Die Autoren danken Dr. Isaac Zambrano und das Personal an der Manchester-Augenklinik Eye Bank für die Lieferung von menschlichen Spender Augengewebes, und Mr. Pete Walker der Fakultät für Lebenswissenschaften Histologie Anlage für die H &amp; E gefärbten Bildern erkennen. Besonderer Dank geht an Herrn Roger Meadows für seine Hilfe bei der Mikroskopie. SJC ist ein Empfänger einer Medical Research Council (MRC) Career Development Fellowship (MR / K024418 / 1), und die Autoren auch andere aktuelle Forschungsförderung von MRC (G0900538 und K004441) anzuerkennen, Fight for Sight (1866) und der Makula Society.

Menschliche Auge Gewebe zu Forschungszwecken eingewilligt wurde von der Manchester Königlichen Eye Hospital Eye Bank nach dem Entfernen der Hornhaut zur Transplantation erhalten. Die Verwendung von menschlichem Gewebe für die Forschung wurde in Übereinstimmung mit der Human Tissue Act (2004) Richtlinien, mit Zustimmung University Research Ethics Committee (Referenz 11305). 1. Anreicherung von Whole Bruch-Membran <ol><li> Reinigen Sie den Arbeitsbereich um und unter dem Binokular mit 1% Desinfektionsmittel (v / v) und dann wischen Sie mit 70% (v / v) Ethanol. </li><li> Achten Sie darauf, das Folgende zu Hand: eine neue Einweg-Skalpell, zwei sterilen Zellschaber (üblicherweise in Gewebekultur verwendet werden) und drei Paare von Pinzetten (hier als A, B, und C aufgeführt sind, siehe Materialliste). </li><li> Setzen Sie die Augenkugel in eine Einweg-Petrischale, Halten des Deckels für die spätere Verwendung. Mit Hilfe einer neuen Einweg-Skalpell, entfernen Sie alle Rest Sehnerv, die stören können mit der Erstellung einer flachen mount des Gewebes. Als nächstes stellen vier Schnitte gleichmäßig beabstandet um vier Quadranten zu erstellen, wenn Sie fortfahren, Teil 3 (Anreicherung von Makula Bruch-Membran) nicht durch die Makula-Region geschnitten. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die Einschnitte erstrecken sich durch die gesamte Tiefe des Augengewebes - vom innersten neurosensorischen Netzhaut (NSR), durch die Aderhaut und Lederhaut (Weiß des Auges). Fahren Sie den Einschnitt den ganzen Weg um das Auge von dem Rand der Augenmuschel des Sehnervs. Damit wird die Augenmuschel aus abgeflacht werden (siehe Abbildung 1B). </li></ol></li><li> Halten eines Quadranten des abgeflachten Augenmuschel mit Pinzette A (bis Aderhaut Ablösung zu verhindern), verwenden Sie den größeren Pinzette B zu greifen den Glaskörper und die zugrunde liegenden NSR und ziehen dieses Gewebe aus dem retinalen Pigmentepithel (RPE), beginnend an der Peripherie, Bewegung in Richtung Zentrum der geöffneten Augenmuschel und dann an der gegenüberliegenden Seite. In der Regel, aber nicht immer beide Glaskörper und NSR lösen als einer. Verwenden Sie die scalpel, um restliche NSR an der Papille verankert herauszuschneiden. </li><li> Wieder, während, einen Quadranten von Gewebe an Ort und Stelle mit Pinzette A, verwenden Sie den sterilen Zellschaber, um sanft zu entfernen die RPE-Monoschicht von der gesamten Innenfläche der Augenmuschel. Diese Zellen leicht lösen und als dunkelbraun pigmentierter Klumpen zu sehen. Spülen mit PBS vorsichtig waschen weg verdrängt RPE-Zellen aus der Augenmuschel. </li><li> Als Nächstes verwenden Pinzette A vorsichtig schälen die darüber liegende dunkelrote Gewebe (die sowohl Bruch-Membran und der Aderhaut) von allen 4 Quadranten Auge. Legen Sie die ausgeschnittenen Gewebe in eine saubere Schüssel. </li><li> Unter Verwendung der abgeflachten Kante von einem Zellschaber, um die herausgeschnittenen Gewebe in Position zu halten, verwenden Sie die zweite Schaber, um sanft kratzen das Gewebe. Drehen Sie das Gewebe über und wiederholen, die Beseitigung so viel überschüssiges Material wie möglich. Schließlich wird eine lichtdurchlässige Membran bleibt: dies ist die grob angereicherten Bruchmembran. Die Verwendung des Präpariermikroskop bei einem Minimum von 20-facher Vergrößerung istunerlässlich bei der Unterstützung der Entfernung der Aderhaut und Bereicherung der Bruch-Membran. </li><li> Mit einer Pasteurpipette, kurz die Bruch-Membran mit ultrareinem Wasser spülen, um Restaderhaut und Blut, bevor die Membran in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zu entfernen. </li><li> Hängen Sie das angereicherte Bruch-Membran in etwa 1 ml Reinstwasser und kurz vortexen (ca. 15 sec) zu helfen, zu lysieren keine verunreinigenden Zellsubstanz (siehe Abbildung 2). Zentrifugieren Sie die Probe bei 500 xg für 30 Sekunden, um die Membran zu pelletieren und absaugen des Überstandes. Hinweis: Die verbleibenden bereichert Bruch-Membran ist nun bereit für die Solubilisierung oder Lagerung bei -80 ° C für die spätere Verwendung (wie in Abschnitt 2 unten beschrieben). </li></ol> 2. Solubilisierung von Whole Enriched Bruch-Membran und Western Blot-Analyse <ol><li> Extrahieren Sie Protein aus angereicherten Bruch-Membran durch Eintauchen des Gewebes in 500 ul 8 M urea für 6 h bei RT in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (3A). </li><li> Zentrifuge solubilisierten Proben bei 10.000 × g für 10 min, um alle verbleibenden extrazellulären Materie zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und überträgt es auf 3.500 Da MWCO Dialysemembran, dann legen Sie die Probe in 1 l PBS zu 16 Stunden bei 4 ° C dialysiert. </li><li> Für jede Probe werden 40 ul der Proteinisolierung Perlen, und drehen Probe / Perlenmix (20 UpM auf einer rotierenden Mischer) bei RT für 30 min. </li><li> Zentrifuge Proben bei 10.000 × g für 5 min pelletiert der Wülste. Überstand abnehmen und solubilisieren Proteins an Kügelchen gebunden in 30 ul 2x Probenbeladungspuffer (65,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,1% SDS, 26,3% (w / v) Glycerol, 0,01% Bromphenolblau, 3% β-Mercaptoethanol). </li><li> Inkubieren der Proben bei 100 ° C für 10 min und dann bei 10.000 × g für 5 Minuten zentrifugiert werden, um die verbleibenden Kügelchen zu pelletieren. </li><li> Laden der Überstand, der die freigesetzten Proteine ​​auf einen vorgegossenen enthält SDS-Seite Gradienten-Gel (siehe Materialliste) zur Proteintrennung. </li><li> Visualisieren getrennten Proteinbanden mit einem gemeinsamen Färbeprotokoll zB Coomassie-Blau. <ol><li> Kurz gesagt, 20 ml des strahlend blauen Fleck (0,1% Brilliantblau (w / v), 50% Methanol, 10% Essigsäure, 40% Wasser) auf das Gel, und Inkubation für 30 min bei RT unter leichtem Schütteln . </li><li> Entsorgen Sie die Farblösung und waschen Sie die gefärbten Gels mit entionisiertem Wasser, bis die Hintergrundfärbung ausreichend reduziert, um Buntproteinbande Visualisierung zu ermöglichen. </li><li> Alternativ Übertragung getrennt Proteinbanden auf Nitrocellulose für die Western-Analyse, wie unten beschrieben. </li></ol></li><li> Übertragungs getrennt Proteinbanden auf Nitrocellulosemembran bei 80 mA für 2,5 h unter Verwendung halbtrockenen Übertragungsvorrichtung in Transferpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 10% [v / v] Methanol). </li><li> Blockieren der Membran in 10 ml PBS, 10% (w / v) Milch und 0,02% (w / v) BSA für 16 Stunden bei 4 ° C vor the Zugabe der gewünschten primären Antikörper zum Nachweis von Proteinen. Hinweis: Als Beispiel hier zeigt 3C einen repräsentativen Immunoblot solubilisiert Bruch-Membran aus drei verschiedenen Spendern untersucht für einen Regler der Komplementkaskade, Faktor H-like protein 1 (FHL-1). </li></ol> 3. Anreicherung von Makula-Bruch-Membran <ol><li> Führen Sie die Schritte 1,1 bis 1,3, wie zuvor beschrieben. </li><li> Während die NSR noch vorhanden ist, suchen Sie die gelbe Fovea-Färbung, die das zentrale Makula-Bereich (siehe Abbildung 4) darstellt. Mit einem sterilen 6 mm Stanzbiopsie, legen Sie sie über der fovealen Region und fest schneiden in der Makula. <ol><li> Halten die Biopsie-Stanze an Ort und Stelle, stellen Sie eine separate Inzision mit einem Skalpell aus dem Rand der Augenmuschel an den Rand der Biopsie Stanzmesser, und dann mit Pinzette B, abziehen der umgebenden Augenmaterial, um einen sauberen Biopsie zu erreichen. </li></ol></li><li> Verwendung Pinzette C, zu entfernendie 6-mm-Scheibe von Gewebe aus dem Stempel und auf den sauberen Petrischale Deckel. Legen Sie die Petrischale Deckel und Makula-Punch unter dem Binokular. </li><li> Entfernen Sie die dünne NSR Scheibe (nach gelben Fovea-Färbung, um die Genauigkeit der Biopsie entnehmen). Verwenden Sie eine sterile Zellschaber zur schonenden Entfernung der RPE-Zellen. </li><li> Sichern Sie die Makula-Disk über der Lederhaut mit den Spitzen der Pinzette ein, und langsam ziehen Sie die Aderhaut und der Bruch-Membran-Komplex mit Pinzetten C. Auch hier verwenden Sie den Zellschaber, um unerwünschte Aderhaut und Blutstoffe aus Bruch-Membran zu entfernen. </li><li> Legen Sie die Makula-Bruch-Membran in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Aussetzung in 1 ml ultrareinem Wasser. Vortex kurz (ca. 15 sec) zu helfen, zu lysieren keine verunreinigenden Zellsubstanz. Zentrifugieren Sie die Probe bei 500 xg für 30 Sekunden, um die Membran zu pelletieren und absaugen des Überstandes. Hinweis: Das angereicherte Bruch-Membran von der Makula isoliert kann jetzt verwendet werden, ein Proteom-alysis mit bevorzugten Verdauung Protokollen des Benutzers. </li></ol>

<ol>
	<li>Coleman, H. R., Chan, C. -. C., Ferris, F. L., Chew, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration.">Age-related macular degeneration.</a> Lancet. 372, 1835-1845 (2008).</li><li>Wong, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence+of+age-related+macular+degeneration+and+disease+burden+projection+for+2020+and+2040:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: A systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Glob Health. 2 (2), e106-e116 (2014).</li><li>Coleman, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+age-related+macular+degeneration+on+vision-specific+quality+of+life:+Follow-up+from+the+10-year+and+15-year+visits+of+the+study+of+osteoporotic+fractures.">Impact of age-related macular degeneration on vision-specific quality of life: Follow-up from the 10-year and 15-year visits of the study of osteoporotic fractures.</a> Am J Ophthalmol. 150 (5), 683-691 (2010).</li><li>Hageman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+haplotype+in+the+complement+regulatory+gene+factor+H+(HF1/CFH)+predisposes+individuals+to+age-related+macular+degeneration.">A common haplotype in the complement regulatory gene factor H (HF1/CFH) predisposes individuals to age-related macular degeneration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (20), 7227-7232 (2005).</li><li>Klein, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+factor+H+polymorphism+in+age-related+macular+degeneration.">Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 385-389 (2005).</li><li>Haines, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+factor+H+variant+increases+the+risk+of+age-related+macular+degeneration.">Complement factor H variant increases the risk of age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 419-421 (2005).</li><li>Edwards, A. O., Ritter, R., Abel, K. J., Manning, A., Panhuysen, C., Farrer, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+factor+H+polymorphism+and+age-related+macular+degeneration.">Complement factor H polymorphism and age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 421-424 (2005).</li><li>Fritsche, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+new+loci+associated+with+age-related+macular+degeneration.">Seven new loci associated with age-related macular degeneration.</a> Nat Genet. 45 (4), 433-439 (2013).</li><li>Clark, S., Bishop, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Factor+H+and+Related+Proteins+in+Regulating+Complement+Activation+in+the+Macula,+and+Relevance+to+Age-Related+Macular+Degeneration.">Role of Factor H and Related Proteins in Regulating Complement Activation in the Macula, and Relevance to Age-Related Macular Degeneration.</a> J Clin Med. 4 (1), 18-31 (2014).</li><li>Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+nature+of+Bruch&#8217;s+membrane.">The dynamic nature of Bruch&#8217;s membrane.</a> Prog Retin Eye Res. 29 (1), 1-18 (2010).</li><li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+factor+H-like+protein+1+as+the+predominant+complement+regulator+in+Bruch&#8217;s+membrane:+implications+for+age-related+macular+degeneration.">Identification of factor H-like protein 1 as the predominant complement regulator in Bruch&#8217;s membrane: implications for age-related macular degeneration.</a> J Immunol. 193 (10), 4962-4970 (2014).</li><li>Sim, E., Palmer, M. S., Puklavec, M., Sim, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+the+complement+control+protein+factor+H+(beta+1+H).">Monoclonal antibodies against the complement control protein factor H (beta 1 H).</a> Biosci Rep. 3 (12), 1119-1131 (1983).</li><li>Ripoche, J., Day, A. J., Harris, T. J., Sim, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+amino+acid+sequence+of+human+complement+factor+H.">The complete amino acid sequence of human complement factor H.</a> Biochem J. 249 (2), 593-602 (1988).</li><li>Moore, D. J., Clover, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+age+on+the+macromolecular+permeability+of+human+Bruch&#8217;s+membrane.">The effect of age on the macromolecular permeability of human Bruch&#8217;s membrane.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. I. 42 (12), 2970-2975 (2001).</li><li>McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration+and+the+role+of+the+complement+system.">Age-related macular degeneration and the role of the complement system.</a> Mol Immunol. 67 (1), 43-50 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Hier beschreiben wir die Bereicherung der Bruch-Membran für die weitere Analyse ermöglicht nachfolgenden Analysen einschließlich Western-Blot 11, Massenspektrometrie und die Diffusionseigenschaften der Bruch-Membran unter Verwendung von modifizierten Ussing-Kammern 11,14. Kritischer Schritte umfassen a) die gründliche Abschaben und Waschen der inneren Oberfläche des Auges um alle RPE-Zellen b) die wiederholte und vorsichtiges Abkratzen der darunterliegenden Aderhaut, ohne dass das Bruch-zu zerfallen zu entfernen, und c) Waschen des entfernten Bruch&#39;sche in Reinstwasser zur Lyse von Rest Zellen sicherzustellen. Außerdem, wenn der Bruch-Membran angereichert ist, für Proteomanalyse verwendet werden, Proteinextraktion durch die Harnstoff-Behandlung ist am wirksamsten in der Aufteilung dieses elastischen Gewebes im Vergleich zu anderen Verfahren, wie mechanische Homogenisierung. Histologie von angereichertem Bruch-Membran zeigt das ECM des Choriokapillaris nicht entfernt. Dies ist ex seinsichtlichen als äußere Schicht der pentilaminar Bruch-Membran wird durch Choriokapillaris Endothelzellen Basalmembranen gebildet. Tatsächlich kann es vorteilhaft sein, dass das ECM des Choriokapillaris bleibt als Änderungen dies auftreten in AMD einschließlich der Ablagerung von terminalen Komplementkomplex / Membran-Angriffskomplex (MAC) 15. Es sollte beachtet werden, dass für eine detaillierte histologische Analyse der Bruch-Membran, ihre Struktur besser erhalten, wenn in Gegenwart von der Sklera, Aderhaut, und Bruch-Membran geschnitten werden kann. Tatsächlich ist die Histologie in 2 präsentiert ausschließlich zur Deckung der Anreicherungsgrad von der in dieser Handschrift beschriebenen Technik resultierenden demonstrieren. Anreicherung von Makula Bruchs erfordert eine sorgfältige Präparation der Augenmuschel, sicherzustellen, dass der NSR und insbesondere die Fovea nicht beschädigt werden; andernfalls Identifikation und somit die Isolierung des Makula nicht möglich. Die Integrität der tissue ist auch wichtig, zu diesem Prozess und es wird daher empfohlen, alle Proben unter 48 Stunden post mortem Zeit verwendet werden. Der Grad der Anreicherung erforderlich variiert zwischen Gebern und durch Spenderalter, Post-mortem-Zeit, und die Anwesenheit von jedem Auge Pathologie betroffen sein. Die Verwendung des Begriffs angereichert ist gewollt in Anerkennung einer Einschränkung der Technik, wobei dies, dass &quot;Reinigung&quot; oder &quot;Trennung&quot; der Bruch-Membran mit dieser Methode ist einfach nicht möglich. Aufgrund der Tatsache, dass der ECM des Choriokapillaris geht in Bruch-Membran gibt es eine vollständige Trennung nicht möglich ist. Das Verständnis der biochemischen Veränderungen der jeweiligen Augengewebe ist von wesentlicher Bedeutung für das Verständnis Augenfortschreiten der Krankheit. Diese einzigartige Bereicherung der Bruch-Membran erleichtert dieses Verständnis; laufende Studien untersuchen das Proteom von angereichertem Makula-Bruch-Membran unter Verwendung von Massenspektrometrie in verschiedenen Stadien der AMDund in Proben von Patienten mit verschiedenen Genotypen Ursprung um das Verständnis der molekularen Pathologie von AMD zu verbessern. Bereits die hier beschriebene Technik wurde verwendet, um FHL-1 erfolgreich zu identifizieren als die vorherrschende Ergänzung Regler in Membran 11 und weitere Studien Bruchs auf angereicherten Bruch-Membran sind wahrscheinlich in mehr neue Einblicke in die molekulare Pathologie von AMD führen.

Der Einsatz von post mortem menschliche Auge Gewebe in der Augenforschung ist eine unschätzbare Ressource für das Verständnis der Pathogenese Augenkrankheit. Analyse von menschlichen Spenderaugen hat wichtige Beiträge, um die Mechanismen zugrunde altersbedingten Makuladegeneration (AMD), die die Hauptursache für Erblindung in der westlichen Welt 1 anspruchsvollen gemacht. Weltweit entfallen AMD für rund 8,7% aller Blindheit und mit einer zunehmend alternden Bevölkerung wird vorhergesagt, bis 196 Millionen Menschen bis zum Jahr 2020 2. AMD führt zum Verlust des zentralen Sehvermögens beeinträchtigen und hat eine tief greifende Auswirkungen auf die Patienten Unabhängigkeit und Lebensqualität 3. Frühen AMD wird durch die Bildung von Drusen gekennzeichnet und es kann zu geographische Atrophie (manchmal als &quot;trockene&quot; AMD bezeichnet) oder CNV (auch als neovaskulären oder &quot;nasse&quot; AMD bezeichnet) fortschreiten. Während Anti-VEGF-Injektionen können stabilisieren oder Sehvermögen von neovaskulärer AMD es is nicht heilende und derzeit für geographische Atrophie existiert keine Behandlung. Während bestimmte genetische Varianten haben gezeigt, dass AMD Risiko 4 ändern - 8 wird weniger darüber, wie diese Varianten beeinflussen die Makula bei einer biochemischen Ebene bekannt. Ein wichtiger Standort in AMD Pathogenese ist der Bruch-Membran. Drusen Form innerhalb dieser Struktur und verschiedene Studien haben Beweise der Komplementaktivierung in und um Bruch-Membran in AMD 9 vorgesehen. Bruch-Membran ist ein Blatt von der extrazellulären Matrix, die die retinale Pigmentepithel (RPE) Zellen aus der Aderhaut trennt, und ist etwa 4 &amp; mgr; m dick. Bruch-Membran geht in die Aderhaut, einer Schicht aus der Aderhaut, die gefensterte Kapillaren und extern zu diesem enthält, sind Schichten mit größeren Blutgefäße 10 (Figur 1A). Bruch-Membran ist ein pentilaminar Blatt Extrazellulären Matrix (ECM), und diese Methode beschreibt, wie der Bruch-Membran zu isolieren, zusammen mit der ECM der zugrunde liegenden Choriokapillaris (nachfolgend bezeichnet Bruch-Membran angereichert), die weitgehend dezellularisierte und frei von roten Blutkörperchen ist. Enriched Bruch-Membran wurde dann für die Western-Blot und Histologie Experimente verwendet. Weiterhin Methode zur Anreicherung der Bruch-Membran allein aus der Makula Bereich des Auges beschrieben, die von besonderem Interesse für die Untersuchung der biochemischen Aspekte des AMD sein wird.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Auxillary objective 0.5x</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>3638</td>
			<td>Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch 6mm</td>
			<td>Oncall Medical Supplies</td>
			<td>SCH-33-36</td>
			<td>6mm Biopsy Punches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.183</td>
			<td>For membrane enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyroPure Cyrovials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12387999</td>
			<td>Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>0153</td>
			<td>Flexible light source essential for dissection and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(A) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4280</td>
			<td>(A) Fine (100mm) and straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(B) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4272</td>
			<td>(B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(C) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4323</td>
			<td>(C) Straight fine points</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>G1345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GXCAM 5 digital colour camera &#38; GT-Vision software</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>90mm, used as a dish for samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein isolation beads (Strataclean resin)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400714-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x)</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>5595</td>
			<td>Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of bruch's membrane from human donor eyes

Altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine führende Ursache für Sehbehinderung in der entwickelten Welt. Die Krankheit manifestiert sich durch die Zerstörung der Mitte der Retina, Makula genannt, was zum Verlust der zentralen Sehschärfe. Frühen AMD ist durch die Anwesenheit von kleinen, gelblichen Läsionen genannt weiche Drusen, dass der Fortschritt auf späten AMD wie geographische Atrophie (trockene AMD) oder Gefäßneubildung (feuchte AMD) gekennzeichnet. Obwohl die klinischen Veränderungen sind gut beschrieben, und das Verständnis der genetischen Einflüsse auf verleiht AMD Risiko werden immer detaillierter, ist ein Bereich, fehlen wichtige Fortschritte das Verständnis der biochemischen Auswirkungen der genetischen Risiko. Dies ist teilweise auf Grund von Schwierigkeiten beim Verständnis der Biochemie der Bruch-Membran, einer sehr dünnen extrazellulären Matrix, als biologischer Filter von Material von der Durchblutung und ein Gerüst, auf dem retinalen Pigmentepithel (RPE) Zellmonoschicht liegt dient. Drusen form im Bruch-Membran und ihre Anwesenheit stört Nährstofffluss in den RPE-Zellen. Nur durch die Untersuchung der Proteinzusammensetzung der Bruch-Membran, und in der Tat, wie andere Proteine ​​mit ihm interagieren, können die Forscher hoffen, dass die biochemischen Mechanismen zugrunde Drusen Bildung, Entwicklung von AMD und anschließende Verlust der Sehkraft zu entwirren. Dieses Papier Details Methoden zur Anreicherung von entweder ganzen Bruch-Membran, oder einfach von der Makula Region, so dass es für nachfolgende biochemische Analyse verwendet werden, und Beispiele dafür, wie diese ändert sich bereits das Verständnis der Bruch-Membran Biochemie.

Das oben beschriebene Protokoll zur Membran Ergebnisse Bruchs bereichert in der Isolierung des Bruch-Membran, der ECM des Choriokapillaris produzieren und entfernt die meisten der Zellen / Zelltrümmer einschließlich all des RPE (Abbildung 2). Das Waschen der angereicherten Bruch-Membran in Wasser ist ein wichtiger Schritt in Lyse alle verbleibenden Aderhautzellen. Die während der Verschrottung der Aderhaut ausgeübte Druck scheint eine der wenigen verbliebenen Zellkerne in den definiert als Bruch-Membran (2B) Region verdichten. Die Solubilisierung von angereichertem Bruch-Membran ermöglicht die nachgeschaltete Analyse der Proteingehalt. Die Trennung von Proteinbanden von solubilisierten angereichert Bruch-Membran unter Verwendung einer 4-12% -Gradienten-SDS-PAGE-Gel, während nicht nützlich in seinem eigenen Recht um den Proteingehalt zu ermitteln, tut zeigen die Fähigkeit dieser Technik, um verunreinigende Proteine, Blut ar minimierene unspezifisch gebundene (3B). In dieser Hinsicht ist eine bemerkenswerte Brief aus dem Proteingel Lauf ist eine beträchtliche Gruppe von Humanserumalbumin (~ 66 kDa), die sonst machen können anschließenden Western-Blot schwieriger zu interpretieren: Die histologische Analyse von angereichertem Bruch-Membran in Abbildung 2 auch Stützen Dies. Tatsächlich als Teil des Arbeits zuvor beschriebenen 11, solubilisiert Bruch-Membran aus einer Serie von einzelnen Spendern wurden für eine Reihe von Proteinen mit spezifischen Antikörpern mittels Western Blot (Figur 3C) sondiert. In dem hier gezeigten Fall ein Antikörper (bezeichnet OX23) 12 gegen ein 155 kDa Regulator der angeborenen Immunität gerichtet, genannt Komplementfaktor H (FH), verwendet wurde, und zeigte die Anwesenheit eines unteren molekulare Bande in der Bruch-Membran-Proben von drei getrennten Spender (3C). Diese anschließend stellte sich heraus, Faktor H-like protein 1 sein (FHL-1)Der 49 kDa-Proteins an FH ergeben und von einem Spleiß Variation des gleichen Gens 13. FHL-1 scheint in der Bruch-Membran 11 die Haupt vorliegenden Ergänzung Regler sein. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig1.jpg" /> Abbildung 1. Dissection des menschlichen Auges und Anreicherung der Bruch-Membran. (A) Bruch-Membran ist eine extrazelluläre Matrix-Schranke. Die Aderhaut enthält eine Schicht aus gefensterten Kapillaren, die kontinuierlich in der Bruch-Membran verschmelzen (das so genannte Choriokapillaris) und diese zu trennen den Rest der Aderhaut (die großen Blutgefäße) aus dem retinalen Pigmentepithel (RPE) Zellschicht, die physiologisch unterstützt die Photorezeptorzellen der neurosensorischen Netzhaut (NSR). (B) Vier Einschnitte in den menschlichen Augenmuschel gemacht so dass sie geöffnet werden, um eine flache Halterung zu schaffen. DasGlaskörper können bei der Verwendung von Pinzetten entfernt werden. Der NSR kann off zusammen mit dem Glaskörper, sind aber auch mit einer Pinzette entfernt werden. Einem Zellschaber verwendet, um die RPE-Zellschicht von Bruch-Membran zu entfernen, während es noch an der Aderhaut und der Sklera verankert. Der Bruch-Membran / Choroidea Komplex kann von der Lederhaut abgeschält werden und mit einer neuen Zellschaber kann die äußere Choroidea entfernt werden. Eine letzte Waschung in ultrareinem Wasser lysiert restliche Zellmaterial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig2.jpg" /> Abbildung 2. Histologie der Bruch-Membran und der Aderhaut. H &amp; E-gefärbten Schnitten vor (A) und nach (B) Abschaben der äußeren Aderhautstrukturen aus Bruch-Membran und Waschen in ultrareinem water angereichert Bruch-Membran zu erzeugen. Skalenbalken stellen 20 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig3.jpg" /> Abbildung 3 Solubilisierung Enriched Bruch-Membran für Protein Content Analysis. (A) Protein kann aus angereichertem Bruch-Membran durch Inkubation in 8 M Harnstoff für 6 h bei RT extrahiert werden, bevor sie gegen PBS dialysiert. Für Western-Analyse, können Proteine, die aus der ganzen Bruch-Membran Dialysat mit Proteinisolierung Perlen isoliert und eluiert durch Kochen mit Laemmli-reduzierendem Probenladepuffer. (B) Ein Vertreter Coomassie-Blau gefärbten SDS-PAGE-Gel, das sowohl saubere und verwässert Bruch-Membran solubilisiert (BM) mit der Methode d. in (A) escribed (C) Eine repräsentative Western Blot von solubilisiert Bruch-Membran aus 3 einzelnen Spendern (Spuren 1-3). für Faktor H-like protein 1 (FHL-1) sondiert <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen diese Figur.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig4.jpg" /> Figur 4. Isolierung von angereichertem Bruch-Membran von der Makula. Die Makula Bereich der Netzhaut ist ein 5 mm-Bereich, die sich leicht durch die Gelbfärbung der überlagernden Fovea identifiziert werden kann, und die Nähe zu der benachbarten Papille. Unter Verwendung der Fovea als Leitfaden, legen Sie ein 6 mm Biopsie-Stanze auf der flachen montiert menschliche Auge, um eine 6 mm Makula Gewebeblock herauszuschneiden. Entfernen Sie die darüberliegenden NSR und abkratzen RPE-Zellen aus dem herausgeschnittenen Makula. Die übrigen Bruch-Membran / Aderhaut-Komplex kann dien von der Lederhaut schälen und gründlich abgekratzt, um Aderhaut zu entfernen, lysieren restlichen Zellmaterial durch Eintauchen in ultrareines Wasser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

Identifying proteins specifically associated with Bruch&#8217;s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

Bereicherung der Bruch-Membran von menschlichen Spender Augen

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.0K Aufrufe.  University of Manchester. Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

Serie: Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been generally adopted to study the nature of neural stem cells, including those derived from normal and tumorous tissues. However, appreciable amounts of differentiation and cell death are common in cultured neurospheres likely due to sub-optimal condition such as accessibility of all cells within sphere aggregates to culture medium.
Medulloblastoma, the most common pediatric CNS tumor, is characterized by its rapid progression and tendency to spread along the entire brain-spinal axis with dismal clinical outcome. Medulloblastoma is a neuroepithelial tumor of the cerebellum, accounting for 20% and 40% of intracranial and posterior fossa tumor in childhood, respectively1. It is now well established that Shh signaling stimulates proliferation of cerebellar granule neuron precursors (CGNPs) during cerebellar development 2-4. Numerous studies using mouse models, in which the Shh pathway is constitutively activated, have linked Shh signaling with medulloblastoma 5-9.
A recent report has shown that a subset of medulloblastoma cells derived from Patched1LacZ/+ mice are cancer stem cells, which are capable of initiating and propogating tumors 10. Here we describe an efficient method to isolate, enrich and maintain tumor stem cells derived from several mouse models of medulloblastoma, with constitutively activated Shh pathway due to a mutation in Smoothened (11, hereon referred as SmoM2), a GPCR that is critical for Shh pathway activation. In every isolated medulloblastoma tissue, we were able to establish numerous highly proliferative colonies. These cells robustly expressed several neural stem cell markers such as Nestin and Sox2, can undergo serial passages (greater than 20) and were clonogenic. While these cultured tumor stem cells were relatively small, often bipoar with high nuclear to cytoplasmic ratio when cultured under conditions favoring stem cell growth, they dramatically altered their morphology, extended multiple cellular processes, flattened and withdrew from the cell cycle upon switching to a cell culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum. More importantly, these tumor stem cells differentiated into Tuj1+ or NeuN+ neurons, GFAP+ astrocytes and CNPase+ oligodendrocytes, thus highlighting their multi-potency. Furthermore, these cells were capable of propagating secondary medulloblastomas when orthotopically transplanted into host mice.

This protocol describes the isolation, enrichment, and maintenance of medulloblastoma tumor stem cells derived from mutant mice with ectopic Sonic hedgehog pathway activity.

Isolation, Anreicherung und Pflege von Medulloblastom Stem Cells

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been ...

Forschung

Neurowissenschaften

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

Generierung von neuralen Stammzellen aus menschlichen Föten Ausrangierte Rindengewebe

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell lineage development. In vitro expansion of neural progenitors from fetal CNS tissue has been well characterized. Despite the identification and isolation of glial progenitors from adult human sub-cortical white matter and development of various culture conditions to direct differentiation of fetal neural progenitors into myelin producing oligodendrocytes, acquiring sufficient human oligodendrocytes for in vitro experimentation remains difficult. Differentiation of galactocerebroside+ (GalC) and O4+ oligodendrocyte precursor or progenitor cells (OPC) from neural precursor cells has been reported using second trimester fetal brain. However, these cells do not proliferate in the absence of support cells including astrocytes and neurons, and are lost quickly over time in culture. The need remains for a culture system to produce cells of the oligodendrocyte lineage suitable for in vitro experimentation.
Culture of primary human oligodendrocytes could, for example, be a useful model to study the pathogenesis of neurotropic infectious agents like the human polyomavirus, JCV, that in vivo infects those cells. These cultured cells could also provide models of other demyelinating diseases of the central nervous system (CNS). Primary, human fetal brain-derived, multipotential neural progenitor cells proliferate in vitro while maintaining the capacity to differentiate into neurons (progenitor-derived neurons, PDN) and astrocytes (progenitor-derived astrocytes, PDA) This study shows that neural progenitors can be induced to differentiate through many of the stages of oligodendrocytic lineage development (progenitor-derived oligodendrocytes, PDO). We culture neural progenitor cells in DMEM-F12 serum-free media supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet derived growth factor (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), neurotrophic factor 3 (NT-3), N-2 and triiodothyronine (T3). The cultured cells are passaged at 2.5e6 cells per 75cm flasks approximately every seven days. Using these conditions, the majority of the cells in culture maintain a morphology characterized by few processes and express markers of pre-oligodendrocyte cells, such as A2B5 and O-4. When we remove the four growth factors (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) and add conditioned media from PDN, the cells start to acquire more processes and express markers specific of oligodendrocyte differentiation, such as GalC and myelin basic protein (MBP). We performed phenotypic characterization using multicolor flow cytometry to identify unique markers of oligodendrocyte.

Primary, human fetal brain-derived, multipotential progenitor cells proliferate in vitro while maintaining the capacity to differentiate into neurons and astrocytes. This work shows that neural progenitors can be induced to differentiate through stages of the oligodendrocytic lineage by conditioning with select growth factors.

Progenitor-abgeleiteten Oligodendrozyten Culture System von Human Fetal Gehirn

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

Die Spezifikation der telencephalen glutamatergen Neuronen von menschlichen pluripotenten Stammzellen

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

Regie dopaminergen Neuron Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of Parkinson&#39;s disease is not pathologically confirmed in up to 25% of clinically diagnosed Parkinson&#39;s disease. Therefore, tissue collected from clinically diagnosed patients with idiopathic Parkinson&#39;s disease can have a high rate of misdiagnosis; hence in vitro studies from such tissues to study Parkinson&#39;s disease as a preclinical model can become futile.
By collecting postmortem human leptomeninges with a confirmed neuropathological diagnosis of Parkinson&#39;s disease and characterized by nigrostriatal cell loss and intracellular protein inclusions called Lewy bodies, one can be certain that clinically observed parkinsonism is not caused by another underlying disease process (e.g. tumor, arteriosclerosis).
This protocol presents the dissection and preparation of postmortem human leptomeninges for derivation of a meningeal fibroblast culture. This procedure is robust and has a high success rate. The challenge of the culture is sterility as the brain procurement is generally not performed under sterile conditions. Therefore, it is important to supplement the culture media with a cocktail of penicillin, streptomycin, and amphotericin B.
The derivation of meningeal fibroblasts from autopsy-confirmed cases with Parkinson&#39;s disease provides the foundation for in vitro modeling of Parkinson&#39;s disease. Meningeal fibroblasts appear 3-9 days after sample preparation and about 20-30 million cells can be cryopreserved in 6-8 weeks. The meningeal fibroblast culture is homogenous and the cells express fibronectin, a commonly used marker to identify meninges.

The leptomeninges explant culture protocol from human postmortem brain is a technically robust and simple way to derive fibronectin-positive meningeal fibroblasts within 6-8 weeks and cryopreserve approximately 20-30 million cells.

Ableitung von Leptomeningen Explantation Kulturen von Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Entwicklung eines raffinierten Protokolls für Trans-skleralen subretinalen Transplantation von menschlichen retinalen Pigment Epithelzellen in Ratte Augen

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

Isolierung der zerebralen Kapillaren aus frischem menschlichen Hirngewebe

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...