Die ECLIA ist eine einfache, aber effiziente Methode zur Quantifizierung des zellulären Niveaus von MeCP2. Die ECLIA ist schnell, empfindlicher und einfacher zu handhaben im Vergleich zu anderen Quantifizierungsmethoden wie dem Western Blot und dem ELISA. Um die Waschlösung vorzubereiten, die 0,5%Tween 20 in PBS ist, fügen Sie 500 Mikroliter Tween 20 zu einem Liter PBS hinzu und mischen Sie kräftig.
Bereiten Sie eine Blockierlösung von 3%Blocker A und PBS vor und rühren Sie vorsichtig. Sterilisieren Sie die Blockierlösung durch Filtration. Um die Assay-Verdünnungslösung 1%Blocker A und PBS vorzubereiten, fügen Sie die Blockierlösung fünf Milliliter zu 10 MilliliterPBS hinzu.
Als nächstes tauen Sie die monoklonale Maus Anti-MeCP2 Antikörper auf Eis. Mischen Sie 0,67 Mikroliter des Antikörpers mit vier Milliliter PBS, dann wirbeln Sie die Lösung. Um die 96-Well-Hochbindungsplatte zu beschichten, geben Sie sorgfältig 25 Mikroliter Beschichtungslösung in die untere Ecke jedes Brunnens, mit einem Mehrkanal-Pipetter.
Dab die 96-Well-Platte sanft auf jeder Seite, um sicherzustellen, dass die Beschichtungslösung den Boden jedes Brunnens bedeckt. Versiegeln Sie die Platte mit Klebefolie und bebrüten Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Holen Sie die 96-Well-Platte aus dem Kühlschrank und entfernen Sie die Folie.
Entfernen Sie die Antikörperbeschichtungslösung in den Brunnen, indem Sie sie in einen Abfallbehälter schieben. Tippen Sie dann auf die Platte auf ein Papiertuch, um die verbleibende Lösung zu entfernen. Als nächstes fügen Sie 125 Mikroliter Blockierlösung zu jedem Brunnen hinzu.
Dann versiegeln Sie die Platte erneut mit Klebefolie. Legen Sie die Platte auf einen Orbital-Mikroplatten-Shaker, der auf 800 Umdrehungen pro Minute eingestellt ist, und inkubieren Sie sie 90 Minuten lang bei Raumtemperatur. Tauen Sie auf Eis eine Durchstechflasche mit MeCP2 oder Tat-MeCP2 Protein-Stock-Lösung, Maus Gehirnlysate, und HDF Lysate.
Verdünnen Sie die Proteinstammlösung in sauberen Röhrchen, wie in Tabelle 2 des Manuskripts beschrieben. Als nächstes die Lysatproben verdünnen. Für die Maus Gehirnlysate, verwenden Sie ein bis 20 Mikrogramm pro 25 Mikroliter LysePuffer.
Für das HDF-Lysat 0,25 zu einem Mikrogramm pro 25 Mikroliter Lysepuffer hinzufügen. Nachdem die 96-Well-Platte 90 Minuten lang inkubiert wurde, entfernen Sie die Sperrlösung aus den Brunnen, indem Sie sie in einen Abfallbehälter schieben. Tippen Sie dann auf die Platte auf ein Papiertuch, um die verbleibende Lösung zu entfernen.
Dann waschen Sie den Teller dreimal mit 150 Mikroliter Waschlösung, indem Sie die Waschlösung hinzufügen und sofort entfernen. Fügen Sie 25 Mikroliter Standards und Proben in die Brunnen der 96-Well-Platte. Versiegeln Sie die Platte und inkubieren Sie sie weitere vier Stunden bei Raumtemperatur mit konstanten 800 RPM Schütteln.
Den unbeschrifteten Detektionsantikörper, polyklonales Kaninchen Anti-MeCP2, auf Eis auftauen. Mit Assay-Verdünnungslösung den Antikörper im Verhältnis eins zu 6 000 verdünnen. Wenn die 96-Well-Platte auf dem Shaker inkubiert ist, entfernen Sie die Standards und Proben, indem Sie die Platte in einen Abfallbehälter schieben.
Tippen Sie dann auf die Platte auf ein Papiertuch, um die verbleibende Lösung zu entfernen. Waschen Sie die Platte dreimal mit 150 Mikroliter Waschlösung, indem Sie die Waschlösung hinzufügen und sofort entfernen. Fügen Sie mit dem Mehrkanal-Pipetter 25 Mikroliter unbeschrifteter Detektions-Antikörperlösung zu jedem Brunnen hinzu.
Versiegeln Sie die Platte und inkubieren Sie sie für eine Stunde bei Raumtemperatur mit konstantem Schütteln bei 800 Umdrehungen pro Minute. Erhalten Sie den spezifischen sekundären Antikörper aus dem Kühlschrank und legen Sie ihn ein Eis. Den Sekundärkörper in assay verdünnungsmitteler Lösung verdünnen und sanft mischen.
Um den freien unbeschrifteten Detektionsantikörper aus der 96-Well-Platte zu entfernen, blättern Sie in den Abfallbehälter und tippen Sie dann auf die Platte auf ein Papiertuch. Nach dem Waschen der Platte dreimal wie pervily beschrieben, fügen Sie 25 Mikroliter Sekundärantikörper zu jedem Brunnen mit dem Mehrkanal-Pipetter. Versiegeln Sie die Platte und inkubieren Sie sie für eine Stunde bei Raumtemperatur mit konstantem Schütteln bei 800 Umdrehungen pro Minute.
Entfernen Sie den freien Sekundärantikörper, indem Sie in den Abfallbehälter einsteigen und die Platte auf ein Papiertuch klopfen, und waschen Sie die Platte dann, wie zuvor beschrieben, dreimal. Zu jedem Brunnen der Platte, fügen Sie 150 Mikroliter 1X Tris Basis Gold Read Buffer mit Tensid, enthält Tripropylamin als Coreactant für die Lichterzeugung. Um luftblasen zu vermeiden, verwenden Sie Reverse Pipetting-Techniken.
Platzieren Sie die 96-Well-Platte auf der Mikroplattenplattform mit Elektrochemilumineszenz-Detektionssystem. Mit der eingebauten CCD-Kamera beginnen Sie sofort mit der Datenerfassung. Aufzeichnungssignalzählungen, die relativen Lichteinheiten entsprechen und direkt proportional zur Lichtintensität sind.
MeCP2-Standardkurven wurden aus menschlichem MeCP2 in mehreren Messungen erzeugt. Die ECLIA kann rekombinantes menschliches MeCP2 über einen Bereich von einem Nanogramm pro Milliliter bis 1800 Nanogramm pro Milliliter genau quantifizieren. Mit ECLIA wurden MeCP2-Proteinspiegel in Kernlysaten im Gehirn von heterozygoten und weiblichen Wildtypmäusen und von einer MeCP2-Knockout-Maus gemessen.
ECLIA wurde an Zelllysaten aus einer gesunden Kontrolle und aus der ca. 806delG Zelllinie als Modell für das Rett-Syndrom verwendet durchgeführt. Kein MeCP2-Protein wurde in den mutierten Zelllinien durch ECLIA oder durch Immunfluoreszenz nachgewiesen.
ECLIA wurde auch verwendet, um die Aufnahme von Tat-MeCP2 durch die MeCP2 mangelhafte Zelllinie Überstunden zu untersuchen. Die Inter- und Intra-Assay-Präzision von ECLIA wurde an drei aufeinanderfolgenden Tagen ermittelt. Für zukünftige Proteinersatztherapien kann die MeCP2-Bereitstellung nach der Proteinstandbewertung durch die ECLIA wiederholt optimiert werden.
