Diese Forschung stützt sich auf Forschung, um zu verhindern, dass Blindheit, New York, www.rpbusa.org und die Greater New York Center für Retinal Degenerative Krankheit Stiftung Fighting Blindness, www.blindness.org. Die Autoren möchten Luanna Bartholomew, Ph.d., danke für ihre kritische Überprüfung dieses Manuskriptes.

Das folgende Protokoll erfolgt unter Beachtung der Grundsätze der Deklaration von Helsinki und der Yale University menschliche Forschung Ethik-Kommission Leitlinien.
1. Beschaffung menschlichen Spenders Augen
<ol><li>Menschlichen Spenders Globen von der nationalen Krankheit Forschung Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) erhalten. Je nach Projekt bereiten Sie nicht weniger als drei Augenpaare Spender für jede experimentelle Gruppe.</li>
	<li>Enucleate Spender Augen innerhalb von 10 h und Schiff innerhalb von 48 Stunden post mortem. Dann transportieren Sie die Augen an das Labor in sterilen Dulbecco modifizierte Eagle Medium (DMEM) Kulturmedium auf Eis. Zuvor haben die gemeldeten Studien gezeigt, dass Spender Augen geerntet und in dieser Mode-Reservat, die biologischen Funktionen und Aktivitäten des Bruchs Membran25,26,29 transportiert.</li>
</ol>2. Gewinnung von menschlichen Bruch-Membran Explants
<ol><li>Statt jedes Auge auf einem 1,5 x 1,5 Zoll Gaze mit Kohlendioxid-unabhängige DMEM Medien in einer Kulturschale 100 mm und Nutzung feine Klinge Schere getränkt, einen Schnitt durch die Lederhaut 3 mm nach dem Limbus zu machen und umlaufend in beide Richtungen erweitern.</li>
	<li>Machen einen voll-Dicke umlaufende Einschnitt (eindringen, Glaskörper) 1 mm Posterior, die Ora Serrata. Entfernen Sie und entsorgen Sie der vorderen augenabschnitt (Hornhaut, Linse und Iris) und der Netzhaut und Glaskörper.</li>
	<li>Verwenden Sie feine chirurgische Scheren, um vier radiale Einschnitte zwischen Sklera und Aderhaut machen, und dann schälen Sie der Sklera Weg von der Peripherie des Sehnervs und kümmert sich um zu vermeiden, reißen die Aderhaut/Bruch-Membran komplexe.</li>
	<li>Als nächstes machen Sie einen umlaufenden Schnitt durch den Suprachoroidal Raum entlang der Ora Serrata und schälen Sie die RPE-Bruch-Membran-Aderhaut-Komplex nach hinten von der Sklera.</li>
	<li>Entfernen Sie native RPE-Zellen durch das Baden Explant mit 0,02 M Ammonium Hydroxid in Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) in 60 x 15 mm Polystyrol Petrischale für 20 min bei Raumtemperatur, gefolgt von bis zu dreimal in DPBS (Abbildung 1) waschen.</li>
	<li>Schweben Sie die Bruch-Membran komplexe Explant in Kohlendioxid-freie Medien über eine unveredelten, hydrophobe 65 µm dicken Polytetrafluorethylen Membran mit 0,2 µm-Poren mit der Basallamina Schicht aus jeder Explant mit Blick auf die Membran.</li>
	<li>Legen Sie eine Polytetrafluorethylen Membran mit Bruch Membran Explant auf einem fritted Glasträger in Vakuum Filterhalter Verglasungssystem Mikroanalyse.</li>
	<li>Glätten Sie die gewellten Kanten von der Aderhaut Seite mit feinen Pinzette beschichtet mit Teflon, kümmert sich nicht um die Bruch-Membran basale Laminin Seite berühren.</li>
	<li>15 mL Agarose (4 % DPBS) Erhitzen und dann auf 37 ° c abkühlen lassen Gießen Sie dann 15 mL Sondennahrung Gel auf der Bruch-Membran-Aderhaut-Komplex aus der Aderhaut-Seite während der Anwendung sanfte Saugwirkung um sicherzustellen, dass die modellabhängigen flach bleibt. Halten Sie das Gewebe bei 4 ° C für ca. 2-3 min., dann schälen Polytetrafluorethylen Membran entfernt und die Agarose zu festigen.</li>
	<li>Legen Sie den Bruch Membran Explant (1,5 Zoll im Durchmesser, in erstarrten Agarosegel) in ein 60 x 15 mm Polystyrol Zelle Kulturschale (mit Bruchs-Membran nach oben), die warme flüssige Agarose auf den Boden der Schale, die Bruch-Membran zu beheben gesäumt wurde Explant auf der Unterseite des Brunnens mit dem modellabhängigen basale Laminin-Layer nach oben.</li>
	<li>Die Agarose wird innerhalb von 2-3 min bei Raumtemperatur, die Bruch-Membran-Explantaten in der Kulturschale zu stabilisieren zu festigen. Abdeckung, die die Bruch-Membran in der Kultur explants Schüssel mit DPBS und das Gericht bei 4 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern. Abbildung 2A zeigt, dass die isolierten Bruch-Membran in der Kulturschale 60 x 15 mm explants.</li>
	<li>Wenn das gewünschte Kultur-System in eine 96-Well-Platte ist, legen Sie den Bruch Membran Explant (1,5 Zoll im Durchmesser, mit erstarrten Agarosegel) auf dem flachen Teflon Blatt mit Laminin-Seite oben.</li>
	<li>Mit einer Trephine, schneiden Sie fünf oder sechs, 6 mm-Rundschreiben-Schaltflächen aus der Bruch-Membran komplexe explant und jeweils auf 4 % Agarose bei 37 ° C in einem unbehandelten Polystyrol gut von einer 96-Well-Platte. Die Agarose wird innerhalb von 2-3 min bei Raumtemperatur, der Bruch Membran Explantate (Tasten) auf der Unterseite von jedem Bohrloch zu beheben zu festigen. Hinweis: Abbildung 2 b veranschaulicht trephined Bruch-Membran-Tasten in einer 96-Well-Platte. In der Regel können 9-11 Tasten oder Explantaten von jedem Auge geerntet werden.</li>
</ol>(3) Kultivierung der retinalen Pigment epithelialen (RPE) Zellen auf menschliche Bruch-Membran Explants
<ol><li>Reinigen Sie nach Erhalt der Spender Augen die extraokulären Gewebe mit DPBS. Machen Sie einen umlaufenden Einschnitt 5 mm unterhalb der Iris-Sklera berühren Sie Punkt (Pars Plana) in den subretinalen Raum. Entsorgen Sie den vorderen augenabschnitt, Glaskörper und Netzhaut.</li>
	<li>Waschen Sie die Augenmuschel, enthält der Bruch Membran und RPE Blatt mit kalten DPBS. Die RPE-Zellen mit 5 mL Trypsin 0,25 % nicht länger als 10 Minuten pro Auge Probe zu distanzieren. Die Trypsin-Reaktion mit 25 mL DMEM komplette Medium mit 15 % fetalen bovine Serum (FBS) bei 37 ° C in einer 50 mL-Tube erwärmt zu stillen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 × g für 10 min bei 24 ° C und das Pellet in 5 mL DMEM komplette Medium Aufschwemmen (mit 15 % FBS).</li>
	<li>Zählen der Zellen und Saatgut 15.000 tragfähige RPE-Zellen auf der Basallamina der jeweils verschiedenen Alter Bruch Membran Explantate (Tasten) in eine 96-Well-Platte in 200 µL serumfreien minimale wesentlichen Medien (MEM) mit Antibiotika (100 IE/mL Penicillin G, 100 mg / mL Streptomycin, 5 mg/mL Gentamicin und 2,5 mg/mL Amphotericin B). Unter der Annahme eines Zelle-Durchmesser von 20 µm, bei dieser Dichte Beschichtung ermöglicht RPE-Zellen um ca. 15 % des Gebiets Beschichtung zu decken.</li>
	<li>Platte die Zellen auf die Schaltfläche ", wobei die Zelldichte dann schrittweise bis zu 100 % Zusammenfluss je nach der Wirkung der einzelnen Parameter auf Zelle Verhalten erhöht werden kann.</li>
	<li>Ermöglichen Sie die Zellen Anfügen an den Explant für 24 h in eine feuchte Atmosphäre von 95 % air/5% CO2 bei 37 ° C. Verändern Sie Medium mit warmen komplette DMEM sanft.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Murdaugh, L. S., Wang, Z., Del Priore, L. V., Dillon, J., Gaillard, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+accumulation+of+3-nitrotyrosine+and+nitro-A2E+in+human+Bruch's+membrane.">Age-related accumulation of 3-nitrotyrosine and nitro-A2E in human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 90 (5), 564-571 (2010).</li><li>Wiradjaja, F., DiTommaso, T., Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membranes+in+development+and+disease.">Basement membranes in development and disease.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (1), 8-31 (2010).</li><li>Nystrom, A., Bornert, O., Kuhl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+basement+membrane-linked+diseases.">Cell therapy for basement membrane-linked diseases.</a> Matrix Biol. , (2016).</li><li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+changes+in+Bruch's+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study.">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li><li>Marshall, G. E., Konstas, A. G., Reid, G. G., Edwards, J. G., Lee, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IV+collagen+and+laminin+in+Bruch's+membrane+and+basal+linear+deposit+in+the+human+macula.">Type IV collagen and laminin in Bruch's membrane and basal linear deposit in the human macula.</a> Brit. J. Ophthalmol. 76 (10), 607-614 (1992).</li><li>Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+drusen+formation+in+the+normal+and+aging+eye+and+their+relation+to+age+related+maculopathy:+a+clinicopathological+study.">Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study.</a> Brit. J. Ophthalmol. 83 (3), 358-368 (1999).</li><li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid,+Bruch's+membrane,+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes.">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (Suppl 1), S10-S32 (1999).</li><li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+in+age-related+macular+degeneration:+pathogenesis,+natural+course,+and+laser+photocoagulation-induced+regression.">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li><li>Mullins, R. F., Aptsiauri, N., Hageman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+composition+of+drusen+associated+with+glomerulonephritis:+implications+for+the+role+of+complement+activation+in+drusen+biogenesis.">Structure and composition of drusen associated with glomerulonephritis: implications for the role of complement activation in drusen biogenesis.</a> Eye. 15 (Pt 3), 390-395 (2001).</li><li>Caldwell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+alterations+precede+vascularization+of+the+retinal+pigment+epithelium+in+dystrophic+rats.">Extracellular matrix alterations precede vascularization of the retinal pigment epithelium in dystrophic rats.</a> Curr. Eye Res. 8 (9), 907-921 (1989).</li><li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+changes+in+Bruch's+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study.">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li><li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+in+age-related+macular+degeneration:+pathogenesis,+natural+course,+and+laser+photocoagulation-induced+regression.">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li><li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid,+Bruch's+membrane,+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes.">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv Ophthalmol. 44, S10-S32 (1999).</li><li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li><li>Ho, T. C., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+of+cultured+human+retinal+pigment+epithelium+to+extracellular+matrix+and+human+Bruch's+membrane.">Reattachment of cultured human retinal pigment epithelium to extracellular matrix and human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 38 (6), 1110-1118 (1997).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+to+a+substrate+prevents+apoptosis+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 235 (1), 41-47 (1997).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF+beta+secretion+modulates+the+density-dependent+growth+of+pig+retinal+pigment+epithelium+in+vitro.">TGF beta secretion modulates the density-dependent growth of pig retinal pigment epithelium in vitro.</a> Ophthalmic Res. 31 (3), 192-202 (1999).</li><li>Gullapalli, V. K., Sugino, I. K., Van Patten, Y., Shah, S., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+RPE+survival+on+aged+submacular+human+Bruch's+membrane.">Impaired RPE survival on aged submacular human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 80 (2), 235-248 (2005).</li><li>Wang, H., Yagi, F., Cheewatrakoolpong, N., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+study+of+retinal+pigment+epithelium+sheet+transplants+onto+Bruch's+membrane.">Short-term study of retinal pigment epithelium sheet transplants onto Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 78 (1), 53-65 (2004).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulation+of+different+layers+of+host+human+Bruch's+membrane+by+retinal+pigment+epithelial+cell+grafts.">Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (3), 767-774 (1999).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+of+aged+Bruch's+membrane+to+enhance+retinal+pigment+epithelium+repopulation.">Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 45 (9), 3337-3348 (2004).</li><li>Castellarin, A. A., Sugino, I. K., Vargas, J. A., Parolini, B., Lui, G. M., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transplantation+of+fetal+human+retinal+pigment+epithelial+cells+onto+human+cadaver+Bruch's+membrane.">In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 66 (1), 49-67 (1998).</li><li>Nguyen, H. V., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+iPSC-derived+RPE+for+modeling+of+retinal+diseases.">Patient-specific iPSC-derived RPE for modeling of retinal diseases.</a> J. Clin. Med. 4 (4), 567-578 (2015).</li><li>Fletcher, E. L., Jobling, A. I., Greferath, U., Mills, S. A., Waugh, M., Ho, T., De Longh, R. U., Phipps, J. A., Vessey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models.">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry Vision Sci. 91 (8), 878-886 (2014).</li><li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li><li>Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+human+retinal+pigment+epithelial+cells+seeded+onto+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (2), 467-476 (1999).</li><li>Cai, H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruch+membrane+aging+alters+the+gene+expression+profile+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Bruch membrane aging alters the gene expression profile of human retinal pigment epithelium.</a> Curr. Eye Res. 31 (2), 181-189 (2006).</li><li>Moreira, E. F., Cai, H., Tezel, T. H., Fields, M. A., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+human+Bruch's+membrane+increases+rod+outer+segment+phagocytosis+by+human+retinal+pigment+epithelium.">Reengineering human Bruch's membrane increases rod outer segment phagocytosis by human retinal pigment epithelium.</a> Transl. Vis. Sci. Technol. 4 (5), 10 (2015).</li><li>Sun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruch's+membrane+aging+decreases+phagocytosis+of+outer+segments+by+retinal+pigment+epithelium.">Bruch's membrane aging decreases phagocytosis of outer segments by retinal pigment epithelium.</a> Mol. Vis. 13, 2310-2319 (2007).</li></ol>

Die Autoren haben kommerzielle Angaben zu erklären.

Im Alter von menschlichen Bruch-Membran (extrazelluläre Matrix) trägt zum Fortschreiten Erkrankung von AMD und somit besteht die Notwendigkeit zu verstehen, wie diese veränderte Matrix zur RPE Zellen Dysfunktion beiträgt. Angesichts des Mangels an ausreichenden Tiermodellen, Altersbedingte Veränderungen bei AMD zu studieren, können ex Vivo Modellsysteme, die die Auswirkungen der Krankheit zu imitieren als ein wertvolles Instrument zur Pathophysiologie verstehen dienen. In diesem Manuskript beschriebene Methode kann verwendet werden, konsequent menschlichen explants Bruch Membran und Kultur RPE Zellen, einschließlich der primären, verewigt oder Stammzellen gewonnenen RPE-Zelllinien zu isolieren.
Wie bereits erwähnt, stammen aus der NDRI menschlichen Bruch-Membran-Explantaten. Ein Protokoll ist mit NDRI etabliert, die angibt, die Kriterien für Spender Augen akzeptabel zu sein. Z. B. Geber müssen keine bekannten Netzhaut Augenkrankheiten, Augen/Globen sind innerhalb von 10 Stunden nach dem Tod abgerufen und Globen im Labor innerhalb von 48 h nach dem Tod (durch Paket Nachtanlieferung auf Eis) ankommen. Geben Sie die entsprechende Altersgruppe und Anzahl der Augen benötigt für die statistische Analyse der Studie, zB., fünf Paare von Globen von Spendern im Alter zwischen 20-49 Jahre und fünf Globus Paare von Spendern im Alter von 50-89 Jahre.
Die Verfügbarkeit von Auge Globen variiert in der Regel durchschnittlich zehn Paar Kugeln zur Verfügung jeden Monat. Das Auge-Paket kommt mit grundlegenden, anonymisierte Spenderinformationen: Alter, ethnische Herkunft, Tod, Todesursache, sowie kurze medizinische Vorgeschichte (Krankheit Inserat oder Begleiterkrankungen).
Am wichtigsten ist, erfordert menschliche Bruch-Membran-Explantaten Ernte die Entfernung des vorderen Segments des Auges und Glaskörper, so dass für die Isolierung von der RPE-Bruch-Membran-Aderhaut-Komplex. Sobald der Bruch-Membran isoliert ist, werden RPE-Zellen ausgesät auf die azellulären Explantaten in unterschiedlichen Konzentrationen und für nachgeschaltete Experimente kultiviert. Die Vorbereitung und verfahrensrechtliche Abwicklung wie hierin beschrieben ist von entscheidender Bedeutung, Aufmerksamkeit auf die Ausrichtung der isolierten Bruch-Membran, um sicherzustellen die laminal Oberfläche ist Verkleidung-Up während Sie berühren nicht die Oberfläche mechanisch zur Vermeidung von Schäden der extrazelluläre Matrix Oberflächenstruktur.
Anzumerken ist auch, dass wenn der Bruch-Membran-Explant-Systeme verwenden, gibt es einige Variablen, die beeinflussen könnten, nachgeschaltete Versuchsergebnisse wie einzelne Geber genomische Hintergrund, Alter der Bruch-Membran oder Post-mortem Tageszeit der Bruch Membran und den Speicherort der die Bruch-Membran, dh., zentralen oder peripheren Teil des Bruchs Membran Explantaten. Wie bei jeder anderen menschlichen Gewebes Studie, muss man die geeigneten Spender Auge Probennummer um die notwendige statistische Aussagekraft haben und passen Spender Auge Alter gegebenenfalls rekrutieren. Strenge Kriterien für die Annahme von Augen vom Auge Banken ist ein kritischer Parameter. Akzeptieren Sie nur Augen, das sind weniger als 10 h Post-mortem enukleiert und denen der Bruch-Membran-Vorbereitung innerhalb von 24-48 h nach Tod geerntet werden kann. Die Sehnerv-Website als ein Marker für die Ausrichtung verwendet werden, und verwenden die gleichen Standorte für experimentelle und Studiengruppen zu kontrollieren. Durch diese Maßnahmen kann man experimentelle Variabilität minimieren.
Zusammenfassend die RPE-Bruch-Membran-Aderhaut-Komplex zu verstehen und wie es wird beeinflußt durch Alter und Krankheit ist entscheidend für ihren Beitrag zur Pathophysiologie von AMD zu verstehen. Modellsysteme, die ex Vivo Techniken beschäftigen sind ein wertvolles Instrument, um diese Effekte, die mit menschlichem Gewebe zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Methodik, die menschlichen Spenders Explantaten als relevante Ex Vivo Modell Alter Bruch-Membran beschäftigt. Diese Technik erlaubt es, Alter und/oder kranken Menschen Bruch-Membran zu verwenden, da ein Recherche-Tool zu untersuchen, wie strukturellen Veränderungen innerhalb der Matrix beeinflussen kann überlagern RPE Zellen Verhalten einschließlich der Anlage sowie Verbreitung und Gen Ausdruck25 , 27. erfolgreiche Entwicklung von ähnlichen ex Vivo Modellsystemen wird unser Verständnis der AMD und erleichtern die Entwicklung von neuartigen therapeutischen Optionen.

Altersbedingte Strukturveränderungen zu menschlichen Bruch-Membran, die von vielen Faktoren ab, einschließlich Nitrosative und oxidativen Stress verursacht wird übt mehrere nachteilige Auswirkungen auf die Funktion der retinalen Pigment (RPE) epithelialen Zellen und trägt zu den Pathologie der altersbedingten Makula-Degeneration (AMD)1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Wenn man zellersatztherapie für fortgeschrittenen atrophischen AMD oder geographische Atrophie, benötigen Behandlung wahrscheinlich die Transplantation von Zellen auf einem Bett von RPE Zelle Atrophie. Altersbedingte Veränderungen im menschlichen Bruch-Membran können beeinträchtigen den Erfolg der transplantierten RPE Zelltransplantation, angesichts des Schadens an die extrazelluläre Matrix6,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Investigating Mensch Bruchs Membran Biologie und wie strukturellen Veränderungen innerhalb der Matrix dazu, das Fortschreiten zu AMD beitragen ist entscheidend für das Verständnis der Krankheit-Pathologie. So gibt es eine kritische Notwendigkeit für die Ermittler im Feld altersbedingten Auge, Protokolle zu entwickeln, die beschreiben, die Ex Vivo Ernte von Alter und/oder kranken Menschen Bruch-Membran.
Historisch gesehen wurde es schwierig, Modell altersbedingte Erkrankungen wie geographische Atrophie und ein Alter Mensch Bruch-Membran in Tiere23. Diese Schwierigkeit ergibt sich aus mehreren Faktoren, einschließlich die Langlebigkeit der Menschen im Vergleich zu Nagetiere und andere Arten, die häufig für Krankheit Modellierung sowie der Mangel an eine Makula in die meisten Wirbeltiere24verwendet. Der Vorteil des hier beschriebenen Verfahrens ist, dass Zellen direkt auf Bruch Membran extrahiert aus Post Mortem Augen von Alter und/oder kranke Personen getestet werden können. Das übergeordnete Ziel dieses Artikels ist es, eine detaillierte Methode für eine Ex Vivo Modell der alten und/oder Kranken menschlichen Bruch-Membran bereitzustellen, einschließlich der Isolierung der menschlichen Bruch Membran explants von menschlichen Spendern und die Aussaat des RPE Zellen für nachgeschalteten Experimente. Dieses Modell dient als ein Modell zu untersuchen, den Beitrag der extrazellulären Matrix Schaden RPE Zelle Funktion und Pathologie20,25,26,27,28.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1219">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:599px;">Human donor globes</td>
			<td style="width:305px;">National Disease Research Interchange, NDRI</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbon-dioxide independent media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18045-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60-mm polystyrene petri dish</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline, PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrophobic 65 &#181;m-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 &#181;m pores</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>JGWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-753-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 &#215; 10mm culture dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25373-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trephine</td>
			<td>Accutome</td>
			<td>AM0570 60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well plate</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimum essential media (MEM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11095-080&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032-1MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1336-21-6 
			&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing of retinal pigment epithelial cells on an ex vivo model of aged human bruch's membrane

Abgesehen von Vitaminen und Antioxidantien empfohlen von der Age-Related Eye Krankheit-Studie gibt es keine wirksame Therapie für "trocken" oder atrophischen Altersbedingte Makula-Degeneration (AMD) entspricht 90 % der Fälle. Therapien sind nötig, um zu verlangsamen oder die Entwicklung der geografischen Atrophie (GA) zu verzögern, und Verständnis Bruchs-Membran-Pathologie ist Teil dieses Prozesses. Veränderungen im menschlichen Bruch-Membran vorausgehen das Fortschreiten der AMD durch einen Beitrag zur Beschädigung der retinalen Pigment epithelialen (RPE) Zellen. Angesichts des Mangels an ausreichenden Tiermodellen, AMD zu studieren, dienen Ex Vivo Modelle im Alter von menschlichen Bruch-Membran, als ein nützliches Instrument zur Untersuchung des Verhaltens von RPE-Zellen von verewigt und Primärzelle Linien sowie RPE Linien von induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Zellen (iPSCs). Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Methode, die es erlaubt, die Auswirkungen des RPE Zellen Verhalten ausgesät auf geernteten menschlichen Bruch Membran Explantaten von menschlichen Spendern, einschließlich Anhang, Apoptose und Proliferation, Fähigkeit, Photorezeptor äußeren phagocytize bestimmen Segmente, Einrichtung der Polarität und Genexpression. Dieser Test bietet ein ex-Vivo -Modell Alter Bruch-Membran zur Beurteilung der funktionellen Eigenschaften der RPE-Zellen bei der extrazellulären Matrix im Alter/gefährdet ausgesät.

Wenn Sie dieses Protokoll richtig durchgeführt ist, kann man die Auswirkungen von Alter und/oder kranken Menschen Bruch-Membran auf Funktion der RPE-Zellen durch die Einrichtung der Polarität und der äußeren Blut-Retina-Schranke, polarisierte Sekretion von Wachstumsfaktoren und Zytokine bestimmen, und Phagozytose der Photorezeptor Stab außensegmenten.
Wir haben Daten generiert, die einen Krankheit Phänotyp auf alten menschlichen Bruch-Membran zu demonstrieren. Zum Beispiel im Alter von Kultivierung RPE-Zellen auf menschliche Bruch Membran Explantaten sinkt RPE Zellen Wiederbefestigung (Abbildung 3). RPE-Zellen kultiviert auf alten menschlichen Bruch-Membran verringert sich die Kapazität dieser Zellen zu Stab außensegmenten (ROS), phagocytize eine kritische RPE-Funktion (Abbildung 4). Darüber hinaus können apoptotische Zellen identifiziert und auf diese Schaltfläche Explantaten mit einem terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick Ende-Beschriftung (TUNEL) Fleck wie beschrieben in früheren Arbeiten26verglichen werden. Die Auswirkungen der Membran, ein Alter und/oder kranken Menschen Bruchs auf RPE Zellen Genexpressionsprofil können mit Microarray-Technologie ermittelt werden. Wir haben gezeigt, dass die Genexpression RPE Zellen verändert wird, wenn auf menschliche Bruch-Membran von älteren Personen im Vergleich zu Explantaten von jüngeren Personen (Abbildung 5)27kultiviert. Zur statistischen Auswertung dienen Explantaten von menschlichen Spendern mindestens 3-5 pro Gruppe.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Isolation des menschlichen Bruch-Membran aus Spender Augen. Menschlichen Bruch Membranen werden geerntet, indem entfernen, Sklera, vorderen augenabschnitt, Netzhaut, Glaskörper, und native Retinal pigment Epithelzellen (RPE). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig2.jpg"> Abbildung 2: Isolierte menschliche Bruch-Membran (BM) in der Kulturschale. (A) schematische Darstellung der menschlichen Bruch Membran Explantate (jeweils 1,5 Zoll im Durchmesser, mit erstarrten Agarosegel) platziert in einem 60 × 15 mm Polystyrol Zelle Kulturschale (BM bildoben) gefüllt mit warmen flüssigen Agarose auf der Unterseite der Schale. (B) eine menschliche Bruch Membran Explant, die in ein paar 6 mm Runde Knöpfe (Explantate), trephined wurde jeder IE wurde, dann auf 4 % Agarose bei 37 ° C in einem unbehandelten Polystyrol gut von einer 96-Well-Platte gelegt. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig3.jpg"> Abbildung 3. Retinalen Pigment epithelialen (RPE) Zell-Wiederbefestigung Rate auf junge und ältere Menschen Bruch-Membran (BM). Primäre RPE-Zellen wurden ausgesät auf Bruch Membran von jungen Explants Menschen (< 50-j hrige, n = 3) oder älter (> 70 Jahre alten, n = 5) Spender Augen für drei Wochen. Zelle wurde Anlage durch MTT Zelle Lebensfähigkeit Assay gemessen. Ältere Menschen Bruch Membranen reduziert die RPE Zellen Anlage Rate von 24 % (junge BM 100 + / 8.54 S.E vs. ältere BM 76.65 + 1,44 / S.E). p < 0,05, S.E = Standardfehler.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig4.jpg"> Abbildung 4. Retinalen Pigment epithelialen (RPE) Zelle Phagozytose wird beeinflusst durch das Alter von der menschlichen Bruch-Membran (BM). Primäre RPE-Zellen kultiviert auf ältere Menschen, die Bruch Membran explants hatte eine reduzierte Fähigkeit, Stab außensegmenten (ROS) phagocytize (junge BM 873 + 9,3 / S.E., n = 5 vs. ältere BM 608 + 25,4 / S.E., n = 5). p < 0,01, S.E = Standardfehler.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig5.jpg"> Abbildung 5. Anzahl der retinalen pigment epithelialen (RPE) Zelle Gene in jeder Probe kultiviert auf junge oder ältere Menschen Bruch-Membran explants. Es gab mehr Streuung in die Anzahl der Gene in primären RPE-Zellen ausgesät auf älteren im Vergleich zu jüngeren Menschen Bruch-Membran (6201 ± 388 vs. 6439 ± 80, beziehungsweise); für jede Altersgruppe wurden fünf Explantaten getestet. Präsentiert mit voller Zustimmung aller Autoren des Cai, H Et Al. 27. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane at JoVE.com

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Das Ziel dieses Protokolls ist, demonstrieren die Kultivierung der retinalen Pigment (RPE) Epithelzellen auf Alter und/oder kranken Menschen Bruch-Membran. Diese Methode ist geeignet, RPE Zellen Verhalten auf einem kompromittierten extrazelluläre Matrix zu studieren.

Kultivierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen auf einem Ex Vivo Modell der alten menschlichen Bruch-Membran

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

culturing-retinal-pigment-epithelial-cells-on-an-ex-vivo-model-aged

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

10.1K Aufrufe.  Yale School of Medicine. Das Ziel dieses Protokolls ist, demonstrieren die Kultivierung der retinalen Pigment (RPE) Epithelzellen auf Alter und/oder kranken Menschen Bruch-Membran. Diese Methode ist geeignet, RPE Zellen Verhalten auf einem kompromittierten extrazelluläre Matrix zu studieren.

Serie: Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

Optimierte<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Züchtung von Hühnerembryonen zu fortgeschrittenen Entwicklungsstadium

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

Effiziente Ableitung von Retinapigmentepithel-Zellen aus Stammzellen

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

The objective of this report is to describe the protocols to derive the retinal pigment epithelium (RPE) from induced pluripotent stem (iPS) cells using different sizes of embryoid bodies.

Ableiten Retinapigmentepithel (RPE) von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von verschiedenen Größen von Embryoidkörpern

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells&#8217; native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens1. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Einrichtung von einem klinisch relevanten<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Kataraktchirurgie Modell zur Untersuchung von epithelialen Wundheilung in einer nativen Mikromilieu

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Die Kultivierung humanen pluripotenten und Neurale Stammzellen in einem geschlossenen Zellkultursystem für Grund- und Präklinische Forschung

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune cells, and the coordination with lymphatic vessels and nerves. The multi-cell, multi-system interactions necessitate the investigation of angiogenesis in a physiologically relevant environment. Thus, while the use of in vitro cell-culture models have provided mechanistic insights, a common critique is that they do not recapitulate the complexity associated with a microvascular network. The objective of this protocol is to demonstrate the ability to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks before and after angiogenesis stimulation in cultured rat mesentery tissues. Cultured tissues contain microvascular networks that maintain their hierarchy. Immunohistochemical labeling confirms the presence of endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, blood vessels and lymphatic vessels. In addition, labeling tissues with BSI-lectin enables time-lapse comparison of local network regions before and after serum or growth factor stimulation characterized by increased capillary sprouting and vessel density. In comparison to common cell culture models, this method provides a tool for endothelial cell lineage studies and tissue specific angiogenic drug evaluation in physiologically relevant microvascular networks.

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

Ein<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Methode für Time-Lapse-Imaging von kultivierten Ratten Mesenteriale mikrovaskuläre Netzwerke

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the efficacy of cell persistence and biodistribution of haMSCs in animal models. We demonstrated a method to label the cell membrane of haMSCs with lipophilic fluorescent dye. Subsequently, intra-articular injection of the labeled cells in rats with surgically induced KOA was monitored dynamically by an in vivo imaging system. We employed the lipophilic carbocyanines DiD (DilC18 (5)), a far-red fluorescent Dil (dialkylcarbocyanines) analog, which utilized a red laser to avoid excitation of the natural green autofluorescence from surrounding tissues. Furthermore, the red-shifted emission spectra of DiD allowed deep-tissue imaging in live animals and the labeling procedure caused no cytotoxic effects or functional damage to haMSCs. This approach has been shown to be an efficient tracking method for haMSCs in a rat KOA model. The application of this method could also be used to determine the optimal administration route and dosage of MSCs from other sources in pre-clinical studies.

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

This protocol describes an efficient way to monitor the cell persistence and biodistribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells (haMSCs) by far-red fluorescence labeling in a rat knee osteoarthritis (KOA) model via intra-articular (IA) injection.

In Vivo Tracking der menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen in einem Rattenmodell Knie Arthrose mit fluoreszierenden lipophile Membran Farbstoff

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms of retinitis pigmentosa (RP) and age-related macular degeneration (AMD). Cell therapy is one of the most promising therapeutic strategies proposed to cure these diseases, with already encouraging preliminary results in humans. However, the method of preparation of the graft has a significant impact on its functional outcomes in vivo. Indeed, RPE cells grafted as a cell suspension are less functional than the same cells transplanted as a retinal tissue. Herein, we describe a simple and reproducible method to engineer RPE tissue and its preparation for an in vivo implantation. RPE cells derived from human pluripotent stem cells are seeded on a biological support, the human amniotic membrane (hAM). Compared to artificial scaffolds, this support has the advantage of having a basement membrane that is close to the Bruch&#39;s membrane where endogenous RPE cells are attached. However, its manipulation is not easy, and we developed several strategies for its proper culturing and preparation for grafting in vivo.

We describe a method to engineer a retinal tissue composed of retinal pigment epithelial cells derived from human pluripotent stem cells cultured on top of human amniotic membranes and its preparation for grafting in animal models.

Engineering-Transplantation geeignet retinalen Pigment Epithel Gewebe abgeleitet aus humanen embryonalen Stammzellen

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis and visual clarity. Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived LESCs provide a promising cell source for corneal cell replacement therapy. Undefined, xenogeneic culture and differentiation conditions cause variation in research results and impede the clinical translation of hPSC-derived therapeutics. This protocol provides a reproducible and efficient method for hPSC-LESC differentiation under xeno- and feeder cell-free conditions. Firstly, monolayer culture of undifferentiated hPSC on recombinant laminin-521 (LN-521) and defined hPSC medium serves as a foundation for robust production of high-quality starting material for differentiations. Secondly, a rapid and simple hPSC-LESC differentiation method yields LESC populations in only 24 days. This method includes a four-day surface ectodermal induction in suspension with small molecules, followed by adherent culture phase on LN-521/collagen IV combination matrix in defined corneal epithelial differentiation medium. Cryostoring and extended differentiation further purifies the cell population and enables banking of the cells in large quantities for cell therapy products. The resulting high-quality hPSC-LESCs provide a potential novel treatment strategy for corneal surface reconstruction to treat limbal stem cell deficiency (LSCD).

This protocol introduces a simple two-step method for differentiating corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells under xeno- and feeder cell-free culture conditions. The cell culture methods presented here enable cost-efficient, large-scale production of clinical quality cells applicable to corneal cell therapy use.

Effiziente und skalierbare gerichtete Differenzierung von klinisch kompatibel Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Kultivierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen auf einem Ex Vivo Modell der alten menschlichen Bruch-Membran

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Optimierte