wiederholen Sie die 3-mal für Puffer auszutauschen. Der erhöhte pH-Wert und salzarme sorgt dafür, dass Hsp104 eine hohe negative Ladung hat. </li><li> Purify Hsp104 über Anionenaustauschchromatographie mit einem Buffer Q äquilibriert Resource Q 6mL Spalte (GE). Vor der Injektion wird das Protein durch eine geringe Proteinbindung Millex GP PES Membrane 0,22 &amp;mgr; m Spritzenfilter (Millipore) filtriert. Wir beschäftigen eine Durchflussrate von 1ml/min. Wegspülen schwach bindende Proteine ​​mit 1 Säulenvolumen 20% Puffer Q + (20 mM Tris-HCl pH 8, 0,5 mM EDTA, 5 mM MgCl 2, 1 M NaCl). Eluieren Hsp104 mit linearen Gradienten (20% -50% Puffer Q +) über 5 Säulenvolumen (Abb. 3). Sammeln Sie 1 ml Fraktionen. Hsp104 und die meisten Varianten in der Regel bei ~ 400mm NaCl (31mS/cm) eluieren. Speichern Proben von Peak-Fraktionen (1μL) für die SDS-PAGE-Analyse (Abb. 3, Einschub). </li><li> Um His 6-Tag zu entfernen, Austausch-Protein mit dem Amicon Zentrifugenkonzentrator wie oben beschrieben (siehe Schritt 3.5) in Spaltpuffer (20 mM HEPES-KOH pH 7,4, 140mm KCl und 10 mM MgCl 2). Verwenden Sie Protev Protease (Promega) oder AcTEV Protease (Invitrogen) nach Herstellerangaben. Für Hsp104, haben wir festgestellt, dass höhere Verhältnisse von TEV-Protease: Hsp104 für die vollständige Spaltung erforderlich sind. Wir verwenden ein Verhältnis von 1-Protease-Einheit pro 12μg Hsp104. Die Spaltung sollte bei 30 ° C für 2-4 Stunden durchgeführt werden, gefolgt von einer 16-stündigen Inkubation bei 4 ° C. Finale Hsp104 Konzentration sollte zwischen 20-75 um Monomer sein. Führen die verbleibenden His6-markierten Hsp104 und TEV-Protease mit Ni-Sepharose (GE), indem Ni-Sepharose über die Höhe der Hsp104 in der Spaltungsreaktion (unter der Annahme Perlen binden können 15mg Protein pro ml verpackt Harz). Entfernen Perlen mit leeren Spin-Säulen (Bio-Rad) durch Zentrifugation für 2 min bei 2.000 rpm bei 4 ° C. Proben werden vor und nach der Spaltung (1μL) für die SDS-PAGE-Analyse zur Spaltung, und die Beseitigung von ungespaltenen Protein (Abb. 4) zu gewährleisten. </li><li> Exchange in Size Exclusion-Puffer (20 mM HEPES-KOH pH 7,4, 140mm KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT) mit MWCO 30.000 Amicon Ultra (Millipore) wie in Schritt 3.5 beschrieben. </li><li> Weiter zu reinigen Hsp104 über Größenausschlusschromatographie. Verwenden Sie Größenausschlusschromatographie Puffer äquilibriert Superose 6 oder Superdex 200-Säule (beide GE) (Abb. 5). Vor der Injektion wird das Protein durch eine geringe Proteinbindung Millex GP PES Membrane 0,22 &amp;mgr; m Spritzenfilter (Millipore) filtriert. Für weniger als 10 mg Protein, kann die Größe 10/300 Spalten (24ml) verwendet werden und 0,5 ml Fraktionen gesammelt. Für Proben mit mehr als 10mg, sollte die Größe 12/60 Säule (120 ml) verwendet werden und 1 ml Fraktionen gesammelt. Siehe Anweisungen des Herstellers für Flussraten und Probenmengen geladen werden. Nach der Reinigung werden Hsp104 Fraktionen gepoolt, wie in Abb. gezeigt. 5 und in Amicon Zentrifugenkonzentrator Units (Millipore) konzentriert. Hsp104 gespeichert ist, wie unten beschrieben. Durch den Verlust von Material zu trennen Hsp104 Abbauprodukten und Verunreinigungen die endgültige Ausbeute an gereinigtem full-length Hsp104 ist ~ 1-3mg pro Liter ab Kultur. </li></ol> 4. Hsp104 Disaggregase Activity <ol><li> Nach der Reinigung ist es gute Praxis, Hsp104 Aktivität in einer Disaggregation Assay zu beurteilen. Normalerweise beschäftigen wir eine Luciferase Assay Reaktivierung 2 (Abb. 6). In diesem Test Hsp104 in Verbindung mit dem Hsp70-Chaperon-System (Hsp70 und Hsp40) disaggregiert Harnstoff-denaturierter Glühwürmchenluciferase Aggregate 2. Löslich Luciferase katalysiert die Oxidation von Luciferin zu Oxyluciferin, eine Reaktion, die Licht-Releases. Durch die Überwachung der Lumineszenz, die relative Reaktivierung und damit Disaggregation kann der Luziferase bestimmt werden. Hsp104 Lage sein muss, synergistisch mit dem Hsp70 Co-Chaperon-Systems zusammenarbeiten. Die Menge der verwerteten Lumineszenz hängt von der genauen Hsp70: Hsp40-Paar verwendet. Wir setzen routinemäßig Hsp72 und Hsp40 (Assay Designs). Zumindest sollten aktive Hsp104 produzieren eine 5-fache Steigerung der Reaktivierung von Luciferase, wenn die Reaktivierung von Hsp72 Vergleich: Hsp40 allein (Abb. 6). Hsp104 Zubereitungen, die dieses Maß an Aktivität nicht erreichen, werden verworfen. </li></ol> 5. Hsp104 Lagerung <ol><li> Für kurzfristige Lagerung kann Hsp104 bei 4 ° C in der Ausschluss-Puffer gehalten werden. Allerdings wird Aktivität nach 2-3 Tagen bei 4 ° C sinken und scharf nach 1 Woche bei 4 ° C. Für Disaggregation Assays empfehlen wir, dass Hsp104 so bald wie möglich sollte nach der Reinigung verwendet werden. Idealerweise sollte Hsp104 sofort für Amyloid Disaggregation Assays verwendet werden. </li><li> Wenn Eiweiß muss langfristig aufbewahrt werden, ist Hsp104 Einlagerung Puffer (20 mM HEPES-KOH pH 7,4, 140mm KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% Glycerin (w / v)) ausgetauscht. 100 &amp;mgr; l Aliquots in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C. Frost-Tau-Zyklen drastisch reduzieren Hsp104 Aktivitätund sollte vermieden werden. Wir empfehlen langsam auftauen Hsp104 auf Eis. Amyloid-disaggregase Aktivität wird stark zurückgehen nach 1 Monat bei -80 ° C. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse und Fakten: <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Hsp104 ist ein bifunktionelles disaggregase. Disaggregation der ungeordnete Aggregate (siehe links) erfordert die Zusammenarbeit der Hsp70-Chaperon-System (Hsp70 und Hsp40) 2. Hsp104 umbaut bestellt Amyloidaggregaten (siehe rechts) ohne die Hilfe von Hsp70 und Hsp40 in vitro, sondern Hsp70 und Hsp40 kann Hsp104 Aktivität gegen Amyloid 26,28 zu verbessern. Für beide Arten der aggregierten Strukturen, Hsp104 Paare ATP-Hydrolyse, um Substrat Translokation durch seine zentrale Kanal Disaggregation zu fördern. Tyrosin-tragenden Pore Schleifen engagieren und Shuttle-Substrat durch den zentralen Kanal 49-52. <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. SDS-PAGE-Analyse von Ni-Sepharose Affinitätsreinigung Schritt. Lysate, Ni Load, Ni FT und Ni-Eluat-Proben wurden durch SDS-PAGE mit einem 4-20% Tris-HCl 1,0 Criterion-Gel (Bio-Rad) und Coomassie gefärbt . Beachten Sie, dass nicht alle Hsp104 kann in die Ni-Sepharose binden. Broad Range Molekulargewichtsmarker (Bio-Rad) angezeigt werden (linke Spur). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Resource Q Reinigung von Ni-Sepharose-Eluat. Blaue Kurve stellt die Absorption bei 280nm und grüne Kurve stellt% Puffer Q + (Maximum bei 50%). Der erste Peak, der bei 20% eluiert Q + enthält Verunreinigungen, Abbauprodukte und falsch gefalteten Hsp104. Die zweite und Hauptpeak enthält korrekt gefaltet und aktiv Hsp104. Die Fließgeschwindigkeit betrug 1ml/min. Gradient von 20 bis 50% Q + 30 Minuten oder 5 Säulenvolumen. Kleines Bild: Peak-Fraktionen werden durch SDS-PAGE-Analyse mit einem 4-20% Tris-HCl 1,0 Criterion-Gel (Bio-Rad) und Coomassie gefärbt aufgelöst. Broad Range Molekulargewichtsmarker (Bio-Rad) angezeigt (links). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. SDS-PAGE-Analyse von Protev Proteaseschnittstelle Schritt. His 6-Hsp104 von Resource Q Reinigung wurde mit Protev Protease 4 Stunden bei 30 ° C und dann 16 Stunden bei 4 ° C behandelt Die Proben wurden die durch SDS-PAGE mit einem 4-20% Tris-HCl 1,0 Criterion-Gel (Bio-Rad) und Coomassie gefärbt. Beachten Sie, dass Protev gespalten Hsp104 schneller wandert. TEV-Protease und ungespaltenen Hsp104 haben mit Ni-Sepharose erschöpft wie in Schritt 3.7 beschrieben. Broad Range Molekulargewichtsmarker (Bio-Rad) angezeigt (links). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig5.jpg" alt="Abbildung 5"/> Abbildung 5. Ausschluss-Reinigung von Hsp104. Cleaved Hsp104 weiteren wurde über eine Superose 6 Gelfiltrationssäule (10/300, GE) gereinigt. Durchfluss = 0.4ml/min. Der Gipfel zwischen den gestrichelten Linien stellt gepoolten Fraktionen. Kleines Bild: Peak-Fraktionen werden durch SDS-PAGE-Analyse mit einem 4-20% Tris-HCl 1,0 Criterion-Gel (Bio-Rad) und Coomassie gefärbt aufgelöst. Broad Range Molekulargewichtsmarker (Bio-Rad) angezeigt (links). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig6.jpg" alt="Abbildung 6"/> Abbildung 6. Luciferase-Assay Reaktivierung. Vergällt Glühwürmchenluciferase Aggregate (50nm) wurden entweder mit Hsp72 und Hsp40 (1 &amp;mgr; M) (beide von Assay Designs), Hsp104 (6μM Monomer) oder Hsp104, Hsp72 und Hsp40 für 90min bei 25 ° C inkubiert Denaturierten Luciferase ist nur dann voll in der Anwesenheit beider Hsp104 und Hsp40/Hsp72 reaktiviert. Recovered Lumineszenz basiert auf einem Infinite M1000-Reader (Tecan) gemessen. Die Werte stellen Mittelwerte ± SEM (n = 3).

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Timeline: Für maximal Hsp104 Aktivität empfehlen wir, dass die gesamte Reinigungsschema so schnell wie möglich abgeschlossen werden. Allerdings macht die Zahl der Reinigungsschritte ein anspruchsvoller Zeitplan, der vielleicht nicht immer praktisch. Wenn die Reinigung Schritte werden so schnell wie möglich durchgeführt werden, die Zeit zwischen dem Ende der Nacht Ausdruck durch die 2-4 Stunden Inkubation bei 30 ° C mit TEV-Protease beträgt ca. 9-11 Stunden. Ein möglicher Ort zum Verweilen ist nach der TEV...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> BL21-CodonPlus-RIL kompetenter Zellen </td><td> Stratagene, Agilent Technologies </td><td> 230255 </td></tr><tr><td> 2xYT Brühe </td><td> USB </td><td> 75864 </td></tr><tr><td> Complete, Mini, EDTA-free Protease-Inhibitor Tabletten </td><td> Roche </td><td> 1836170 </td></tr><tr><td> Pepstatin A </td><td> Sigma </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> Ni-Sepharose 6 Fast Flow </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5318-02 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 Zentrifugalfilter Einheiten (MWCO 30.000) </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> Resource Q - 6ml Spalte </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1179-01 </td></tr><tr><td> Protev Protease </td><td> Promega </td><td> V6052 </td></tr><tr><td> AcTEV Protease </td><td> Invitrogen </td><td> 12575015 </td></tr><tr><td> Superose 6 10 / 300 GL </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5172-01 </td></tr><tr><td> Hsp40 </td><td> Assay Designs </td><td> SPP-400 </td></tr><tr><td> Hsp72 </td><td> Assay Designs </td><td> ADI-NSP-555 </td></tr></tbody></table>

purification of hsp104, a protein disaggregase

Hsp104 ist ein hexameren AAA + protein 1 aus Hefe, die Paare ATP-Hydrolyse, um Protein Aufschlüsselung 2-10 (Abb. 1). Diese Aktivität vermittelt zwei wichtige selektive Vorteile. Erstens ermöglicht Renaturierung ungeordnete Aggregate von Hsp104 Hefe Überleben nach verschiedenen Protein-Fehlfaltung betont, einschließlich Hitzeschock 3,5,11,12. Zweitens ermöglicht die Umgestaltung des Cross-Beta-Amyloid-Fibrillen durch Hsp104 Hefe unzähligen Prionen (infektiöse Amyloide) als ein Reservoir von Vorteil zu nutzen und vererbbare phänotypische Variation 13-22. Bemerkenswert ist, dass Hsp104 direkt umbaut preamyloid Oligomere und Amyloidfibrillen, einschließlich derjenigen der Hefe Prion-Proteine ​​Sup35 und Ure2 23-30 zusammen. Das Amyloid-Umbau-Funktionalität ist ein spezialisierter Facette der Hefe Hsp104. Die E. coli Ortholog, ClpB, nicht umgestalten preamyloid Oligomere oder Amyloid-Fibrillen 26,31,32. Hsp104 Orthologe sind in allen Reichen des Lebens außer, verblüffend, Tiere gefunden. In der Tat, ob tierische Zellen keine enzymatische System besitzen, dass Paare Protein Aufschlüsselung nach Renaturierung (statt Abbau) bleibt unbekannt 33-35. So haben wir und andere vorgeschlagen, dass Hsp104 als Therapeutikum für verschiedene neurodegenerative Erkrankungen, die mit der Fehlfaltung von spezifischen Proteinen in toxische preamyloid Oligomere und Amyloidfibrillen 4,7,23,36-38 verbunden entwickelt werden könnten. Es gibt keine Behandlungen, die direkt auf den aggregierten Spezies mit diesen Erkrankungen assoziiert. Doch löst sich Hsp104 toxischen Oligomere und Amyloidfibrillen von Alpha-Synuclein, die mit Morbus Parkinson 23 sowie Amyloid Formen von PrP 39 verbunden zusammengesetzt sind. Wichtig ist, reduziert Hsp104 Proteinaggregation und verbessert Neurodegeneration in Nagermodellen der Parkinson-Krankheit 23 und Huntington-Krankheit 38. Idealerweise auf die Therapie zu optimieren und die Nebenwirkungen minimieren, wäre Hsp104 entwickelt und werden verstärkt gezielt umzugestalten spezifische Aggregate von zentraler Bedeutung für die betreffende Krankheit 4,7. Doch die begrenzte strukturelle und mechanistische Verständnis davon, wie Hsp104 disaggregiert ein so vielfältiges Repertoire von aggregierten Strukturen und verwandte Proteine ​​frustriert diese Bemühungen 30,40-42. Um zu verstehen, die Struktur und den Mechanismus der Hsp104, ist es wichtig, die reine Protein-und rekonstruieren ihre disaggregase Aktivität mit minimalen Komponenten zu untersuchen. Hsp104 ist ein 102kDa Protein mit einem pI von ca. 5,3, die in Gegenwart von ADP oder ATP oder bei hohen Proteinkonzentrationen in Abwesenheit von Nukleotid 43-46 hexamerizes. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für die Reinigung von hoch aktiven, stabilen Hsp104 von E. coli. Die Verwendung von E. coli ermöglicht eine vereinfachte Großproduktion und unsere Methode kann schnell und zuverlässig für zahlreiche Hsp104 Varianten durchgeführt werden. Unser Protokoll erhöht Hsp104 Reinheit und vereinfacht His 6-tag Entfernung im Vergleich zu einer früheren Reinigungsverfahren aus E. coli 47. Darüber hinaus ist unser Protokoll mehr einfache und bequemer als zwei neuere Protokolle 26,48.

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Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Reinigung von hochaktiven Hsp104, ein hexameren AAA +-Protein aus Hefe, die Paare ATP-Hydrolyse, um Protein Disaggregation. Dieses Schema nutzt eine His6-markierten Konstruktes zur Affinitätsreinigung von<em&gt; E. coli</em&gt; Durch Anionenaustausch-Chromatographie, His6-tag-Entfernung mit TEV-Protease und Größenausschlusschromatographie gefolgt.

Reinigung von Hsp104, ein Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

purification-of-hsp104-a-protein-disaggregase

Research

JoVE Journal

Biology

17.3K Aufrufe.  University of Pennsylvania. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Reinigung von hochaktiven Hsp104, ein hexameren AAA +-Protein aus Hefe, die Paare ATP-Hydrolyse, um Protein Disaggregation. Dieses Schema nutzt eine His6-markierten Konstruktes zur Affinitätsreinigung von E. coli Durch Anionenaustausch-Chromatographie, His6-tag-Entfernung mit TEV-Protease und Größenausschlusschromatographie gefolgt.

Serie: Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Forschung

Biologie

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Die Reinigung des M. magneticum Stamm AMB-1 Magnetosom assoziierten Protein MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated anti-cancer drugs or antibiotics, is a current serious problem in public health. This multidrug resistance is largely due to energy-dependent drug efflux pumps. The pumps expel anti-cancer drugs or antibiotics into the external medium, lowering their intracellular concentration below a toxic threshold. We are studying multidrug resistance in Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic bacterial pathogen that causes infections in patients with many types of injuries or illness, for example, burns or cystic fibrosis, and also in immuno-compromised cancer, dialysis, and transplantation patients. The major MDR efflux pumps in P. aeruginosa are tripartite complexes comprised of an inner membrane proton-drug antiporter (RND), an outer membrane channel (OMF), and a periplasmic linker protein (MFP) 1-8. The RND and OMF proteins are transmembrane proteins. Transmembrane proteins make up more than 30% of all proteins and are 65% of current drug targets. The hydrophobic transmembrane domains make the proteins insoluble in aqueous buffer. Before a transmembrane protein can be purified, it is necessary to find buffer conditions containing a mild detergent that enable the protein to be solubilized as a protein detergent complex (PDC) 9-11. In this example, we use an RND protein, the P. aeruginosa MexB transmembrane transporter, to demonstrate how to express a recombinant form of a transmembrane protein, solubilize it using detergents, and then purify the protein detergent complexes. This general method can be applied to the expression, purification, and solubilization of many other recombinantly expressed membrane proteins. The protein detergent complexes can later be used for biochemical or biophysical characterization including X-ray crystal structure determination or crosslinking studies.

In this protocol we demonstrate the expression, solubilization, and purification of a recombinantly expressed membrane protein, MexB, as a soluble protein detergent complex. MexB is a multidrug resistance membrane transporter from the opportunistic bacterial pathogen Pseudomonas aeruginosa.

Expression, Waschmittel Solubilisierung und Reinigung von einer Membran Transporter, der MexB Multidrug Resistance Protein

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction chromatography (HIC) commonly requires experimental determination (referred to as screening or "scouting") in order to select the most suitable chromatographic medium for purifying a given protein 1. The method presented here describes an automated approach to scouting for an optimal HIC media to be used in protein purification.
HIC separates proteins and other biomolecules from a crude lysate based on differences in hydrophobicity. Similar to affinity chromatography (AC) and ion exchange chromatography (IEX), HIC is capable of concentrating the protein of interest as it progresses through the chromatographic process. Proteins best suited for purification by HIC include those with hydrophobic surface regions and able to withstand exposure to salt concentrations in excess of 2 M ammonium sulfate ((NH4)2SO4). HIC is often chosen as a purification method for proteins lacking an affinity tag, and thus unsuitable for AC, and when IEX fails to provide adequate purification. Hydrophobic moieties on the protein surface temporarily bind to a nonpolar ligand coupled to an inert, immobile matrix. The interaction between protein and ligand are highly dependent on the salt concentration of the buffer flowing through the chromatography column, with high ionic concentrations strengthening the protein-ligand interaction and making the protein immobile (i.e. bound inside the column) 2. As salt concentrations decrease, the protein-ligand interaction dissipates, the protein again becomes mobile and elutes from the column. Several HIC media are commercially available in pre-packed columns, each containing one of several hydrophobic ligands (e.g. S-butyl, butyl, octyl, and phenyl) cross-linked at varying densities to agarose beads of a specific diameter 3. Automated column scouting allows for an efficient approach for determining which HIC media should be employed for future, more exhaustive optimization experiments and protein purification runs 4.
The specific protein being purified here is recombinant green fluorescent protein (GFP); however, the approach may be adapted for purifying other proteins with one or more hydrophobic surface regions. GFP serves as a useful model protein, due to its stability, unique light absorbance peak at 397 nm, and fluorescence when exposed to UV light 5. Bacterial lysate containing wild type GFP was prepared in a high-salt buffer, loaded into a Bio-Rad DuoFlow medium pressure liquid chromatography system, and adsorbed to HiTrap HIC columns containing different HIC media. The protein was eluted from the columns and analyzed by in-line and post-run detection methods. Buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection increased the functionality of the system and reproducibility of the experimental approach.

An automated method for identifying suitable hydrophobic interaction chromatography (HIC) media to be used in the process of protein purification is presented. The method utilizes a medium-pressure liquid chromatography system including automated buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection.

Automatisierte Hydrophobe Interaktions-Chromatographie Spaltenauswahl für den Einsatz in Protein Purification

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

Chromatographische Reinigung von hoch aktiven Hefe Ribosomen

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases Alzheimer's disease (A&beta;, tau), Parkinson's Disease (&alpha;-synuclein), Huntington's disease (polyglutamine, huntingtin), and others. Protein aggregation is thought to occur due to disturbed proteostasis, i.e. the imbalance between the arising and degradation of misfolded proteins. Of note, the same proteins are found aggregated in sporadic forms of these diseases that are mutant in rare variants of familial forms.
Schizophrenia is a chronic progressive brain condition that in many cases goes along with a permanent and irreversible cognitive deficit. In a candidate gene approach, we investigated whether Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), a gene cloned in a Scottish family with linkage to chronic mental disease1, 2, could be found as insoluble aggregates in the brain of sporadic cases of schizophrenia3. Using the SMRI CC, we identified in approximately 20 % of cases with CMD but not normal controls or patients with neurodegenerative diseases sarkosyl-insoluble DISC1 immunoreactivity after biochemical fractionation. Subsequent studies in vitro revealed that the aggregation propensity of DISC1 was influenced by disease-associated polymorphism S704C4, and that DISC1 aggresomes generated in vitro were cell-invasive5, similar to what had been shown for A&beta;6, tau7-9, &alpha;-synuclein10, polyglutamine11, or SOD1 aggregates12. These findings prompted us to propose that at least a subset of cases with CMD, those with aggregated DISC1 might be protein conformational disorders.
 Here we describe how we generate DISC1 aggresomes in mammalian cells, purify them on a sucrose gradient and use them for cell-invasiveness studies. Similarly, we describe how we generate an exclusively multimeric C-terminal DISC1 fragment, label and purify it for cell invasiveness studies. Using the recombinant multimers of DISC1 we achieve similar cell invasiveness as for a similarly labeled synthetic &alpha;-synuclein fragment. We also show that this fragment is taken up in vivo when stereotactically injected into the brain of recipient animals.

The generation, purification and cell invasion of intracellular, cytoplasmic full length DISC1 protein aggresomes from cell cultures and of a labeled, multimeric recombinant DISC1 protein fragment in E. coli are described. Cell invasiveness is shown for recipient cells in cell culture and for neurons in vivo after stereotactical brain inoculation.

Generation, Reinigung und Charakterisierung von Cell-invasive DISC1 Protein Spezies

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads von Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...