Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH DK32083, JDRF Grant 2-SRA-2015-51-Q-R zu gewähren.

1. Puffer Vorbereitung
<ol><li>Puffer (2 X PBS, pH 7,9) Beschriftung: In 400 mL entionisiertem Wasser (DD), 100 mL 10 X PBS hinzugeben, pH bis 7,9 mit NaOH einstellen.</li>
	<li>3 mM von Biotin: 1 mg Biotin in 588 µL Puffer Kennzeichnung zu lösen.</li>
	<li>3 mM von Sulfo-Tag: auflösen 150 Nmol Sulfo-Tags in 50 µL Puffer bezeichnen.</li>
	<li>Antigen-Puffer (5 % BSA): In 500 mL 1 X PBS, 25 g des Bovine Serum Albumin (BSA) hinzufügen.</li>
	<li>0,5 M Essigsäure Lösung ansetzen.</li>
	<li>1,0 M Tris-HCl-Puffer pH 9.0: bereiten Sie 1 M Tris-HCl-Puffer, und passen Sie pH bis 9.0 mit HCl.</li>
	<li>Beschichtung-Puffer (3 % Blocker A): In 500 mL 1 X PBS, 15 g Blocker A. hinzufügen</li>
	<li>Waschen-Puffer (0,05 % Tween 20, PBST): In 5000 mL 1 X PBS, 2,5 mL Tween 20 hinzugeben.</li>
	<li>Lesung-Puffer (2 x lesen Puffer T mit Tensid): Add-in DD-Wasser 500 mL, 500 mL 4 x lesen Puffer T mit Tensid (Table of Materials).</li>
	<li>Lagern Sie Biotin und Sulfo-Tag in einem Gefrierschrank-20 ° C. Hinweis: Beide Biotin und Sulfo-Tag Lösungen sollte immer frisch zubereitet werden, kurz vor der Kennzeichnung Verfahren.</li>
</ol>2. Bezeichnung der menschlichen Inselchen Autoantigen mit Biotin und Sulfo-tag
Hinweis: Eine hohe Konzentration des Antigens, ≥0.5 mg/mL, empfiehlt sich für eine effizientere Kennzeichnung Reaktion.
<ol><li>Bestimmen Sie das molare Verhältnis von menschlichen Inselchen Autoantigen für Biotin und Sulfo-Tag.<ol>
<li>Erhalten Sie die Antigen molare Zahl dividiert das Antigen Gewicht durch das Molekulargewicht.</li>
		<li>Verwenden Sie das molare Verhältnis von 1:5 für das Antigen mit kleineren Molekulargewicht (≤10 kd) und das molare Verhältnis von 01:20 für das Antigen mit größeren Molekulargewicht (> 50 kd).</li>
		<li>Berechnen Sie das Volumen für Biotin oder Sulfo-Tag, indem Sie die molare Anzahl durch seine Konzentration.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mischen Sie die menschliche Inselchen Autoantigen mit Biotin oder Sulfo-Tag mit das molare Verhältnis von 1:5. Hinweis: Das Protein in Tris oder Glycin Puffer-Systemen ausgetauscht werden, 2 x PBS-Puffer mit pH 7,9 mit der Dimensionierung Spin Spalte.</li>
	<li>Da Biotin und Sulfo-Tag lichtempfindlich sind, decken Sie die Reaktionsgefäße mit Alu-Folie. Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur (RT) für 1 h.</li>
	<li>Während der Inkubation die Spin-Spalte prime durch Abgabe 2 x PBS-Puffer in der Spalte dreimal. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 1000 X g 2 min. lang jedes Mal. Hinweis: Derzeit die Kennzeichnung Reaktion durch Überbrückung, vollzieht sich immer noch und muss gestoppt werden.</li>
	<li>Stoppen Sie die Kennzeichnung Reaktion durch die Reinigung der beschriftete menschliche Inselchen Autoantigen. Zu reinigen, passieren Sie die Autoantigen durch die Spin-Spalte und Zentrifugieren Sie die Spalte bei 1000 X g für 2 min.</li>
	<li>Die beschriftete Antigenkonzentration (µg/µL) mit der Menge an Antigen-Protein und das Endvolumen zu bestimmen. Hinweis: Rund, es werden 90-95 % Beibehaltung der beschriftete Antigen nach jedem Spin-Spalte übergeben.</li>
	<li>Aliquoten das beschriftete Antigen und Store beschriftete Antigen bei-80 ° C.</li>
</ol>3. definieren Sie die besten Konzentrationen und Kennzahlen für die zwei beschriftete Antigene für den Assay (Checker Board Assay)
<ol><li>Bereiten Sie zwei Serumproben, eine hohe Positive und eine negative, mit einem Gesamtvolumen von 200 µL für jeden.</li>
	<li>Aliquoten 4 µL Serum und 1 X PBS hinzufügen, bis der letzte Band 20 µL pro Bohrloch für eine 96-Well-PCR-Platte ist. Verwenden Sie die Hälfte einer Platte für die hohe positive Probe und die andere Hälfte für das negativ-Beispiel, wie in Abbildung 2Agezeigt.</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL von Biotin und 10 µL Sulfo-Tag Antigen und Verhalten Verdünnungsreihen für die zwei unterschiedlich beschriftete Antigene als dargestellt in Abbildung 2Abezeichnet. Führen Sie eine horizontale serielle Verdünnung für eine beschriftete Antigen und eine vertikale serielle Verdünnung für das markierte Antigen.</li>
	<li>Den Rest von den Assay in 5.3 bis 9.1 beschriebenen Schritten weiter.</li>
	<li>Berechnen Sie das Verhältnis von Signalen aus der hohen positiven Probe gegeneinander der entsprechenden Signale aus dem negativen Beispiel in Abbildung 2 bgezeigt.</li>
	<li>Identifizieren Sie die besten Konzentrationen für Biotin und Sulfo-Tag gekennzeichnet Antigene durch Auswählen eines Punkts mit dem höchsten oder in der Nähe von höchsten Verhältnis von positiven zu negativen. Betrachten Sie die niedrigen Hintergrundsignal aus dem Negativ-Beispiel, das Verhältnis zu identifizieren. Hinweis: Test Tag 1 enthält Schritt 4 mit Schritt 6 fort.</li>
</ol>4. bereiten Sie den Antigen-Puffer mit der richtigen Konzentration von Biotin/Sulfo-Tag mit der Bezeichnung Antigen
<ol><li>Wählen Sie die rationale Konzentration jedes Antigen anhand der Checker Board Test.</li>
	<li>Bereiten Sie 3 mL Antigen-Lösung pro Platte, mit der rationalen Konzentration von Biotin/Sulfo-Tag mit der Bezeichnung Antigen für die Antigen-Puffer.</li>
</ol>(5) inkubieren Sie Serumproben mit beschriftete Antigen
Hinweis: Es gibt zwei Protokolle in diesem Abschnitt, eine ohne Serum Säurebehandlung und eine mit Serum Säurebehandlung. Alle Insel-Autoantikörper-Assays außer IAA Assay verwenden regelmäßig Protokoll ohne Serum Säurebehandlung von Schritte 5.1 bis 5.5 während IAA Assay diese Schritte überspringt und Protokoll mit Serum Säurebehandlung von Schritten 5,6 bis 5.9 verwendet.
<ol><li>Aliquoten 4 µL Serum und 1 X PBS hinzufügen, bis der letzte Band 20 µL pro Bohrloch für eine 96-Well-PCR-Platte ist.</li>
	<li>Fügen Sie 20 µL beschriftete Antigen-Lösung pro Bohrloch.</li>
	<li>Decken Sie die PCR-Platte mit Abdichtung Folie zur Vermeidung von Licht ab.</li>
	<li>Setzen Sie die Platte auf einen Shaker (niedrige Geschwindigkeit) bei RT für 2 h.</li>
	<li>Die Teller in den Kühlschrank 4 ° C stellen und inkubieren Sie über Nacht (18-24 Uhr). Hinweis: Das folgende Protokoll der Schritte von 5,6 bis 5.9 dient nur zur IAA-Assay und andere Autoantikörper-Tests diese Schritte überspringen.</li>
	<li>Mix 15 µL Serum mit 18 µL 0,5 M Essigsäure für jede Serumprobe. Inkubieren Sie diese Mischung bei RT 45 min.</li>
	<li>Bereiten Sie die Antigen-Lösung mit der rationalen Konzentration von Biotin und Sulfo-Tag mit der Bezeichnung Antigen, basierend auf der Checker Board Test mit Antigen-Puffer. In jedem gut, beschriftet aliquoten 35 µL Antigen Puffer, mit Biotin und Sulfo-Tag Antigen, in eine neue PCR-Platte.</li>
	<li>Vor 45 min Inkubationsschritt (Schritt 5.6) ist fertig, 8.3 µL 1 M Tris pH 9,0 Puffer an der Seite von jedem Bohrloch auf der Antigen-Platte (Schritt 5.6) hinzufügen. Es ist wichtig, die Vermischung zwischen der Tris-Puffer und das Antigen zu begrenzen. Sofort übertragen Sie 25 µL des Serums, welches mit Säure, im Schritt 5.6, in jede Vertiefung behandelt wird und schütteln Sie die Lösung. Decken Sie die PCR-Platte mit Abdichtung Folie zur Vermeidung von Licht ab.</li>
	<li>Legte die Platte auf einen Shaker (niedrige Geschwindigkeit) bei RT für 2 h. den Teller in den Kühlschrank 4 ° C stellen und lassen Sie die Platte zu inkubieren Übernachtung (18-24 Uhr).</li>
</ol>6. bereiten Sie die Streptavidin-Platte
<ol><li>Nehmen Sie eine Streptavidin-Platte aus dem Kühlschrank 4 ° C und lassen Sie die Platte zu RT kommen</li>
	<li>Sobald die Streptavidin-Platte bei RT ist, fügen Sie 150 µL 3 % Blocker A in jede Vertiefung.</li>
	<li>Decken Sie die PCR-Platte mit Folie abdichten.</li>
	<li>Über Nacht inkubieren Sie die Teller in den Kühlschrank 4 ° C. Hinweis: Assay Tag 2 beinhaltet Step 7 zu Schritt 9.</li>
</ol>7. Übertragung Serum/Antigen brütet auf den Streptavidin-Teller
<ol><li>Am nächsten Tag die Streptavidin-Platte aus dem Kühlschrank nehmen Sie und entsorgen Sie den Puffer von der Platte. Einige trockene Papiertücher dargelegt, auf dem Tisch, und tippen Sie auf die Platte auf den Kopf gestellt, bis gibt es keine mehr Puffer innerhalb der Brunnen.</li>
	<li>Füllen Sie die leeren Streptavidin-Platte mit 150 µL PBST pro Bohrloch und entsorgen Sie der PBST aus der Platte für eine Gesamtmenge von drei Wäschen.</li>
	<li>Transfer 30 µL Serum/Antigen Bebrüten pro Bohrloch in die Streptavidin-Platte.</li>
	<li>Abdeckplatte mit Folie, Licht zu vermeiden. Schütteln Sie die Platte auf einer niedrigen Einstellung bei RT für 1 h.</li>
</ol>8. Waschen Sie die Platte und lesen Puffer
<ol><li>Ablagestapel Bebrüten von der Platte. Fügen Sie 150 µL PBST pro Bohrloch und verwerfen Sie die PBST aus der Platte für eine Gesamtmenge von drei Wäschen.</li>
	<li>Fügen Sie nach dem Waschen, 150 µL pro Bohrloch des Puffers lesen. Hinweis: Es ist wichtig, Luftblasen in der Lösung zu verhindern, da dies Auswirkungen auf wie die Platte auf die Platte Leser Maschine gelesen wird.</li>
</ol>9. lesen Sie die Platte und analysieren von Daten
<ol><li>Zählen Sie die Platte auf die Platte-Leser-Maschine. Antikörper-Werte werden als Impulse pro Sekunde (CPS) angezeigt.</li>
	<li>Vermitteln Sie die Antikörpertiter von der Platte Leser Maschine als relative Index erhalten. Berechnen Sie der Index aus der folgenden Gleichung: Der Indexwert = [CPS (Beispiel) - CPS (Negativkontrolle)] / [CPS (Positivkontrolle) - CPS (Negativkontrolle)].</li>
	<li>Identifizieren Sie positive und negative Antikörper mit der Cut-off für Positivität definiert basierend auf der 99. Perzentile des 100 gesunde Kontrollpersonen (nicht-diabetischen Individuen ohne irgendwelche bekannten Autoimmunerkrankungen und haben keine Familiengeschichte von Diabetes).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Insel, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+presymptomatic+type+1+diabetes:+a+scientific+statement+of+JDRF,+the+Endocrine+Society,+and+the+American+Diabetes+Association.">Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association.</a> Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).</li><li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes:+new+perspectives+on+disease+pathogenesis+and+treatment.">Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment.</a> Lancet. 358 (9277), 221-229 (2001).</li><li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes.">Type 1 diabetes.</a> Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).</li><li>Steck, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEDDY+Study+Group.+Predictors+of+progression+from+the+appearance+of+islet+autoantibodies+to+early+childhood+diabetes:+The+Environmental+Determinants+of+Diabetes+in+the+Young+(TEDDY).">TEDDY Study Group. Predictors of progression from the appearance of islet autoantibodies to early childhood diabetes: The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY).</a> Diabetes Care. 38 (5), 808-813 (2015).</li><li>Krischer, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEDDY+Study+Group.+The+6+year+incidence+of+diabetesassociated+autoantibodies+in+genetically+at-risk+children:+the+TEDDY+study.">TEDDY Study Group. The 6 year incidence of diabetesassociated autoantibodies in genetically at-risk children: the TEDDY study.</a> Diabetologia. 58 (5), 980-987 (2015).</li><li>Achenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stratification+of+type+1+diabetes+risk+on+the+basis+of+islet+autoantibody+characteristics.">Stratification of type 1 diabetes risk on the basis of islet autoantibody characteristics.</a> Diabetes. 53 (2), 384-392 (2004).</li><li>Achenbach, P., Bonifacio, E., Koczwara, K., Ziegler, A. 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G., Bonifacio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+high-affinity+immune+responses+to+(pro)insulin+anticipate+the+autoimmune+cascade+that+leads+to+type+1+diabetes.">Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes.</a> J Clin Invest. 114 (4), 589-597 (2004).</li><li>Yu, L., Dong, F., Miao, D., Fouts, A. R., Wenzlau, J. M., Steck, A. 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S. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+persistent+insulin+autoantibodies+with+differential+risk:+nonradioactive+bivalent+proinsulin/insulin+autoantibody+assay.">Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay.</a> Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).</li><li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAD65+autoantibodies+detected+by+electrochemiluminescence+assay+identify+high+risk+for+type+1+diabetes.">GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).</li><li>Yu, L. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+Autoantibody+Detection+by+Electrochemiluminescence+(ECL)+Assay.">Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay.</a> Methods Mol Biol. 1433, 85-91 (2016).</li><li>Myler, H. 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M., Yu, J., Yu, L., Wang, J., Miao, D., Bao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody+&#34;subspecificity&#34;+in+type+1+diabetes:+risk+for+organ-specific+autoimmunity+clusters+in+distinct+groups.">Autoantibody &#34;subspecificity&#34; in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups.</a> Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).</li><li>Triolo, T. M., Armstrong, T. K., McFann, K., Yu, L., Rewers, M. J., Klingensmith, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+autoimmune+disease+found+in+33%+of+patients+at+type+1+diabetes+onset.">Additional autoimmune disease found in 33% of patients at type 1 diabetes onset.</a> Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).</li><li>de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+clinical+significance+of+organ-specific+autoantibodies+in+type+1+diabetes+mellitus.">Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus.</a> Neth J Med. 65 (7), 235-247 (2007).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Insel-Autoantikörper sind derzeit die zuverlässigste Biomarker für Autoimmunität von Typ 1 Diabetes. Sie markieren den Beginn der Insel bestimmten Autoimmunität und offene Krankheitsrisiken zu bestimmen. Die ECL-Assay für Insel-Autoantikörper, wurde ausführlich in mehreren nationalen und internationalen Typ 1 Diabetes klinischen Studien validiert. Der Test hat gezeigt, erhöhte Empfindlichkeit und Spezifität im Vergleich zu den aktuellen "Gold" standard RBAs. Die ECL-Assay hat seine überlegene Vorteil für höhere Spezifität der Krankheit durch anspruchsvolle High-Affinität und risikoreiche Insel-Autoantikörper von geringem Risiko und geringer Affinität Signale generiert durch die RBA gezeigt. Dies ist vor allem in den Fächern, die nur einzelne Inselchen Autoantikörper positiv aufgefallen und haben nie Fortschritte gemacht, um Typ-1-Diabetes. Die meisten dieser geringe Affinität, die Autoantikörper gefunden wurden, verloren während follow-up Tests innerhalb von Monaten bis Jahren, verhält sich wie eine "vorübergehende positiv." Wie bereits vermutet, diese geringe Affinität, die "single" Autoantikörper wahrscheinlich durch Immunisierung mit einem kreuzreaktiven Molekül entstanden. Während höhere Affinität ergaben sich höhere Risiko-Insel-Autoantikörper aus Immunisierung mit den Inselchen Antigene selbst. ECL-Assays zeigten darüber hinaus die Möglichkeit, die Zeit der "Serokonversion" vom aktuellen standard Radio-Bindung-Assays (RBA) von Jahren bei Kindern mit Prä-Diabetes, antedate, die von Geburt an klinischen Diabetes folgten. Eine laufende internationale klinische Studie, die ökologischen Determinanten von Diabetes in Young (TEDDY) hängt präzise Erkennung, das Timing und die Darstellung der ersten Insel-Autoantikörper "Serokonversion", markieren Sie den Anfang von der kleinen Insel zu lokalisieren Autoimmunität und umweltbedingte Auslöser zu identifizieren. Ein möglicher Grund für erhöhte Empfindlichkeit in der ECL-Test ist, dass der Test alle Immunglobulinklassen erfasst: IgG, IgM, IgA, oder IgE, anstatt die traditionellen RBA oder sich nur auf den Nachweis von IgG ELISA.
In ECL-Assays für einige bestimmte Autoantikörper wie IAA scheint die Bindung der Autoantikörper gegen das Antigen durch eine Komponente im normalen menschlichen Serum gehemmt werden. Zu entfernen oder lassen Sie diese Hemmung, mußte Säurebehandlung von Serumproben tun, bevor das Serum mit Antigen inkubiert wurde. Wie dargestellt in [Abb. 5], ECL-IAA-Assay der Bindung-Aktivitäten von der Maus Insulin monoklonale Antikörper und Patienten Serum Autoantikörper mit dem Antigen wurde erheblich verbessert. Die Versauerung der Serumproben Antikörper Assays verwendet wird in der Regel angewendet, um bereits vorhandene gebundene komplexe distanzieren. Der Mechanismus hinter wie IAA Signale in humanem Serumproben gehemmt sind und freigegeben durch Säuerung des Serums ist nicht bekannt, aber mit dieser Methode in anderen ECL basierte Assays14,15.
In einigen Fällen, beim Beschriften von Molekülen sind Biotin oder Sulfo-Tag, die Kennzeichnung Positionsinside Antigen-Protein-Moleküle auf oder sehr nahe an wichtigen Epitope Antikörper-Bindung, die mit der Bindung an Antikörper stören kann. Dies reduziert Assay-Empfindlichkeit und kann komplett abzureißen Assays. Für Routine-Kennzeichnung Verfahren Maximierung oder Sättigung für jedes Antigen-Protein-Molekül, maximale Aktivität oder Signal pro beschrifteten Molekül zu erzeugen, durch die Maximierung der Kennzeichnung Kapazität von jede mögliche Kennzeichnung Position gewünscht. Ungesättigten Kennzeichnung sollte durchgeführt werden, indem das molare Verhältnis von Antigen-Protein-Moleküle (Biotin und Sulfo-Tag) Kennzeichnung, Beschriftung auf dem Antigen wird ein möglicher Grund für die Unterbrechung der Bindung Antikörperaktivität reduziert. Major Epitope besser reserviert werden kann und Unterbrechung der Antikörper-Bindung-Aktivität kann mit Hilfe der ungesättigten Kennzeichnung Strategie in den meisten Fällen freigegeben werden.
Jeder Test sollte eine interne standard hohe positive und negative Kontrolle für die Index-Berechnung der unbekannten Proben enthalten. Niedrigen Positivkontrolle in der Nähe der Assay obere Grenze des normalen Kontrollen ist wichtig für die Überwachung der Assay-Empfindlichkeit. Das Labor sollte genügend Aliquote standard positive und negative Kontrollen für den langfristigen Einsatz halten und alle Aliquote sollte bei-20 ° c gelagert werden Assay-Qualitätssicherung Assays in Duplikate für jede Probe ausgeführt werden müssen und jedes positive Ergebnis sollte durch die Wiederholung der Probe in einem separaten Assay bestätigt werden. Ein dritte Assay ist notwendig, wenn die zweite bestätigende Assay nicht einverstanden ist, mit den ersten Test und die Ergebnisse von zwei Assays, die einverstanden sind (zB., +, + oder-, -), werden die endgültige Festlegung der ein positives oder negatives Ergebnis.
Mit der Plattform für einzelne ECL-Assays kann daraus eine Multiplex-Assay erweitert werden. Es kann gleichzeitig bis zu 10 verschiedene Autoantikörper in einem einzigen Brunnen mit einer winzigen Menge des Serums bestimmen. Derzeit sind vier kleine Insel-Autoantikörper einschließlich IAA, GADA, IA-2A und ZnT8A gleich an Bedeutung für die Risiko-Vorhersage der Progression zu T1D in beiden Verwandten von Patienten mit T1D und der allgemeinen Bevölkerung. Die Methoden für das screening von diesen 4 Autoantikörper mit einzelnen Autoantikörper Strommessungen sind aufwändig und ineffizient, vor allem für großflächige Bevölkerung Screening. Haben Sie wichtig ist, bis zu 40 % der Patienten mit T1D eine weitere Autoimmunerkrankung16,17,18. Leider gibt es keine einfache und kostengünstige Tool zum Bildschirm für diese Bedingungen. Die Multiplex-ECL-Assay ist nicht nur in der Lage 4 aktuellen großen Insel-Autoantikörper-Assays in einem zu kombinieren, aber ist auch in der Lage, weitere Autoantikörper-Tests aus anderen relevanten Autoimmunerkrankungen weiter kombinieren. Dies macht es möglich, effizient Hochdurchsatz-screening für mehrere Autoimmunerkrankungen gleichzeitig in großem Maßstab Populationen führen. In der Multiplex-ECL-Assay wird wie in [Abb. 6] jeder Antikörper-Antigen-Komplex gebildet in der Flüssigkeit-Phase zu einer spezifischen Linker Quelle Stelle in der gleichen gut zurückgehalten werden. Der Signalempfänger auf der Platte-Leser-Maschine ist in der Lage, die Signale aus 10 verschiedenen Quellen von Flecken zu erkennen. Jedoch können die Flecken mit einem extrem hohen Signal generieren einen hohen Assay-Hintergrund und verursachen Interferenzen zu benachbarten Orten durch Übersprechen. Aus diesem Grund sollte die Obergrenze Signale für jedes Autoantikörper-Test beschränkt sich auf weniger als 20.000 zählt. Nach unserer Erfahrung sollte die Autoantikörper mit niedrigeren Hintergründe relativ weit entfernt von jenen Stellen, die mit höheren zählt, wenn die spot Karte ausgelegt ist platziert werden. Für Langzeitstudien mit Multiplex-ECL-Assays empfiehlt es sich, dass der gleiche Linker zum gleichen Autoantikörper-Test verwendet werden, um den Assay konsistent zu halten.

Ein aktuelles staging Klassifikationssystem wurde erstellt, um die Diagnose der Anfangsphase des T1D bei Patienten zu unterstützen. Genaue Erfassung der menschlichen Insel-Autoantikörper spielt eine wichtige Rolle bei der Identifizierung und Inszenierung präsymptomatische Typ 1 Diabetes, da das Vorhandensein des Insel-Autoantikörper weist auf das Vorhandensein von β-Zelle Autoimmunität. Die beträgt bei denen Diabetes betrifft Patienten aus dem ersten Auftreten der β-Zelle Autoimmunität zu den Symptomen der Krankheit, verbunden mit der Anzahl und Art der Insel-Autoantikörper, Variable2,3.
Das Zeitalter der Autoantikörper Serokonversion, Titer und Affinität der Insel-Autoantikörper beeinflussen die Rate des Fortschreitens auf symptomatische Typ 1 Diabetes4,5,6,7,8 ,9,10. Vor kurzem entwickelte ECL-Assays umfassend validiert wurden, haben gezeigt, erhöhten Empfindlichkeit und sind weitere krankheitsspezifische10,11,12,13. Diese Tests verbessern die Vorhersage und Inszenierung der Diabetes-Risiko durch die frühere Erkennung von Insel-Autoantikörper. Sie markieren die Einleitung von Inselchen Autoimmunität genauer und ignorieren die niedrig-Affinität und risikoarme Signale nicht relevant für Diabetes.
ECL-Assay überbrücken Autoantikörper im Serum, falls vorhanden, die Sulfo-Tag-konjugiert Antigen biotinylierte Erfassung Antigen in der flüssigen Phase. Nach Überbrückung, Biotin Linker gefangen in der festen Phase und erkannt durch ECL von Sulfo-Tag auf der Streptavidin beschichteten Platte (Abbildung 1).
In diesem Beitrag werden einzelne Antikörper-ECL-Assays mit menschlichen Insel-Autoantikörper in erster Linie eingesetzt. Kurz, Multiplex Antikörper Assays basierend auf einzelnen ECL-Assays diskutiert werden. Multiplex-Assays kann verwendet werden, um mehrere, bis zu 10, Autoantikörper innerhalb einer einzigen gut, identifizieren mit 15 µL Serum. Diese einfachen Hochdurchsatz-Assay kann verwendet werden, um gleichzeitig mehrere Autoantikörper für mehrere relevante Autoimmunerkrankungen in der Allgemeinbevölkerung Bildschirm.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="643">
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:292px;">Human recombinant proinsulin protein(PINS)</td>
			<td style="width:151px;">AmideBio</td>
			<td style="width:137px;">Human Proinsulin, Rec</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human recombinant GAD65 protein</td>
			<td style="width:151px;">Diamyd</td>
			<td style="width:137px;">rhGAD65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human recombinant IA-2 protein</td>
			<td style="width:151px;">Creative BioMart</td>
			<td style="width:137px;">IA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10x PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:151px;">SIGMA-ALORICH</td>
			<td style="width:137px;">A7906-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well PCR plate&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>14230232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin coated plate</td>
			<td style="width:151px;">MSD</td>
			<td style="width:137px;">L15SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba sizing spin column</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Twen-20</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HCl</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma Base</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EZ-Link Biotin</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sulfo-tag</td>
			<td style="width:151px;">MSD</td>
			<td>R91AO-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blocker A</td>
			<td style="width:151px;">MSD</td>
			<td style="width:137px;">R93AA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4x Read Buffer T with Surfactant</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R92TC-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>ThermoScience</td>
			<td>21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sulfo-TAG</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R91AO-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well polymerase chain reaction (PCR) plate</td>
			<td style="width:151px;">Fisher brand</td>
			<td style="width:137px;">14230232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-Well Streptavidin plate</td>
			<td style="width:151px;">MSD GOLD</td>
			<td style="width:137px;">L 15SA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td style="width:151px;">ThermoScience</td>
			<td style="width:137px;">PL208984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Plate Shaker</td>
			<td style="width:151px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:137px;">1296-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plate Reader</td>
			<td style="width:151px;">MSD</td>
			<td style="width:137px;">QuickPlex SQ120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Benchtop centrifuge with bucket rotary</td>
			<td style="width:151px;">Beckman</td>
			<td style="width:137px;">Allegra X-15R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrochemiluminescence assays for human islet autoantibodies

Ermittlung der Insel-Autoantikörper mit Typ 1 Diabetes assoziiert führt (T1D) der Weg zu projizieren und davon abhalten, diese Krankheit in der Allgemeinbevölkerung. Eine neuartige ECL-Assay ist ein nicht radioaktiven Fluiden Phase Assay für Insel-Autoantikörper mit höherer Sensitivität und Spezifität als die aktuelle "Gold" standard Radio-Bindung Assay (RBA). ECL-Assays können das Auftreten von präsymptomatische T1D genauer definieren, durch die Unterscheidung der mit hohem Risiko, hohe Affinität Autoantikörper aus den risikoarmen, niedrige Affinität Autoantikörper erzielte RBAs und konventionellen Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (ELISA ). Das Antigen-Protein in dieser ECL-Assay verwendet wird bzw. mit Sulfo-Tag und Biotin, gekennzeichnet. Jedes ECL-Autoantikörper-Test, die ein bestimmtes Antigen-Protein verwendet braucht ein Optimierungsschritt, bevor es für Labor-Anwendung verwendet werden kann. Dieser Schritt ist besonders wichtig bei der Festlegung der Anforderungen für Serum Säure Behandlungen, Konzentrationen und Verhältnisse von zwei verschiedenen Antigenen beschriftet mit Sulfo-Tag und Biotin. Um den Test durchzuführen, Serum Proben mit Sulfo-Tag-konjugiert gemischt und biotinylierte erfassen Antigen Proteins in Phosphat gepufferte Lösung (PBS), mit 5 % Bovine Serum Albumin (BSA). Danach werden die Proben bei 4 ° c über Nacht inkubiert. Am selben Tag ist eine Streptavidin beschichteten Platte mit Blocker Puffer zubereitet und über Nacht bei 4 ° c inkubiert Am zweiten Tag waschen Sie die Streptavidin-Platte und übertragen Sie die Serum-Antigen-Mischung auf den Teller. Legen Sie die Platte auf den Teller-Shaker, bei niedriger Drehzahl eingestellt und Inkubation bei Raumtemperatur für 1 h. Anschließend die Platte wird wieder gewaschen, und Leser Puffer hinzugefügt. Die Platte wird dann auf die Platte Leser Maschine gezählt. Die Ergebnisse werden über einen Index vermittelt, die aus internen standard positive und negative Kontrolle Serumproben generiert wird.

Abbildung 2 zeigt die Checker Board. Es wird gezeigt, dass 250 ng/mL von Biotin und 250 ng/mL von Sulfo-Tag beschriftete Antigen sind die rationellsten Konzentrationen verwendet in der Probe, da die Signale von den hohen positiven Kontrollprobe, die negative Kontrollprobe der Assay-Hintergrund und das Verhältnis von positive, negative Signale. Mit den optimierten Konzentrationen dieser zwei beschriftete Antigene wurde der Test mit Serumproben von 100 neu diagnostizierten Patienten mit T1D und 100 gesunden Kontrollen durchgeführt. Der Indexwert des 0,023 wurde als der Assay-Cut-off für Positivität definiert. Dies entspricht 85 % Sensitivität im Patienten und 99 % Spezifität bei gesunden Kontrollpersonen, die mit dem Receiver (ROC) Kennlinie dargestellt in Abbildung 3Ain Betrieb. Der Test für die unbekannten Proben wurde mit internen standard hohe positive, niedrigen positiven und negativen Kontrollproben durchgeführt. Die Ergebnisse der CPS Grafen sind dargestellt Tabelle 2A. Der Mittelwert CPS von hohen und niedrigen Positivkontrollen sind rot, 17903 [(19940+15866)/2 markiert] und 839 [(857+820)/2], und die Negativkontrollen grün, 168 [(170+165)/2 hervorgehoben]. Der Index für unbekannte Proben wird berechnet, indem "(CPSProbe-168)/(17903-168)." Tabelle 2 b zeigt die berechneten Index-Werte für alle Proben. Die Indexwerte, die größer als 0,023 rot, entspricht die CPS-Werte auch in Tabelle 2Arot geschrieben geschrieben sind. Diese Werte werden als die positiven Ergebnisse definiert werden, die größer als99 Perzentil der gesunden Kontrollgruppe . Wenn eine irrationale Antigenkonzentration verwendet wird, wird der Test einen hohen Hintergrund haben wie in Tabelle 2 C. gezeigt Geringe Mengen an positive Antikörper werden wie die Werte A2, A5, D1 und H4 in Tabelle 2Dgrau hervorgehoben vermisst werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig1.jpg"> Abbildung 1 : Abbildung einer bivalenten Platte schlagen auf einen einzigen ECL-IAA-Assay. Die Insel-Autoantikörper in der Serum-Brücken Sulfo-Tag Antigen biotinylierte Erfassung Antigen, konjugiert, die in der festen Phase auf der Streptavidin beschichteten Platte erfasst ist. Erkennung der Platte aufgenommenen Sulfo-Tag konjugierten Antigen wird durch ECL erreicht. Diese Zahl wurde von Yu, geändert Et Al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig2.jpg"> Abbildung 2 : The ROC-Kurve für die Bestimmung der Cut-off von Assay Positivität. 99 Perzentil entspricht 85 % Sensitivität Spezifität wurde ausgewählt und als ein Indexwert von 0,023 dargestellt wird. Diese Obergrenze des Assays stammen von 100 gesunden Kontrollpersonen. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig3.jpg"> Abbildung 3 : Darstellung der normalen menschlichen Serum ECL-IAA-Signale blockieren. A: die Signale von ECL-IAA-Assays mit einem Insulin monoklonale Antikörper (MoAb) drastisch durch die Zugabe von normalen menschlichen Serum blockiert wurden. Beim Vergleich von MoAb mit PBS-Puffer wurde das Signal teilweise restauriert, wenn die Humanserum mit Säure behandelt wurde. B: Signale von einem ECL-IAA-Assay mit 4 Patientenseren wurden mit Säure Behandlung deutlich verbessert. Diese Zahl wurde von Yu, geändert Et Al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig4.jpg"> Abbildung 4 : Abbildung des Assays Mutiplex ECL. Antikörper-Antigen-komplexe werden in der Flüssigkeit-Phase mit spezifischen linker gebildet. Die spezifischen Antikörper-Antigen-Linker komplexe sind gut auf jedem der Linker-punktweise in dasselbe Verhalten. Die Platte Leser Maschine ist in der Lage, die Signale aus verschiedenen Quellen der Spots zu unterscheiden und CPS zählt auf 10 verschiedenen Kanälen, bzw. gibt. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1.jpg"> Tabelle 1: Checker Board Test bestimmt die Konzentration und die Verhältnisse von Biotin und Sulfo-Tag mit der Bezeichnung Antigene. A: Raw CPS zählt für Board Riffelblech mit hohen positiven Serum auf Hälfte der Platte und negativen Serum auf der anderen Hälfte. Die Konzentration des Antigens biotinylierte war horizontal hintereinander verdünnt und die Konzentration von Sulfo-Tag mit der Bezeichnung Antigen wurde vertikal in Serie verdünnt. B: die Verhältniswerte der CPS Grafen aus dem hohen positiven Serum gegen jeden ihrer entsprechenden CPS Grafen aus dem negativen Serum. Die gelben markierten Brunnen repräsentieren das beste Verhältnis von positiven zu negativen in der Gruppe B. Dieses Verhältnis entspricht 250 ng/mL Biotin und 250 ng/mL Sulfo-Tag gekennzeichnet Antigen-Konzentrationen in zentrale A mit einen akzeptabel niedrigen CPS-Count für negativen Serum. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Tabelle zu sehen.</a>
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2.jpg"> Tabelle 2: Analyse der Untersuchungsergebnisse. A: Raw CPS zählt von der Assay-Platte mit der standard hoch und niedrig Positivkontrollen hervorgehoben in rot und die negativen Standardsteuerelemente grün hervorgehoben. Jede Probe wurde in der Probe zweigleisig ausgebaut. B: Index-Werte wurden berechnet, wie in dem Assay-Protokoll beschrieben. Jeder Indexwert, der größer als 0,023 war wurde definiert als ein positives Ergebnis, rot hervorgehoben. C: Raw CPS zählt von der Assay-Platte mit dem gleichen Satz von Proben, wenn eine irrationale Antigenkonzentration verwendet wurde. Dies führte zu einem hohen Hintergrund und einige niedrige positive normalerweise erkannt, wie im Diagramm B gezeigt wurden umgewandelt zu negativen, in Panel D. grau hervorgehoben <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Tabelle zu sehen.</a>

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Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Hier präsentierten wir die Methoden, um menschliche Insel-Autoantikörper mit Electrochemiluminescence (ECL) Assays erkennen. Das Protokoll verwendet, um vorherzusagen, Typ 1 Diabetes, kann erweitert werden, um Autoantikörper für andere Autoimmunerkrankungen zu erkennen.

Electrochemiluminescence-Assays für menschliche Insel-Autoantikörper

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

electrochemiluminescence-assays-for-human-islet-autoantibodies

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.4K Aufrufe.  University of Colorado Denver. Hier präsentierten wir die Methoden, um menschliche Insel-Autoantikörper mit Electrochemiluminescence (ECL) Assays erkennen. Das Protokoll verwendet, um vorherzusagen, Typ 1 Diabetes, kann erweitert werden, um Autoantikörper für andere Autoimmunerkrankungen zu erkennen.

Serie: Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

Tests für die Identifizierung neuer Antivirale gegen Blauzungenvirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

Visualisierung der immunologischen Synapse von Dual Color Zeitgesteuerte Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoskopie

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Viral Entschlossenheit Konzentration Durch Plaque-Assays: Mit Tradition und neuen Überzugssysteme

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Frühe das Eindringen des Virus-Assays für die Ermittlung und Bewertung von antiviralen Verbindungen

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Qualitative und quantitative Assays zur Detektion und Charakterisierung von Protein Antimikrobielle

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels of autoantibodies to specific antigens are typically detected with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique. However, screening for multiple autoantibodies with ELISA can be time-consuming and requires a large quantity of patient sample. The antigen microarray technique is an alternative method that can be used to screen for autoantibodies in a multiplex fashion. In this technique, antigens are arrayed onto specially coated microscope slides with a robotic microarrayer. The slides are probed with patient serum samples and subsequently fluorescent-labeled secondary antibodies are added to detect binding of serum autoantibodies to the antigens. The autoantibody reactivities are revealed and quantified by scanning the slides with a scanner that can detect fluorescent signals. Here we describe methods to generate custom antigen microarrays. Our current arrays are printed with 9 solid pins and can include up to 162 antigens spotted in duplicate. The arrays can be easily customized by changing the antigens in the source plate that is used by the microarrayer. We have developed a two-color secondary antibody detection scheme that can distinguish IgG and IgM reactivities on the same slide surface. The detection system has been optimized to study binding of human and murine autoantibodies.

We describe here a method to generate customizable antigen microarrays that can be used for the simultaneous detection of serum IgG and IgM autoantibodies from humans and mice. These arrays allow for high-throughput and quantitative detection of antibodies against any antigens or epitopes of interest.

Generation of Two-color Antigen-Mikroarrays für den gleichzeitigen Nachweis von IgG und IgM-Autoantikörper

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin acquisition at the bacterial cell surface plays in resistance to the host immune system. Flow cytometry experiments identified human plasma vitronectin as a ligand for the bacterial receptor outer membrane protein H of Haemophilus influenzae type f. An enzyme-linked immunosorbent assay was employed to characterize the protein-protein interactions between purified recombinant protein H and vitronectin, and binding affinity was assessed using bio-layer interferometry. The biological importance of the binding of vitronectin to protein H at the bacterial cell surface in evasion of the host immune response was confirmed using a serum resistance assay with normal and vitronectin-depleted human serum. The importance of vitronectin in bacterial adherence was analyzed using glass slides with and without vitronectin coating, followed by Gram staining. Finally, bacterial adhesion to human alveolar epithelial cell monolayers was investigated. The protocols described here can be easily adapted to the study of any bacterial species of interest.

This report describes protocols for characterizing interactions between bacterial outer membrane proteins and the human complement regulator vitronectin. The protocols can be used to study the binding reactions and biological function of vitronectin in any bacterial species.

Assays für die Untersuchung der Rolle von Vitronectin in bakterielle Adhäsion und Serum-Widerstand

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

Screening-Assays zur Charakterisierung neuartiger endothelialer Regulators der entzündlichen Reaktion beteiligt

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

Messung der Influenza neutralisierenden Antikörperantworten gegen a/H3N2-Viren im menschlichen Serum von Microneutralization Assays mit MDCK-SIAT1 Zellen

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to the development of type 2 diabetes mellitus (T2DM). Although the mechanisms for the chemical-induced &#946; cell damage were unclear and likely to be complex, one recurring finding is that these chemicals induce oxidative stress leading to the generation of excessive reactive oxygen species (ROS) which induce damage to the &#946; cell. To identify potential diabetogenic environmental chemicals, we isolated pancreatic islet cells from C57BL/6 mice and cultured islet cells in 96-well cell culture plates; then, the islet cells were dosed with chemicals and the ROS generation was detected by 2',7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) fluorescent dye. Using this method, we found that bisphenol A (BPA), Benzo[a]pyrene (BaP), and polychlorinated biphenyls (PCBs), could induce high levels of ROS, suggesting that they may potentially induce damage in islet cells. This method should be useful for screening diabetogenic xenobiotics. In addition, the cultured islet cells may also be adapted for in vitro analysis of chemical-induced toxicity in pancreatic cells.

Here we present a protocol to isolate mouse pancreatic islet cells for screening the ROS inductions by the xenobiotics in order to identify the potential diabetogenic xenobiotic chemicals.

Ein murinen Pancreatic Islet Cell-basierte Screening für diabetogene Umweltchemikalien

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...