Name: culturing of retinal pigment epithelial cells on an ex vivo model of aged human bruch's membrane
Uploaded: 2018-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
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Diese Forschung stützt sich auf Forschung, um zu verhindern, dass Blindheit, New York, www.rpbusa.org und die Greater New York Center für Retinal Degenerative Krankheit Stiftung Fighting Blindness, www.blindness.org. Die Autoren möchten Luanna Bartholomew, Ph.d., danke für ihre kritische Überprüfung dieses Manuskriptes.

Das folgende Protokoll erfolgt unter Beachtung der Grundsätze der Deklaration von Helsinki und der Yale University menschliche Forschung Ethik-Kommission Leitlinien.
1. Beschaffung menschlichen Spenders Augen
<ol><li>Menschlichen Spenders Globen von der nationalen Krankheit Forschung Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) erhalten. Je nach Projekt bereiten Sie nicht weniger als drei Augenpaare Spender für jede experimentelle Gruppe.</li>
	<li>Enucleate Spender Augen innerhalb von 10 h und Schiff innerhalb von 48 Stunden post mortem. Dann transportieren Sie die Augen an das Labor in sterilen Dulbecco modifizierte Eagle Medium (DMEM) Kulturmedium auf Eis. Zuvor haben die gemeldeten Studien gezeigt, dass Spender Augen geerntet und in dieser Mode-Reservat, die biologischen Funktionen und Aktivitäten des Bruchs Membran25,26,29 transportiert.</li>
</ol>2. Gewinnung von menschlichen Bruch-Membran Explants
<ol><li>Statt jedes Auge auf einem 1,5 x 1,5 Zoll Gaze mit Kohlendioxid-unabhängige DMEM Medien in einer Kulturschale 100 mm und Nutzung feine Klinge Schere getränkt, einen Schnitt durch die Lederhaut 3 mm nach dem Limbus zu machen und umlaufend in beide Richtungen erweitern.</li>
	<li>Machen einen voll-Dicke umlaufende Einschnitt (eindringen, Glaskörper) 1 mm Posterior, die Ora Serrata. Entfernen Sie und entsorgen Sie der vorderen augenabschnitt (Hornhaut, Linse und Iris) und der Netzhaut und Glaskörper.</li>
	<li>Verwenden Sie feine chirurgische Scheren, um vier radiale Einschnitte zwischen Sklera und Aderhaut machen, und dann schälen Sie der Sklera Weg von der Peripherie des Sehnervs und kümmert sich um zu vermeiden, reißen die Aderhaut/Bruch-Membran komplexe.</li>
	<li>Als nächstes machen Sie einen umlaufenden Schnitt durch den Suprachoroidal Raum entlang der Ora Serrata und schälen Sie die RPE-Bruch-Membran-Aderhaut-Komplex nach hinten von der Sklera.</li>
	<li>Entfernen Sie native RPE-Zellen durch das Baden Explant mit 0,02 M Ammonium Hydroxid in Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) in 60 x 15 mm Polystyrol Petrischale für 20 min bei Raumtemperatur, gefolgt von bis zu dreimal in DPBS (Abbildung 1) waschen.</li>
	<li>Schweben Sie die Bruch-Membran komplexe Explant in Kohlendioxid-freie Medien über eine unveredelten, hydrophobe 65 µm dicken Polytetrafluorethylen Membran mit 0,2 µm-Poren mit der Basallamina Schicht aus jeder Explant mit Blick auf die Membran.</li>
	<li>Legen Sie eine Polytetrafluorethylen Membran mit Bruch Membran Explant auf einem fritted Glasträger in Vakuum Filterhalter Verglasungssystem Mikroanalyse.</li>
	<li>Glätten Sie die gewellten Kanten von der Aderhaut Seite mit feinen Pinzette beschichtet mit Teflon, kümmert sich nicht um die Bruch-Membran basale Laminin Seite berühren.</li>
	<li>15 mL Agarose (4 % DPBS) Erhitzen und dann auf 37 ° c abkühlen lassen Gießen Sie dann 15 mL Sondennahrung Gel auf der Bruch-Membran-Aderhaut-Komplex aus der Aderhaut-Seite während der Anwendung sanfte Saugwirkung um sicherzustellen, dass die modellabhängigen flach bleibt. Halten Sie das Gewebe bei 4 ° C für ca. 2-3 min., dann schälen Polytetrafluorethylen Membran entfernt und die Agarose zu festigen.</li>
	<li>Legen Sie den Bruch Membran Explant (1,5 Zoll im Durchmesser, in erstarrten Agarosegel) in ein 60 x 15 mm Polystyrol Zelle Kulturschale (mit Bruchs-Membran nach oben), die warme flüssige Agarose auf den Boden der Schale, die Bruch-Membran zu beheben gesäumt wurde Explant auf der Unterseite des Brunnens mit dem modellabhängigen basale Laminin-Layer nach oben.</li>
	<li>Die Agarose wird innerhalb von 2-3 min bei Raumtemperatur, die Bruch-Membran-Explantaten in der Kulturschale zu stabilisieren zu festigen. Abdeckung, die die Bruch-Membran in der Kultur explants Schüssel mit DPBS und das Gericht bei 4 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern. Abbildung 2A zeigt, dass die isolierten Bruch-Membran in der Kulturschale 60 x 15 mm explants.</li>
	<li>Wenn das gewünschte Kultur-System in eine 96-Well-Platte ist, legen Sie den Bruch Membran Explant (1,5 Zoll im Durchmesser, mit erstarrten Agarosegel) auf dem flachen Teflon Blatt mit Laminin-Seite oben.</li>
	<li>Mit einer Trephine, schneiden Sie fünf oder sechs, 6 mm-Rundschreiben-Schaltflächen aus der Bruch-Membran komplexe explant und jeweils auf 4 % Agarose bei 37 ° C in einem unbehandelten Polystyrol gut von einer 96-Well-Platte. Die Agarose wird innerhalb von 2-3 min bei Raumtemperatur, der Bruch Membran Explantate (Tasten) auf der Unterseite von jedem Bohrloch zu beheben zu festigen. Hinweis: Abbildung 2 b veranschaulicht trephined Bruch-Membran-Tasten in einer 96-Well-Platte. In der Regel können 9-11 Tasten oder Explantaten von jedem Auge geerntet werden.</li>
</ol>(3) Kultivierung der retinalen Pigment epithelialen (RPE) Zellen auf menschliche Bruch-Membran Explants
<ol><li>Reinigen Sie nach Erhalt der Spender Augen die extraokulären Gewebe mit DPBS. Machen Sie einen umlaufenden Einschnitt 5 mm unterhalb der Iris-Sklera berühren Sie Punkt (Pars Plana) in den subretinalen Raum. Entsorgen Sie den vorderen augenabschnitt, Glaskörper und Netzhaut.</li>
	<li>Waschen Sie die Augenmuschel, enthält der Bruch Membran und RPE Blatt mit kalten DPBS. Die RPE-Zellen mit 5 mL Trypsin 0,25 % nicht länger als 10 Minuten pro Auge Probe zu distanzieren. Die Trypsin-Reaktion mit 25 mL DMEM komplette Medium mit 15 % fetalen bovine Serum (FBS) bei 37 ° C in einer 50 mL-Tube erwärmt zu stillen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 × g für 10 min bei 24 ° C und das Pellet in 5 mL DMEM komplette Medium Aufschwemmen (mit 15 % FBS).</li>
	<li>Zählen der Zellen und Saatgut 15.000 tragfähige RPE-Zellen auf der Basallamina der jeweils verschiedenen Alter Bruch Membran Explantate (Tasten) in eine 96-Well-Platte in 200 µL serumfreien minimale wesentlichen Medien (MEM) mit Antibiotika (100 IE/mL Penicillin G, 100 mg / mL Streptomycin, 5 mg/mL Gentamicin und 2,5 mg/mL Amphotericin B). Unter der Annahme eines Zelle-Durchmesser von 20 µm, bei dieser Dichte Beschichtung ermöglicht RPE-Zellen um ca. 15 % des Gebiets Beschichtung zu decken.</li>
	<li>Platte die Zellen auf die Schaltfläche ", wobei die Zelldichte dann schrittweise bis zu 100 % Zusammenfluss je nach der Wirkung der einzelnen Parameter auf Zelle Verhalten erhöht werden kann.</li>
	<li>Ermöglichen Sie die Zellen Anfügen an den Explant für 24 h in eine feuchte Atmosphäre von 95 % air/5% CO2 bei 37 ° C. Verändern Sie Medium mit warmen komplette DMEM sanft.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Murdaugh, L. S., Wang, Z., Del Priore, L. V., Dillon, J., Gaillard, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+accumulation+of+3-nitrotyrosine+and+nitro-A2E+in+human+Bruch's+membrane.">Age-related accumulation of 3-nitrotyrosine and nitro-A2E in human Bruch's membrane.</a> Exp. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transplantation+of+fetal+human+retinal+pigment+epithelial+cells+onto+human+cadaver+Bruch's+membrane.">In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 66 (1), 49-67 (1998).</li><li>Nguyen, H. V., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+iPSC-derived+RPE+for+modeling+of+retinal+diseases.">Patient-specific iPSC-derived RPE for modeling of retinal diseases.</a> J. Clin. Med. 4 (4), 567-578 (2015).</li><li>Fletcher, E. L., Jobling, A. I., Greferath, U., Mills, S. A., Waugh, M., Ho, T., De Longh, R. U., Phipps, J. A., Vessey, K. 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Die Autoren haben kommerzielle Angaben zu erklären.

Im Alter von menschlichen Bruch-Membran (extrazelluläre Matrix) trägt zum Fortschreiten Erkrankung von AMD und somit besteht die Notwendigkeit zu verstehen, wie diese veränderte Matrix zur RPE Zellen Dysfunktion beiträgt. Angesichts des Mangels an ausreichenden Tiermodellen, Altersbedingte Veränderungen bei AMD zu studieren, können ex Vivo Modellsysteme, die die Auswirkungen der Krankheit zu imitieren als ein wertvolles Instrument zur Pathophysiologie verstehen dienen. In diesem Manuskript beschriebene Methode kann verwendet werden, konsequent menschlichen explants Bruch Membran und Kultur RPE Zellen, einschließlich der primären, verewigt oder Stammzellen gewonnenen RPE-Zelllinien zu isolieren.
Wie bereits erwähnt, stammen aus der NDRI menschlichen Bruch-Membran-Explantaten. Ein Protokoll ist mit NDRI etabliert, die angibt, die Kriterien für Spender Augen akzeptabel zu sein. Z. B. Geber müssen keine bekannten Netzhaut Augenkrankheiten, Augen/Globen sind innerhalb von 10 Stunden nach dem Tod abgerufen und Globen im Labor innerhalb von 48 h nach dem Tod (durch Paket Nachtanlieferung auf Eis) ankommen. Geben Sie die entsprechende Altersgruppe und Anzahl der Augen benötigt für die statistische Analyse der Studie, zB., fünf Paare von Globen von Spendern im Alter zwischen 20-49 Jahre und fünf Globus Paare von Spendern im Alter von 50-89 Jahre.
Die Verfügbarkeit von Auge Globen variiert in der Regel durchschnittlich zehn Paar Kugeln zur Verfügung jeden Monat. Das Auge-Paket kommt mit grundlegenden, anonymisierte Spenderinformationen: Alter, ethnische Herkunft, Tod, Todesursache, sowie kurze medizinische Vorgeschichte (Krankheit Inserat oder Begleiterkrankungen).
Am wichtigsten ist, erfordert menschliche Bruch-Membran-Explantaten Ernte die Entfernung des vorderen Segments des Auges und Glaskörper, so dass für die Isolierung von der RPE-Bruch-Membran-Aderhaut-Komplex. Sobald der Bruch-Membran isoliert ist, werden RPE-Zellen ausgesät auf die azellulären Explantaten in unterschiedlichen Konzentrationen und für nachgeschaltete Experimente kultiviert. Die Vorbereitung und verfahrensrechtliche Abwicklung wie hierin beschrieben ist von entscheidender Bedeutung, Aufmerksamkeit auf die Ausrichtung der isolierten Bruch-Membran, um sicherzustellen die laminal Oberfläche ist Verkleidung-Up während Sie berühren nicht die Oberfläche mechanisch zur Vermeidung von Schäden der extrazelluläre Matrix Oberflächenstruktur.
Anzumerken ist auch, dass wenn der Bruch-Membran-Explant-Systeme verwenden, gibt es einige Variablen, die beeinflussen könnten, nachgeschaltete Versuchsergebnisse wie einzelne Geber genomische Hintergrund, Alter der Bruch-Membran oder Post-mortem Tageszeit der Bruch Membran und den Speicherort der die Bruch-Membran, dh., zentralen oder peripheren Teil des Bruchs Membran Explantaten. Wie bei jeder anderen menschlichen Gewebes Studie, muss man die geeigneten Spender Auge Probennummer um die notwendige statistische Aussagekraft haben und passen Spender Auge Alter gegebenenfalls rekrutieren. Strenge Kriterien für die Annahme von Augen vom Auge Banken ist ein kritischer Parameter. Akzeptieren Sie nur Augen, das sind weniger als 10 h Post-mortem enukleiert und denen der Bruch-Membran-Vorbereitung innerhalb von 24-48 h nach Tod geerntet werden kann. Die Sehnerv-Website als ein Marker für die Ausrichtung verwendet werden, und verwenden die gleichen Standorte für experimentelle und Studiengruppen zu kontrollieren. Durch diese Maßnahmen kann man experimentelle Variabilität minimieren.
Zusammenfassend die RPE-Bruch-Membran-Aderhaut-Komplex zu verstehen und wie es wird beeinflußt durch Alter und Krankheit ist entscheidend für ihren Beitrag zur Pathophysiologie von AMD zu verstehen. Modellsysteme, die ex Vivo Techniken beschäftigen sind ein wertvolles Instrument, um diese Effekte, die mit menschlichem Gewebe zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Methodik, die menschlichen Spenders Explantaten als relevante Ex Vivo Modell Alter Bruch-Membran beschäftigt. Diese Technik erlaubt es, Alter und/oder kranken Menschen Bruch-Membran zu verwenden, da ein Recherche-Tool zu untersuchen, wie strukturellen Veränderungen innerhalb der Matrix beeinflussen kann überlagern RPE Zellen Verhalten einschließlich der Anlage sowie Verbreitung und Gen Ausdruck25 , 27. erfolgreiche Entwicklung von ähnlichen ex Vivo Modellsystemen wird unser Verständnis der AMD und erleichtern die Entwicklung von neuartigen therapeutischen Optionen.

Altersbedingte Strukturveränderungen zu menschlichen Bruch-Membran, die von vielen Faktoren ab, einschließlich Nitrosative und oxidativen Stress verursacht wird übt mehrere nachteilige Auswirkungen auf die Funktion der retinalen Pigment (RPE) epithelialen Zellen und trägt zu den Pathologie der altersbedingten Makula-Degeneration (AMD)1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Wenn man zellersatztherapie für fortgeschrittenen atrophischen AMD oder geographische Atrophie, benötigen Behandlung wahrscheinlich die Transplantation von Zellen auf einem Bett von RPE Zelle Atrophie. Altersbedingte Veränderungen im menschlichen Bruch-Membran können beeinträchtigen den Erfolg der transplantierten RPE Zelltransplantation, angesichts des Schadens an die extrazelluläre Matrix6,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Investigating Mensch Bruchs Membran Biologie und wie strukturellen Veränderungen innerhalb der Matrix dazu, das Fortschreiten zu AMD beitragen ist entscheidend für das Verständnis der Krankheit-Pathologie. So gibt es eine kritische Notwendigkeit für die Ermittler im Feld altersbedingten Auge, Protokolle zu entwickeln, die beschreiben, die Ex Vivo Ernte von Alter und/oder kranken Menschen Bruch-Membran.
Historisch gesehen wurde es schwierig, Modell altersbedingte Erkrankungen wie geographische Atrophie und ein Alter Mensch Bruch-Membran in Tiere23. Diese Schwierigkeit ergibt sich aus mehreren Faktoren, einschließlich die Langlebigkeit der Menschen im Vergleich zu Nagetiere und andere Arten, die häufig für Krankheit Modellierung sowie der Mangel an eine Makula in die meisten Wirbeltiere24verwendet. Der Vorteil des hier beschriebenen Verfahrens ist, dass Zellen direkt auf Bruch Membran extrahiert aus Post Mortem Augen von Alter und/oder kranke Personen getestet werden können. Das übergeordnete Ziel dieses Artikels ist es, eine detaillierte Methode für eine Ex Vivo Modell der alten und/oder Kranken menschlichen Bruch-Membran bereitzustellen, einschließlich der Isolierung der menschlichen Bruch Membran explants von menschlichen Spendern und die Aussaat des RPE Zellen für nachgeschalteten Experimente. Dieses Modell dient als ein Modell zu untersuchen, den Beitrag der extrazellulären Matrix Schaden RPE Zelle Funktion und Pathologie20,25,26,27,28.

<table><tbody><tr><td>Human donor globes</td><td>National Disease Research Interchange, NDRI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Carbon-dioxide independent media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>60-mm polystyrene petri dish</td><td>Corning Inc.</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline, PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic 65 &amp;micro;m-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 &amp;micro;m pores</td><td>Merck Millipore</td><td>JGWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-753-102</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576-5G</td><td></td></tr><tr><td>35 &amp;times; 10mm culture dish</td><td>VWR International</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>Trephine</td><td>Accutome</td><td>AM0570 60</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Corning Inc.</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential media (MEM)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11095-080&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1397-89-3</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1336-21-6&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing of retinal pigment epithelial cells on an ex vivo model of aged human bruch's membrane

Abgesehen von Vitaminen und Antioxidantien empfohlen von der Age-Related Eye Krankheit-Studie gibt es keine wirksame Therapie für "trocken" oder atrophischen Altersbedingte Makula-Degeneration (AMD) entspricht 90 % der Fälle. Therapien sind nötig, um zu verlangsamen oder die Entwicklung der geografischen Atrophie (GA) zu verzögern, und Verständnis Bruchs-Membran-Pathologie ist Teil dieses Prozesses. Veränderungen im menschlichen Bruch-Membran vorausgehen das Fortschreiten der AMD durch einen Beitrag zur Beschädigung der retinalen Pigment epithelialen (RPE) Zellen. Angesichts des Mangels an ausreichenden Tiermodellen, AMD zu studieren, dienen Ex Vivo Modelle im Alter von menschlichen Bruch-Membran, als ein nützliches Instrument zur Untersuchung des Verhaltens von RPE-Zellen von verewigt und Primärzelle Linien sowie RPE Linien von induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Zellen (iPSCs). Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Methode, die es erlaubt, die Auswirkungen des RPE Zellen Verhalten ausgesät auf geernteten menschlichen Bruch Membran Explantaten von menschlichen Spendern, einschließlich Anhang, Apoptose und Proliferation, Fähigkeit, Photorezeptor äußeren phagocytize bestimmen Segmente, Einrichtung der Polarität und Genexpression. Dieser Test bietet ein ex-Vivo -Modell Alter Bruch-Membran zur Beurteilung der funktionellen Eigenschaften der RPE-Zellen bei der extrazellulären Matrix im Alter/gefährdet ausgesät.

Wenn Sie dieses Protokoll richtig durchgeführt ist, kann man die Auswirkungen von Alter und/oder kranken Menschen Bruch-Membran auf Funktion der RPE-Zellen durch die Einrichtung der Polarität und der äußeren Blut-Retina-Schranke, polarisierte Sekretion von Wachstumsfaktoren und Zytokine bestimmen, und Phagozytose der Photorezeptor Stab außensegmenten.
Wir haben Daten generiert, die einen Krankheit Phänotyp auf alten menschlichen Bruch-Membran zu demonstrieren. Zum Beispiel im Alter von Kultivierung RPE-Zellen auf menschliche Bruch Membran Explantaten sinkt RPE Zellen Wiederbefestigung (Abbildung 3). RPE-Zellen kultiviert auf alten menschlichen Bruch-Membran verringert sich die Kapazität dieser Zellen zu Stab außensegmenten (ROS), phagocytize eine kritische RPE-Funktion (Abbildung 4). Darüber hinaus können apoptotische Zellen identifiziert und auf diese Schaltfläche Explantaten mit einem terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick Ende-Beschriftung (TUNEL) Fleck wie beschrieben in früheren Arbeiten26verglichen werden. Die Auswirkungen der Membran, ein Alter und/oder kranken Menschen Bruchs auf RPE Zellen Genexpressionsprofil können mit Microarray-Technologie ermittelt werden. Wir haben gezeigt, dass die Genexpression RPE Zellen verändert wird, wenn auf menschliche Bruch-Membran von älteren Personen im Vergleich zu Explantaten von jüngeren Personen (Abbildung 5)27kultiviert. Zur statistischen Auswertung dienen Explantaten von menschlichen Spendern mindestens 3-5 pro Gruppe.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Isolation des menschlichen Bruch-Membran aus Spender Augen. Menschlichen Bruch Membranen werden geerntet, indem entfernen, Sklera, vorderen augenabschnitt, Netzhaut, Glaskörper, und native Retinal pigment Epithelzellen (RPE). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig2.jpg"> Abbildung 2: Isolierte menschliche Bruch-Membran (BM) in der Kulturschale. (A) schematische Darstellung der menschlichen Bruch Membran Explantate (jeweils 1,5 Zoll im Durchmesser, mit erstarrten Agarosegel) platziert in einem 60 × 15 mm Polystyrol Zelle Kulturschale (BM bildoben) gefüllt mit warmen flüssigen Agarose auf der Unterseite der Schale. (B) eine menschliche Bruch Membran Explant, die in ein paar 6 mm Runde Knöpfe (Explantate), trephined wurde jeder IE wurde, dann auf 4 % Agarose bei 37 ° C in einem unbehandelten Polystyrol gut von einer 96-Well-Platte gelegt. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig3.jpg"> Abbildung 3. Retinalen Pigment epithelialen (RPE) Zell-Wiederbefestigung Rate auf junge und ältere Menschen Bruch-Membran (BM). Primäre RPE-Zellen wurden ausgesät auf Bruch Membran von jungen Explants Menschen (< 50-j hrige, n = 3) oder älter (> 70 Jahre alten, n = 5) Spender Augen für drei Wochen. Zelle wurde Anlage durch MTT Zelle Lebensfähigkeit Assay gemessen. Ältere Menschen Bruch Membranen reduziert die RPE Zellen Anlage Rate von 24 % (junge BM 100 + / 8.54 S.E vs. ältere BM 76.65 + 1,44 / S.E). p < 0,05, S.E = Standardfehler.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig4.jpg"> Abbildung 4. Retinalen Pigment epithelialen (RPE) Zelle Phagozytose wird beeinflusst durch das Alter von der menschlichen Bruch-Membran (BM). Primäre RPE-Zellen kultiviert auf ältere Menschen, die Bruch Membran explants hatte eine reduzierte Fähigkeit, Stab außensegmenten (ROS) phagocytize (junge BM 873 + 9,3 / S.E., n = 5 vs. ältere BM 608 + 25,4 / S.E., n = 5). p < 0,01, S.E = Standardfehler.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig5.jpg"> Abbildung 5. Anzahl der retinalen pigment epithelialen (RPE) Zelle Gene in jeder Probe kultiviert auf junge oder ältere Menschen Bruch-Membran explants. Es gab mehr Streuung in die Anzahl der Gene in primären RPE-Zellen ausgesät auf älteren im Vergleich zu jüngeren Menschen Bruch-Membran (6201 ± 388 vs. 6439 ± 80, beziehungsweise); für jede Altersgruppe wurden fünf Explantaten getestet. Präsentiert mit voller Zustimmung aller Autoren des Cai, H Et Al. 27. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Das Ziel dieses Protokolls ist, demonstrieren die Kultivierung der retinalen Pigment (RPE) Epithelzellen auf Alter und/oder kranken Menschen Bruch-Membran. Diese Methode ist geeignet, RPE Zellen Verhalten auf einem kompromittierten extrazelluläre Matrix zu studieren.

Kultivierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen auf einem Ex Vivo Modell der alten menschlichen Bruch-Membran

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

culturing-retinal-pigment-epithelial-cells-on-an-ex-vivo-model-aged

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

10.1K Aufrufe.  Yale School of Medicine. Das Ziel dieses Protokolls ist, demonstrieren die Kultivierung der retinalen Pigment (RPE) Epithelzellen auf Alter und/oder kranken Menschen Bruch-Membran. Diese Methode ist geeignet, RPE Zellen Verhalten auf einem kompromittierten extrazelluläre Matrix zu studieren.

Serie: Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

Experimentelle Modelle für das Studium der retinalen Pigmentepithelzellen Physiologie und Pathophysiologie

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Forschung

Neurowissenschaften

Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of the center&#160;of the retina, called the macula, resulting in the loss of central vision. Early AMD is characterised by the presence of small, yellowish lesions called soft drusen that can progress onto late AMD such as geographic atrophy (dry AMD) or neovascularisation (wet AMD). Although the clinical changes are well described, and the understanding of genetic influences on conferring AMD risk are getting ever more detailed, one area lacking major progress is an understanding of the biochemical consequences of genetic risk. This is partly due to difficulties in understanding the biochemistry of Bruch&#8217;s membrane, a very thin extracellular matrix that acts as a biological filter of material from the blood supply and a scaffold on which the retinal pigment epithelial (RPE) cell monolayer resides. Drusen form within Bruch&#8217;s membrane and their presence disrupts nutrient flow to the RPE cells. Only by investigating the protein composition of Bruch&#8217;s membrane, and indeed how other proteins interact with it, can researchers hope to unravel the biochemical mechanisms underpinning drusen formation, development of AMD and subsequent vision loss. This paper details methodologies for enriching either whole Bruch&#8217;s membrane, or just from the macula region, so that it can be used for downstream biochemical analysis, and provide examples of how this is already changing the understanding of Bruch&#8217;s membrane biochemistry.

Identifying proteins specifically associated with Bruch&#8217;s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

Bereicherung der Bruch-Membran von menschlichen Spender Augen

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

Langfristige, serumfreie Kultivierung organotypischer Maus-Retina-Explanten mit intaktem retinalen Pigmentepithel

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal pigment epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera, the integrity of the fragile retina can easily be compromised. The aim of this study was to develop a novel HORC model that contains the retina, RPE-choroid and sclera to maintain retinal integrity when culturing retinal explants.
After cutting circumferentially along the limbus to remove iris and lens, four deep incisions were made to flatten the eyecup. In contrast to previous HORC protocols, a trephine was used to cut through not only the retina but also the RPE-choroid and sclera. The resultant triple-layered explants were cultured for 72 h. Hematoxylin and Eosin staining (H&#38;E) was used to assess anatomical structures and retinal explants were further characterized by immunohistochemistry (IHC) for apoptosis, M&#252;ller cell integrity and retinal inflammation. To confirm the possibility of disease induction, explants were exposed to high glucose (HG) and pro-inflammatory cytokines (Cyt), to mimic diabetic retinopathy (DR). The Luminex magnetic bead assay was used to measure DR-related cytokines released into the culture medium.
H&#38;E staining revealed distinct retinal lamellae and compact nuclei in retinal explants with the underlying RPE-choroid and sclera, while retinas without the underlying structures exhibited reduced thickness and severe nuclei loss. IHC results indicated absence of apoptosis and retinal inflammation as well as preserved M&#252;ller cell integrity. The Luminex&#160;assays showed significantly increased secretion of DR-associated pro-inflammatory cytokines in retinal explants exposed to HG + Cyt relative to baseline levels at 24 h.
We successfully developed and characterized a novel HORC protocol in which retinal integrity was preserved without apoptosis or retinal inflammation. Moreover, the induced secretion of DR-associated pro-inflammatory biomarkers when exposing retinal explants to HG + Cyt suggests that this model could be used for clinically translatable retinal disease studies.

This study aims to develop a novel human organotypic retinal culture (HORC) model that prevents compromising retinal integrity during explant handling. This is achieved by culturing the retina with the overlying vitreous and the underlying retinal pigment&#160;epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera.

Charakterisierung einer neuartigen humanen organotypischen Netzhautkulturtechnik

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Medizin

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

Retinale Pigmentepitheltransplantation in einem nicht-menschlichen Primatenmodell für degenerative Netzhauterkrankungen

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Charakterisierung und morphologische Dynamik von kultiviertem primärem murinem RPE

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

Autor im Rampenlicht: Effiziente Isolierung von primären retinalen Pigmentepithelzellen aus adulten Mäusen für die Retinopathie-Forschung

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

Primären Zellkulturen aus das retinale Pigmentepithel Maus

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Biologie

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a multifactorial disease influenced by environmental and genetic factors, which lead to functional impairment of the retina due to retinal pigment epithelial (RPE) cell degeneration followed by photoreceptor degradation. An ideal treatment would include the transplantation of healthy RPE cells secreting neuroprotective factors to prevent RPE cell death and photoreceptor degeneration. Due to the functional and genetic similarities and the possibility of a less invasive biopsy, the transplantation of iris pigment epithelial (IPE) cells was proposed as a substitute for the degenerated RPE. Secretion of neuroprotective factors by a low number of subretinally-transplanted cells can be achieved by Sleeping Beauty (SB100X) transposon-mediated transfection with genes coding for the pigment epithelium-derived factor (PEDF) and/or the granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). We established the isolation, culture, and SB100X-mediated transfection of RPE and IPE cells from various species including rodents, pigs, and cattle. Globes are explanted and the cornea and lens are removed to access the iris and the retina. Using a custom-made spatula, IPE cells are removed from the isolated iris. To harvest RPE cells, a trypsin incubation may be required, depending on the species. Then, using RPE-customized spatula, cells are suspended in medium. After seeding, cells are monitored twice per week and, after reaching confluence, transfected by electroporation. Gene integration, expression, protein secretion, and function were confirmed by qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence, and functional assays. Depending on the species, 30,000-5 million (RPE) and 10,000-1.5 million (IPE) cells can be isolated per eye. Genetically modified cells show significant PEDF/GM-CSF overexpression with the capacity to reduce oxidative stress and offers a flexible system for ex vivo&#160;analyses and in vivo studies transferable to humans to develop ocular gene therapy approaches.

Here, a protocol to isolate and transfect primary iris and retinal pigment epithelial cells from various mammals (mice, rat, rabbit, pig, and bovine) is presented. The method is ideally suited to study ocular gene therapy approaches in various set-ups for ex vivo&#160;analyses and&#160;in vivo studies transferable to humans.

Isolierung, Kultur und Gentechnik von primären Pigmentepithelzellen von Säugetieren für die nicht-virale Gentherapie

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Kultivierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen auf einem Ex Vivo Modell der alten menschlichen Bruch-Membran

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Experimentelle Modelle für das Studium der retinalen Pigmentepithelzellen Physiologie und Pathophysiologie

Bereicherung der Bruch-Membran von menschlichen Spender Augen

Langfristige, serumfreie Kultivierung organotypischer Maus-Retina-Explanten mit intaktem retinalen Pigmentepithel

Charakterisierung einer neuartigen humanen organotypischen Netzhautkulturtechnik

Retinale Pigmentepitheltransplantation in einem nicht-menschlichen Primatenmodell für degenerative Netzhauterkrankungen

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Primären Zellkulturen aus das retinale Pigmentepithel Maus

Isolierung, Kultur und Gentechnik von primären Pigmentepithelzellen von Säugetieren für die nicht-virale Gentherapie