Der Workflow besteht darin, Zellen unter streng kontrollierten Umgebungsbedingungen zu züchten, sie mit Schmelzwasser / Eis schnell zu kühlen und mit voroptimierter Konzentration von Formaldehyd und Inkubationszeit zu fixieren. Die Fixierungsreaktion wird dann unter Verwendung eines Überschusses an primären Aminogruppen-haltigen Verbindungen wie Glycin oder Tryps abgeschreckt. Zellen werden gesammelt, gewaschen und können gefroren gelagert werden.
Fixierte Zellen können mechanisch oder chemisch lysiert werden, und das Lysat wird zur Trennung der ribosomalen Fraktionen basierend auf ihrer Molekülgröße, Sedimentationseigenschaften oder Affinitätsmarkern verwendet. Der Ansatz führt zu einem vielseitigen Material, das für die immununterstützte Reinigung und Detektion sowie die Anreicherung von Komplexen mit spezifischen Faktoren in der Elektronenmikroskopie verwendet werden kann. Bei vernetzter Tiefenblockierung, RNA-Amplifikation oder hybridisierungsbasierten Analysen, RNA-Sequenzierung und Massenspektrometrie werden möglich.
Richten Sie eine Ein-Liter-Hefekultur in einem Orbitalschüttler mit einer optischen Ausgangsdichte von nicht mehr als 0,05 Absorptionseinheiten bei 600 Nanometern ein und verwenden Sie Pepton- und Dextrosemedien bei 30 Grad Celsius. Stellen Sie eine präparative Zentrifuge mit kompatiblem Rotor und Zentrifugenflaschen für die Pelletierung der flüssigen Suspension von Hefezellen bei 5000 G bei vier Grad Celsius auf. Halten Sie die optische Dichte der wachsenden Zellen fest.
Sie muss zum Zeitpunkt der Sammlung zwischen 0,6 und 0,8 Absorptionseinheiten und 600 Nanometern liegen, wenn die exponentielle Wachstumsphase von Interesse ist. Sobald die Zellen fertig sind, stellen Sie eine Eisbox im chemischen Abzug mit einem Bäcker auf, der 250 Gramm sauberes Crushed Water Ice enthält, und zeigen Sie Ihnen auch 25 Milliliter Trypsin und frisch gekaufte Methanol stabilisierte 37% Formaldehydlösung in der Haube. Gießen Sie die eine aktuelle Zellkultur in den Bäcker, der das Eis enthält.
Dann fügen Sie 75 Milliliter 37% Formaldehyd zu einer Endkonzentration von 2,2% Gewicht über volumen intensiv die Mischung um, bis das Eis schmilzt. Sobald das Eis geschmolzen ist, stellen Sie einen Timer für 10 Minuten auf Nach der Inkubation für 10 Minuten, übertragen Sie die Kultur in die vorgekühlten Zentrifugenflaschen und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei vier Grad Celsius, 5000 G für fünf Minuten. Während des Spins ein 50-Milliliter-Röhrchen vorkühlen und frisch vorbereiteten Puffer A mit Glycin aufbewahren, um das verbleibende Formaldehyd auf Eis zu neutralisieren.
Nach dem Zentrifugieren die Zentrifugenröhrchen mit der Pelletseite in Kontakt mit dem Eis auf Eis legen. Bringen Sie die Rohre in den Abzug und entsorgen Sie den Überstand in einem Formaldehyd-Abfallbehälter. Suspendieren Sie das Zellpellet aus alten Rohren in 20 Milliliter Puffer A mit einer 25-Milliliter-Stripette und übertragen Sie es in ein 50-Milliliter-Röhrchen.
Mit Puffer A das Volumen auf 40 Milliliter auffüllen und die Waschzellen durch Zentrifugation von vier Grad Celsius, 5000 G für fünf Minuten sammeln. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet in 40 Milliliter Puffer A eins, der Puffer A ist, der kein Glycin enthält, um Glycinkontamination zu entfernen. Pelletieren Sie die Zellen erneut durch Zentrifugation bei vier Grad Celsius, 5000 G fünf Minuten.
Wiederholen Sie die Wäschen mit Puffer A ein, noch einmal. Entsorgen Sie den Überstand und legen Sie das Zellpellet auf Eis. Wiegen Sie das Röhrchen mit dem Pellet, die Nasszellmasse sollte etwa ein Gramm pro Liter der Zellkultur betragen.
Füllen Sie Polystyrol aus einer mit Aluminiumfolie ausgekleideten Box mit flüssigem Stickstoff bis zu einer Tiefe von etwa drei Zentimetern. 50 Milliliter Rohr aufrecht in die Box legen. Suspendieren Sie das Pellet in 550 Mikrolitern Puffer A zwei durch Pipettieren und Wirbeln für 10 Sekunden.
Fügen Sie 10 Mikroliter à 40 Einheiten pro Mikroliter RNase-Inhibitor hinzu und wirbeln Sie erneut für 10 Sekunden. Tropfen Sie mit einer Pipette von einem Milliliter die Zellsuspension in die 50 Milliliter zwei, die den flüssigen Stickstoff enthalten. Um sich auf den nächsten Schritt vorzubereiten, kühlen Sie 1,5 Milliliter kernfreie Rohre auf Trockeneis und 10 Milliliter Edelstahl-Mahlgläser vor.
Die gefrorenen Zellsuspensionströpfchen mit einem sauberen sterilen Spatel in die Gläser geben. Tauchen Sie die Mahlgläser für eine Minute in flüssigen Stickstoff ein, um sicherzustellen, dass die flüssige Phase über der Verbindung bleibt. Richten Sie eine Kryo-Mischmühle bei 27 Hertz für das Rühren für eine Minute ein.
Rühren Sie die versiegelten Mahlgläser bei 27 Hertz für eine Minute in der Mischermühle. Kühlen Sie die Gläser wie bisher in flüssigem Stickstoff ab und schütteln Sie sie eine Minute weiter. Geben Sie die Gläser zusammen mit den 1,5 Milliliter kernfreien Röhren in die Eisbox mit Trockeneis.
Mit einem kleinen Stahlspatel übertragen Sie die Ergebnisse im gepolsterten Schleifdatum in die Rohre. Dann lagern Sie die Röhren bei minus 80 Grad Celsius. In zwei T175-Kolben wachsen HEK 293-Zellen zu 60 bis 70% Konfluenz und Dalbekos modifiziertes Eagle-Medium und 10% fötales Rinderserum bei 37 Grad und 5% Kohlendioxid.
Ersetzen Sie das Medium des T175-Kolbens mindestens drei Stunden vor der gewünschten Fixierzeit durch exakt 30 Milliliter vorgewärmtes Komplettmedium. Bereiten Sie eine Eisbox bis zum Rand mit zerstoßenem Wassereis vor und bewahren Sie sie zusammen mit den erforderlichen Puffern, ebenfalls einem Eis, im Abzug auf. Um die Zellen zu kühlen, entfernen Sie den T175-Kolben aus dem Inkubator und drücken Sie ihn formell gegen das Eis, um maximalen Oberflächenkontakt zu gewährleisten.
Kippen Sie den Kolben in einem chemischen Abzug auf die Seite, so dass sich das Medium auf der den Zellen gegenüberliegenden Seite sammelt. 168 Mikroliter von 37 Vol.-% Formaldehyd direkt in das gepoolte Medium pipettieren. Ergibt eine Endkonzentration von 0,2% Formaldehyd.
Sofort mischen. Die Kolben für weitere 10 Minuten auf Eis inkubieren. Gießen Sie das Medium in einen geeigneten Abfallbehälter durch die Kolbenseite gegenüber den Zellen.
Mit einem 30 Milliliter Dalbekos phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium- und Magnesiumionen pipettieren und zusätzlich 50 Millimolar Glycin schonend auf der den Zellen gegenüberliegenden Seite enthalten. Mischen Sie durch Schaukeln des Kolbens, bringen Sie den Blitz in die horizontale Position zurück und inkubieren Sie für weitere 10 Minuten auf dem Eis. Gießen Sie die Lösung durch die Kolbenseite gegenüber der Zelle ab und fügen Sie vorsichtig sieben Milliliter der Standard-0,25% Trypsin-EDTA-Lösung hinzu, um die Zellen zu lösen und wieder zu suspendieren.
Den Kolben bei Raumtemperatur fünf, maximal 10 Minuten inkubieren. Positionieren Sie den Kolben senkrecht und mit einer Abisolierung, sammeln Sie die abgetrennten Zellen, indem Sie vorsichtig alle verbleibenden von den Kolbenwänden waschen und die Suspension in ein 50-Milliliter-Rohr auf Eis geben. Die gesammelte Suspensionslösung sofort mit 20 Millilitern kompletter Medien ergänzen und durch vorsichtiges Umdrehen des Röhrchens mischen.
Pelletieren Sie die Zellen, indem Sie das Röhrchen bei 100 G für fünf Minuten und vier Grad Celsius zentrifugieren. Zellpellets müssen gut sichtbar sein. Gießen Sie das Medium ab und suspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 10 Millilitern der phosphatgepufferten Kochsalzlösung von Dalbeko ohne Glycin.
Zentrifugieren Sie das Röhrchen erneut bei 100 G für fünf Minuten und bei vier Grad Celsius Gießen Sie den Waschpuffer ab und suspendieren Sie das Pellet in 800 Mikroliter eiskalter Dalbekos phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Glycin, aber mit Magnesium- und Calciumionen. Übertragen Sie die respondierten Zellen in ein neues proteinarmes 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 100 G für drei Minuten bei vier Grad Celsius.
Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig mit einem Milliliter-Pipetter. In diesem Stadium kann das Zellpellet bei minus 80 Grad Celsius eingefroren werden oder zum Zelllyseschritt übergehen. In einer Biosicherheitswerkbank werden 300 Mikroliter Lysepuffer auf Der Basis von nichtionischem, nicht denaturierendem Reinigungsmittel und sieben Mikroliter Arginaseinhibitor hinzugefügt und durch Pipettieren mit einer Milliliterspitze gut gemischt.
Befestigen Sie vorsichtig eine 25-Gauge-Nadel an einer Ein- bis Drei-Milliliter-Spritze und pipettieren Sie die Mischung kräftig mit mindestens sieben langsamen Aufwärtseinlass- und schnellen Abwärtsauspuffbewegungen nach unten. Entsorgen Sie die Spritze und die Nadel in den Behälter des Scharfen und wiederholen Sie den Vorgang mit einer 31-Gauge-Nadel und einer 0,3-Milliliter-Spritze. Entsorgen Sie die Spritze und die Nadel in den Behälter des Scharfen.
Zentrifugieren Sie die Röhre bei 12.000 G für fünf Minuten bei vier Grad, um die Zelltrümmer zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand in ein neues proteinarmes 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen. Lagern Sie sowohl die Zelltrümmer als auch das Lysat bei minus 80 Grad Celsius.
Translationale Komplexe reagieren empfindlich auf die ionische Zusammensetzung der Puffer. Das Weglassen von Magnesiumchlorid und die Zugabe von EDTA hoben hohe Sedimentationseigenschaften auf, und während Calciumchlorid zu besseren Ergebnisspitzen führte, war die Verbesserung marginal. Wir haben daher Puffer eins ausgewählt.
2,2 Vol.-% Formaldehyd konservierte die Polysomen hervorragend und verringerte die Gesamtausbeute im Vergleich zu 4% Vol.-%-Formaldehyd nicht. In Säugetierzellen wurde eine viel geringere Konzentration von Formaldehyd von 0,2 Vol.-% verwendet. Da höhere Konzentrationen zu erheblichen polyribosomalen Materialverlusten führten.
15 Millimolar EDTA, die dem Lysat und allen nachfolgenden Puffern zugesetzt wurden, zeigten eine deutlich geringere Destabilisierungswirkung auf die polysomalen Fraktionen, die von den fixierten Zellen abgeleitet wurden. Und dieser Effekt wurde teilweise mit 50 Millimolar EDTA mit Material aus 4% fixierten Zellen repliziert, widerstand, entfaltete sich besser. Glukosemangel löst eine der dramatischsten und schnellsten translationalen hemmenden Wirkungen auf Hefe aus.
Sowohl nervenzugesetzte als auch lokal verursachte Bedingungen induzierte Polysom-Demontage war leicht, aber offensichtlich hielten mehr Polysomen in niedrig zugesetzter Glukose zurück. Wichtig ist, dass polysomales Material aus den fixierten Zellen eine hohe Unterscheidung zwischen den ausgehungerten und nicht ausgehungerten Zellen aufweist, was auf die Eignung der Formaldehydfixierung hinweist, um Unterschiede in dynamischen Translationsprozessen zu erhalten. In Ansätzen wie tacy paysake kann es zusätzlich aufschlussreich sein, kleine ribosomale Untereinheiten zu entfernen, die sich nicht gut mit den vollständigen Rhizomen absetzen, für die wir eine zweistufige Ultrazentrifugation verwendet haben, die die Isolierung von SSU, LSU, RS, RNase-resistenten Diazomen, DS und Polysomen höherer Ordnung ermöglicht, die durch Elektronenmikroskopie der festen Fraktionen bestätigt werden.
Im Vergleich zu den nicht fixierten Zellen zeigte material aus den fixierten Zellen eine erhöhte Präsenz von labilem eIF4A in den am schnellsten sedimentierenden ribosomalen Fraktionen. Unter Verwendung von festem Material aus der eIF4A-Tapi-Dehnung zur Erfassung und Anreicherung von eIF4A-haltigen Komplexen mit magnetischen IDG-Kügelchen konnten wir eine selektive Anreicherung des eIF4A im Vergleich zu Beta-Aktin in SSU und RS beobachten, jedoch keine LSU-Fraktionen aus dem zweiten Gradienten bei RNase one-Demontage. Im Vergleich zu anderen Methoden der translationalen Ruhe verspricht die Schnelligkeit der Formaldehydwirkung über Zellmembranen und die wahllose Natur von Vernetzungen die Erhaltung der maximalen Vielfalt von Translationskomplex-Zwischenprodukten.
Unsere Ergebnisse entsprechen der Verwendbarkeit einer schnellen Formaldehydfixierung zur Stabilisierung hochtransienter Komplexe und belegen die Nützlichkeit in Szenarien schneller zellulärer Reaktionen auf Umweltveränderungen oder Stressbedingungen.
