이 작품은 NIH에 의해 지원 되었다 DK32083, JDRF 그랜트 2-SRA-2015-51-Q-R를 부여.

1. 버퍼 준비
<ol><li>버퍼 (2 x PBS, pH 7.9) 라벨: 이온된 (DD) 증류수의 400 Ml에서 100 mL 10 x PBS의 추가, NaOH와 7.9에 pH를 조정.</li>
	<li>Biotin의 3 m m: 버퍼 라벨의 588 µ L에서 1mg Biotin의 해산.</li>
	<li>3mm Sulfo 태그: 버퍼 라벨의 50 µ L에 Sulfo 태그의 해산 150 nmol.</li>
	<li>항 원 버퍼 (5 %BSA): 1 x PBS의 500 Ml, 25 g 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 추가.</li>
	<li>0.5 M 초 산 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>Tris HCl 버퍼 pH 9.0의 1.0 M: 준비 1 M Tris-HCl 9.0 HCl로 pH를 조정 하 고, 버퍼.</li>
	<li>코팅 버퍼 (3% 차단 A): 1 x PBS의 500 Ml, 추가 차단 A. 15 g</li>
	<li>세척 버퍼 (0.05% 트윈 20, PBST): 1 x PBS의 5000 Ml에서 2.5 mL 트윈 20의 추가.</li>
	<li>읽기 버퍼 (계면 활성 제와 읽기 버퍼 T x 2): DD 물 500 Ml, 500 mL 계면 활성 제 (자료 테이블)와 읽기 버퍼 T x 4의 추가.</li>
	<li>-20 ° C 냉장고에 Biotin과 Sulfo 태그를 저장 합니다. 참고: 모두 Biotin과 Sulfo 태그 솔루션 항상 갓 준비 해야 레이블 프로시저의 바로 전에.</li>
</ol>2. 인간의 섬 Autoantigen Biotin과 Sulfo 태그 라벨
참고: 높은 농도의 항 원, 이들 mg/mL, 보다 효율적인 라벨 반응 좋습니다.
<ol><li>Biotin과 Sulfo 태그에 대 한 인간의 섬 autoantigen의 어 금 니 비율을 결정 합니다.<ol>
<li>분자 무게에 의해 항 원 무게를 분할 하 여 항 원 어 금 니 번호를 가져올.</li>
		<li>작은 분자량 (≤ 10 kd)와 항 원에 대 한 1: 5의 어 금 니 비율을 사용 하 여 더 큰 분자량과 항 원에 대 한 1시 20분의 어 금 니 비율 (> 50 kd).</li>
		<li>농도 의해 몰 수를 나누어 Biotin 또는 Sulfo 태그에 대 한 볼륨을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>인간의 섬 autoantigen Biotin 또는 Sulfo 태그와 어 금 니 비율 1: 5의 믹스. 참고: ph 7.9 크기 조정 스핀을 사용 하 여 PBS 버퍼 x 2로 교환 한다 tris 또는 글리신 버퍼 시스템 단백질 열.</li>
	<li>Biotin과 Sulfo 태그 빛에 민감한 때문에, 알루미늄 호 일로 반응 튜브 커버. 상 온 (RT) 1 시간에 대 한 반응을 품 어.</li>
	<li>부 화, 동안 프라임 스핀 열 PBS 버퍼 x 디스 2 열에 3 번. 원심 2 분 1000 x g에서 솔루션 각 시간. 참고: 현재 라벨 반응, 브리징, 통해 여전히 발생 하 고 중지 해야 합니다.</li>
	<li>레이블이 지정 된 인간의 섬 autoantigen 정화 하 여 라벨 반응을 중지 합니다. 정화, 스핀 열 통해 autoantigen를 통과 하 고 2 분 1000 x g 열 원심.</li>
	<li>항 원 단백질 및 최종 볼륨을 사용 하 여 레이블이 지정 된 항 원 농도 (µ g / µ L)를 결정 합니다. 참고: 약, 있을 것입니다 분류 항 원의 90-95% 보존 후 모든 스핀 열 전달.</li>
	<li>약-80 ° c.에 레이블이 지정 된 항 원 및 저장소 분류 항 수</li>
</ol>3. 정의 최고의 농도 및 비율 두 분류 항 원에 대 한 분석 결과 (검사기 보드 분석 결과)에 대 한
<ol><li>2 혈 청 샘플, 높은 긍정 및 1 네거티브, 각 200 µ L의 총 볼륨 하나를 준비 합니다.</li>
	<li>혈 청의 aliquot 4 µ L까지 최종 볼륨은 잘 PCR 96 잘 접시 당 20 µ L 1 x PBS를 추가. 그림 2A와 같이 높은 긍정적인 샘플 및 부정적인 샘플에 대 한 나머지 절반에 대 한 접시의 절반을 사용 합니다.</li>
	<li>10 µ L 비타민 b 복합체의 Sulfo 태그에 표시 된 그림 2A로 두 다르게 분류 항 원에 대 한 항 원 및 행위 직렬 희석 분류의 10 µ L를 추가 합니다. 한 분류 항에 대 한 수평 직렬 희석 및 다른 분류 항 원에 대 한 수직 직렬 희석 실행 합니다.</li>
	<li>5.3 9.1에서 설명 하는 분석 결과 단계의 나머지 부분을 계속.</li>
	<li>그림 2B에 부정적인 샘플에서 해당 신호 각각에 대 한 높은 긍정적인 샘플에서 신호의 비율을 계산 합니다.</li>
	<li>Biotin에 최고의 농도 식별 하 고 Sulfo 태그 최고 또는 네거티브 긍정적인의 높은 비율에 가까운 지점을 선택 하 여 항 원 표시. 비율을 식별 하는 부정적인 샘플에서 낮은 배경 신호를 고려 하십시오. 참고: 분석 결과 하루 1 단계 6 단계 4 포함 되어 있습니다.</li>
</ol>4. 준비 Biotin/Sulfo-태그 항 원 표시의 정확한 농도 사용 하 여 항 원 버퍼
<ol><li>검사기 보드 분석 결과에 따라 각 항의 합리적인 농도 선택 합니다.</li>
	<li>3 mL 접시, 합리적인 Biotin/Sulfo-태그 분류 항 버퍼에 대 한 항 원 농도 사용 하 여 당 항 원 솔루션의 준비.</li>
</ol>5. 분류 항 원과 혈 청 샘플을 품 어
참고:이 섹션에서 두 프로토콜, 혈 청 산 성 치료를 하지 않고과 혈 청 산 치료 하나 있습니다. IAA 분석 결과 제외한 모든 섬 autoantibody 분석 IAA 분석 결과 이러한 단계를 생략 하 고 단계 5.6 5.9에서에서 혈 청 산 치료 프로토콜을 사용 하 여 단계 5.1-5.5에서에서 산 치료 혈 청 하지 않고 일반 프로토콜을 사용 합니다.
<ol><li>혈 청의 aliquot 4 µ L까지 최종 볼륨은 잘 PCR 96 잘 접시 당 20 µ L 1 x PBS를 추가.</li>
	<li>잘 당 분류 항 원 솔루션의 20 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>빛을 피하기 위해 호 일 씰링과 PCR 플레이트 커버.</li>
	<li>2 시간에 대 한 실시간에 (저속) 통에 접시를 넣어.</li>
	<li>4 ° C 냉장고에 접시를 넣고 품 어 하룻밤 (18-24 h). 참고: 5.9 5.6에서 단계의 다음 프로토콜은만 위해 IAA 분석 결과 및 다른 autoantibody 분석 실험이이 단계를 건너뜁니다.</li>
	<li>혼합 15 µ L의 혈 청 0.5 M 초 산 각 혈 청 샘플의 18 µ L로. 45 분 RT에이 혼합물을 품 어.</li>
	<li>비타민 b 복합체의 Sulfo-태그 레이블이 검사기 보드 분석 결과에 따라 항 원 antigen 버퍼를 사용 하 여 합리적인 농도와 항 원 솔루션을 준비 합니다. 각 잘, Biotin Sulfo 태그를 포함 하는 항 원 버퍼의 aliquot 35 µ L 분류 항 원, 새로운 PCR 격판덮개로.</li>
	<li>45 분 인큐베이션 (5.6 단계) 단계를 완료 하기 전에 항 원 접시 (단계 5.6)에 각 측에 1 M Tris 버퍼 pH 9.0의 8.3 µ L를 추가 합니다. 그것은 Tris 버퍼와 항 원 간의 혼합을 제한 해야 합니다. 즉시 단계 5.6, 각 우물에서에서 산 처리는 혈 청의 25 µ L를 전송 하 고 솔루션을 선동. 빛을 피하기 위해 호 일 씰링과 PCR 플레이트 커버.</li>
	<li>2 헤 4 ℃ 냉장고에 접시를 넣어에 대 한 실시간에 셰이 커 (저속)에 접시를 넣어 고 품 어 접시 하룻밤 (18-24 h).</li>
</ol>6. 준비 Streptavidin 플레이트
<ol><li>4 ℃ 냉장고에서 streptavidin 접시 하 고 실시간에와 서 접시를 허용</li>
	<li>Streptavidin 접시 RT에 일단 각 잘을 3% 차단 A의 150 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>커버 호 일 씰링과 PCR 접시.</li>
	<li>4 ℃ 냉장고에서 플레이트를 밤새 품 어. 참고: 분석 결과 주 2 단계 9 단계 7 포함 되어 있습니다.</li>
</ol>7. 전송 혈 청/항 Streptavidin 플레이트에 잠복
<ol><li>다음 날, 냉장고에서 streptavidin 접시를 꺼내 고 접시에서 버퍼를 삭제. 테이블에 몇 가지 마른 종이 수건 밖으로 설정 하 고 우물 안에 없다 더 많은 버퍼 때까지 접시를 거꾸로 누릅니다.</li>
	<li>잘 당 PBST의 150 µ L로 빈 streptavidin 접시를 총 세 세척 접시에서 PBST을 삭제.</li>
	<li>전송 30 µ L의 혈 청/항 streptavidin 접시에 잘 당 잠복.</li>
	<li>빛을 피하기 위해 호 일 접시 커버. 1 시간에 대 한 실시간에 낮은 설정에서 접시, 흔들.</li>
</ol>8. 세척 접시 및 읽기 버퍼를 추가
<ol><li>삭제는 접시에서 잠복. 잘 당 PBST의 150 µ L을 추가 하 고 총 세 세척 접시에서 PBST을 삭제.</li>
	<li>세척, 후 읽기 버퍼의 당 150 µ L를 추가 합니다. 참고:이 플레이트 판독기 컴퓨터에 격판덮개를 읽는 방법에 영향을 미칠 것입니다 때문에 솔루션에 기포를 방지 하기 위해 중요 하다.</li>
</ol>9. 접시 읽기 및 데이터 분석
<ol><li>플레이트 리더 기계에 접시를 계산 합니다. 항 체 값 (CPS) 초당 수로 표시 됩니다.</li>
	<li>상대 인덱스 플레이트 리더 기계 로부터 받은 항 체 수준을 전달 합니다. 다음 방정식에서 인덱스를 계산. 값을 인덱스 [CPS (샘플)-CPS (부정적인 제어)] = / [CPS (긍정적인 제어)-CPS (부정적인 제어)].</li>
	<li>긍정적이 고 부정적인 항 체 결과 100 건강 한 제어 과목 (어떤 알려진된 자가 면역 질환과 당뇨병의 가족 역사 없이 없이 비 당뇨병 개인) 99th 백분위 수에 따라 양성, 정의 대 한 커트 오프를 사용 하 여 식별 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Insel, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+presymptomatic+type+1+diabetes:+a+scientific+statement+of+JDRF,+the+Endocrine+Society,+and+the+American+Diabetes+Association.">Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association.</a> Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).</li><li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes:+new+perspectives+on+disease+pathogenesis+and+treatment.">Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment.</a> Lancet. 358 (9277), 221-229 (2001).</li><li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEDDY+Study+Group.+The+6+year+incidence+of+diabetesassociated+autoantibodies+in+genetically+at-risk+children:+the+TEDDY+study.">TEDDY Study Group. The 6 year incidence of diabetesassociated autoantibodies in genetically at-risk children: the TEDDY study.</a> Diabetologia. 58 (5), 980-987 (2015).</li><li>Achenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stratification+of+type+1+diabetes+risk+on+the+basis+of+islet+autoantibody+characteristics.">Stratification of type 1 diabetes risk on the basis of islet autoantibody characteristics.</a> Diabetes. 53 (2), 384-392 (2004).</li><li>Achenbach, P., Bonifacio, E., Koczwara, K., Ziegler, A. 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G., Bonifacio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+high-affinity+immune+responses+to+(pro)insulin+anticipate+the+autoimmune+cascade+that+leads+to+type+1+diabetes.">Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes.</a> J Clin Invest. 114 (4), 589-597 (2004).</li><li>Yu, L., Dong, F., Miao, D., Fouts, A. R., Wenzlau, J. M., Steck, A. K. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinsulin/insulin+autoantibodies+measured+with+electrochemiluminescent+assay+are+the+earliest+indicator+of+prediabetic+islet+autoimmunity.">Proinsulin/insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity.</a> Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).</li><li>Yu, L., Miao, D., Scrimgeour, L., Johnson, K., Rewers, M., Eisenbarth, G. S. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+persistent+insulin+autoantibodies+with+differential+risk:+nonradioactive+bivalent+proinsulin/insulin+autoantibody+assay.">Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay.</a> Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).</li><li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAD65+autoantibodies+detected+by+electrochemiluminescence+assay+identify+high+risk+for+type+1+diabetes.">GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).</li><li>Yu, L. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+Autoantibody+Detection+by+Electrochemiluminescence+(ECL)+Assay.">Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay.</a> Methods Mol Biol. 1433, 85-91 (2016).</li><li>Myler, H. A., McVay, S., Kratzsch, J. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+PEG-hGH+detection+supporting+pharmacokinetic+evaluation+in+growth+hormone+deficient+patients.">Troubleshooting PEG-hGH detection supporting pharmacokinetic evaluation in growth hormone deficient patients.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 61 (2), 92-97 (2010).</li><li>Zhong, Z. D., Dinnogen, S., Hokom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+inhibition+of+drug+target+interference+in+immunogenicity+assays.">Identification and inhibition of drug target interference in immunogenicity assays.</a> J Immunol Methods. 355 (1-2), 21-28 (2010).</li><li>Barker, J. M., Yu, J., Yu, L., Wang, J., Miao, D., Bao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody+&#34;subspecificity&#34;+in+type+1+diabetes:+risk+for+organ-specific+autoimmunity+clusters+in+distinct+groups.">Autoantibody &#34;subspecificity&#34; in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups.</a> Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).</li><li>Triolo, T. M., Armstrong, T. K., McFann, K., Yu, L., Rewers, M. J., Klingensmith, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+autoimmune+disease+found+in+33%+of+patients+at+type+1+diabetes+onset.">Additional autoimmune disease found in 33% of patients at type 1 diabetes onset.</a> Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).</li><li>de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+clinical+significance+of+organ-specific+autoantibodies+in+type+1+diabetes+mellitus.">Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus.</a> Neth J Med. 65 (7), 235-247 (2007).</li></ol>

저자는 공개 없다.

섬 신경은 타입-1 당뇨병의 면역에 대 한 가장 신뢰할 수 있는 biomarkers 현재. 그들은 섬 특정 자가 면역의 개시를 표시 하 고 명백한 질병 위험을 결정 합니다. ECL 분석 결과 섬 신경에 대 한 광범위 하 게 여러 국가 및 국제 타입-1 당뇨병 임상 시험에서 유효성이 검증 되었습니다. 분석 결과 보여주었다 증가 감도 특이성 전류 '골드'에 비해 표준 RBAs. ECL 분석 결과 차별 높은 선호도와 위험이 높은 섬 자가 RBA에 의해 발생 하는 낮은 위험, 낮은 선호도 신호에서 더 높은 질병 특이성에 대 한 그것의 우수한 장점을 보이고 있다. 이 과목만 단일 섬 autoantibody 긍정적인 사람에 특히 주의 하 고 제 1 형 당뇨병에 결코 진행. 이러한 낮은 친 화력 신경 동안 손실 될 것을 발견 했다의 대부분 테스트 년 개월 이내 '과도 긍정적인.'로 서 행동 후속 이전 가설, 이러한 낮은 선호도 '단일' 자가 가능성이 cross-reactive 분자 면역에서 결과. 높은 선호도, 동안 높은 위험 섬 자가 스스로 섬 항 원 가진 면역에서 유래 했다. 또한, ECL 분석 년 출생에서 임상 당뇨병을 미행 했다 사전 당뇨병을 가진 아이 들에 의해 현재 표준 라디오 바인딩 분석 실험 (RBA)에서 '혈'의 시간을 antedate 수 설명 했다. 지속적인 국제 임상 시험는 환경 결정 요인의 당뇨병에는 영 (테 디), 타이밍 및 첫 번째 섬 autoantibody 섬의 처음을 표시 하는 ' 혈'의 모양을 정확 하 게 정확한 감지에 따라 달라 집니다. 면역 및 환경 트리거를 식별. ECL 분석 결과에 감도 증가 대 한 가능한 이유는 그 분석 결과 캡처 모든 면역 글로불린 클래스: IgG, IgM, IgA, ige의 보다는 오히려 전통적인 RBA 또는 ELISA IgG의 탐지에만 의존 하는.
ECL 분석 실험, IAA, 같은 일부 특정 신경에 대 한 자가 항 원에의 바인딩 정상적인 인간 혈 청에 있는 일부 구성 요소에 의해 저해 될 것으로 보인다. 제거 하거나이 저해를 해제, 혈 청 샘플의 산 성 치료 전에 혈 청은 항 원과 인 큐베이 팅 할 필요 했다. [그림 5]에 표시 된 ECL IAA 분석 결과로 마우스 인슐린 단일 클론 항 체와 항 원 가진 환자의 혈 청 신경의 바인딩 활동은 크게 향상 되었습니다. 항 체 분석 실험에서 사용 하는 혈 청 샘플의 산성화 끊을 기존 바운드 단지에 일반적으로 적용 됩니다. IAA 신호는 인간의 혈 청 샘플에 저해 방법과 혈 청의 산성화에 의해 발표 뒤에 메커니즘은 알려져 있지, 하지만이 방법은 다른 ECL 기반 분석14,15에 사용 되었습니다.
몇 가지 경우, 분자 라벨, 비오 틴 또는 항 원 단백질 분자의 라벨 positionsinside Sulfo 태그에는, 또는 항 체 바인딩을 항 체 바인딩 활동을 방해할 수 있는 주요 epitopes 가깝습니다. 이 분석 결과 감도 감소 시킬 것 이다 하 고 완전히 분석 결과 아래로 찢을 수 있다. 루틴 절차를 라벨에 대 한 극대화 또는 채도 모든 가능한 라벨 위치 라벨 용량을 극대화 하 여 최대 활동 또는 레이블이 분자 당 신호를 생성 하기 위해 각 항 원 단백질 분자에 대 한 원한다. 불포화 라벨 (Biotin과 Sulfo 태그) 분자 항 원 단백질에 항 체 바인딩 활동의 중단에 대 한 가능한 이유 되는 항 원에 라벨 라벨의 어 금 니 비율을 감소 시켜 수행 되어야 한다. 주요 epitopes 예약 더 수 있으며 항 체 바인딩 작업의 중단 불포화 라벨 전략을 사용 하 여 대부분의 경우에서 출시 될 수 있습니다.
각 분석 결과 내부 표준 높은 긍정 및 부정적인 제어 알 수 없는 샘플의 인덱스 계산에 포함 되어야 합니다. 일반 컨트롤의 분석 결과 상한 근처 낮은 긍정적인 통제 분석 결과 감도의 모니터링에 대 한 포함 하도록 중요 하다. 실험실 장기 사용에 대 한 표준 긍정적이 고 부정적인 컨트롤의 충분 한 aliquots를 유지 해야 하 고 모든 aliquots는-20 ° c.에 저장 되어야 한다 분석 결과 품질 보증, 각 샘플에 대 한 중복에서 분석 실험을 실행 해야 합니다 및 별도 분석 결과에 샘플을 반복 하 여 모든 긍정적인 결과 확인 해야 합니다. 세 번째 분석 결과 두 번째 확인 분석 결과 첫 번째 분석 결과 동의 하는 2 개의 분석 실험의 결과와 동의 하지 않는 경우 필요 (예:., +, + 또는-,-), 긍정적 이거나 부정적인 결과의 최종 결정 될 것입니다.
플랫폼으로 단일 ECL 분석 실험에 대 한 설정, 다중화 된 분석 결과 이들에서 시 확장 수 있습니다. 그것은 동시에 최대 10 다른 신경에 혈 청의 작은 금액으로 한 단일 잘 확인할 수 있습니다. 현재, 4 개의 섬 자가 IAA를 포함 하 여, 4 월, IA-2A, 및 ZnT8A가 T1D와 일반 인구 환자의 두 친척에서 T1D 진행의 위험 예측에 대 한 중요성. 현재 단일 autoantibody 측정을 사용 하 여 이러한 4 자가 검사에 대 한 활용 방법을 힘들고 비효율적이 고, 특히 대규모 인구 심사에 대 한 있습니다. 중요 한 것은, 최대 T1D 환자의 40% 있다 추가 면역 상태16,,1718. 불행히도, 이러한 조건에 대 한 화면을 간단 하 고 저렴 한 도구가입니다. 멀티플렉스 ECL 분석 결과 오직 하나, 4 현재 주요 섬 autoantibody 분석 실험 결합 가능 하지만 또한 더욱 다른 관련 자가 면역 질환에서 더 많은 autoantibody 분석을 결합 하 여 수 있습니다. 이 효율적으로 대규모 인구에서 동시에 여러 자가 면역 질환에 대 한 심사는 높은 처리량을 가능 하 게. 멀티플렉스 ECL 분석 결과에서 [그림 6]와 같이 액체 단계에서 형성 된 각 항 체 항 원 복합물 것 이다 수 제 지 같은 특정 링커 소스 자리에 잘. 플레이트 리더 기계에 신호 수신기는 관광 명소의 10 다른 소스 로부터 신호를 인식할 수 있습니다. 그러나, 매우 높은 신호 명소 높은 분석 결과 배경 생성 하 고 크로스 토크를 통해 인접 장소에 간섭을 일으킬 수 있습니다. 이러한 이유로, 각 autoantibody 분석 결과 대 한 상한 신호 미만 20000 카운트에 제한 되어야 합니다. 우리의 경험에서는, 더 낮은 배경 가진 자가 높은 카운트 자리 지도 설계 하는 데 그 장소에서 상대적으로 멀리 배치 되어야 합니다. 장기 연구 멀티플렉스 ECL 분석 실험을 사용 하 여, 같은 링커 같은 autoantibody 분석 결과 대 한 분석 결과 일관성 유지를 사용할 수 것이 좋습니다.

최근 준비 분류 체계는 환자에서 T1D의 초기 단계의 진단을 지원 하기 위해 만들어졌습니다. 인간의 섬 신경의 정확한 탐지 식별에 중요 한 역할 그리고 presymptomatic 준비 제 1 형 당뇨병, 섬 자가 존재 β-세포 면역의 존재를 나타냅니다. 당뇨병에 징후 질병에 β-세포 면역의 초기 발생에서 영향을 미치는 환자 수와 섬 신경의 종류와 관련 된 속도가 변수2,3.
Autoantibody 혈, titer, 그리고 섬 신경의 선호도의 시대 증상 타입-1 당뇨병4,5,6,7,8 진행의 속도 영향을 미칠 수 있습니다. ,910. 최근에, 개발된 ECL 분석 실험, 광범위 하 게 검증 된 감도 증가 증명 하고있다 그리고 더 많은 질병-특정10,11,,1213. 이 분석 실험 강화 섬 신경의 이전 검색을 통해 당뇨병 위험의 준비와 예측. 그들은 더 정확 하 게 섬 autoimmunity의 개시를 표시 하 고 당뇨병 관련이 없는 낮은 친 화력과 낮은 위험 신호를 무시 한다.
ECL 분석 결과, 혈 청에 있는 자가 있으면, 액체 단계에서 Sulfo 태그 활용 된 항 원 biotinylated 캡처 항 원에 다리. 브리징, 후 Biotin 링커 단단한 단계에 고 ECL 통해 Sulfo 태그 streptavidin 입히는 격판덮개 (그림 1)에 의해 감지.
이 리뷰에서 인간의 섬 자가 함께 단일 항 체 ECL 분석을 주로 활용 하 고 있습니다. 간단히, 다중화 항 체 분석 실험 단일 ECL 분석에 따라 논의 될 것입니다. 멀티플렉스 분석 결과 15 µ L의 혈 청을 사용 하 여 잘, 10, 하나의 내 신경까지 여러를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 간단한 높은 처리량 분석 결과 화면, 동시에, 일반 인구에서 여러 관련 자가 면역 질환에 대 한 여러 신경에 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Human recombinant proinsulin protein(PINS)</td><td>AmideBio</td><td>Human Proinsulin, Rec</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant GAD65 protein</td><td>Diamyd</td><td>rhGAD65</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant IA-2 protein</td><td>Creative BioMart</td><td>IA2</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>SIGMA-ALORICH</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR plate&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin coated plate</td><td>MSD</td><td>L15SA</td><td></td></tr><tr><td>Zeba sizing spin column</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89890</td><td></td></tr><tr><td>Twen-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI21329</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-tag</td><td>MSD</td><td>R91AO-1</td><td></td></tr><tr><td>Blocker A</td><td>MSD</td><td>R93AA-1</td><td></td></tr><tr><td>4x Read Buffer T with Surfactant</td><td>MSD</td><td>R92TC-1</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-PEG&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-Biotin</td><td>ThermoScience</td><td>21329</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-TAG</td><td>MSD</td><td>R91AO-1</td><td></td></tr><tr><td>96-well polymerase chain reaction (PCR) plate</td><td>Fisher brand</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>96-Well Streptavidin plate</td><td>MSD GOLD</td><td>L 15SA-1</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin Desalting Column</td><td>ThermoScience</td><td>PL208984</td><td></td></tr><tr><td>96-well Plate Shaker</td><td>Perkin Elmer</td><td>1296-003</td><td></td></tr><tr><td>Plate Reader</td><td>MSD</td><td>QuickPlex SQ120</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge with bucket rotary</td><td>Beckman</td><td>Allegra X-15R</td><td></td></tr></tbody></table>

electrochemiluminescence assays for human islet autoantibodies

1 형 당뇨병과 관련 된 섬 자가 정확히 파악 (T1D) 리드 프로젝트 및 일반 인구에 있는이 질병을 억제 하는 방법. 새로운 ECL 분석 결과 높은 감도와 특이성 현재 '골드' 표준 라디오 바인딩 분석 결과 (RBA) 보다 섬 신경에 대 한 nonradioactive 액체 단계 분석 결과가 이다. ECL 분석 보다 정확 하 게 RBAs, 그리고 기존의 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISA에 생성 된 낮은 위험, 낮은 친 화력 신경에서 위험, 높은 선호도 자가 구분 하 여 presymptomatic T1D의 발병을 정의할 수 있습니다. ). ECL 분석 결과이에 사용 되는 항 원 단백질 Sulfo 태그와 Biotin, 각각 표시 됩니다. 특정 항 원 단백질을 사용 하 여 각 ECL autoantibody 분석 결과 실험실 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다 최적화 단계를 필요 합니다. 이 단계는 혈 청 산 성 트리 트 먼 트, 농도, 및 Sulfo 태그와 Biotin 표시 된 두 개의 서로 다른 항 원의 비율에 대 한 요구 사항을 결정 하는 데 특히 중요 합니다. 분석 결과 수행 하기 위해 혈 청 샘플은 혼합 Sulfo 태그 활용 및 biotinylated 캡처 항 원 단백질에 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS), 5%를 포함 하 소 혈 청 알 부 민 (BSA). 나중에, 예제는 인 큐베이 팅 하룻밤 4 ° c.에 같은 날 streptavidin 입히는 격판덮개 차단기 버퍼와 함께 준비 되 고 하룻밤에 4 ° c. 인 큐베이 팅 둘째 날에는 streptavidin 접시를 세척 하 고 접시에 혈 청 항 원 혼합물을 전송 합니다. 판 통에 접시를 놓고 낮은 속도로 그것을 설정 하 고 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어. 그 후, 접시를 다시 세척 하 고 리더 버퍼 추가 됩니다. 접시는 접시 리더 기계에 다음 계산 됩니다. 결과 내부의 양수와 음수를 제어 하는 표준 혈 청 샘플에서 생성 되는 인덱스를 통해 전달 됩니다.

그림 2 는 검사기 보드를 표시합니다. 그것은 Biotin의 그 250 ng/mL 및 250 ng/mL Sulfo 태그 분류 항은 분석 결과 배경, 그리고의 비율으로 높은 긍정적인 컨트롤 샘플, 부정적인 컨트롤 샘플에서 신호를 고려 하는 분석 결과에 사용 하는 가장 합리적인 농도의 표시 긍정 부정적인 신호. 을 최적화 된이 두 분류 항 원 농도 분석 결과 T1D와 건강 한 컨트롤 100 100 새롭게 진단된 된 환자에서 혈 청 샘플 수행 했다. 0.023의 인덱스 값은 양성의 분석 결과 컷오프로 정의 했다. 이 특성 (ROC) 곡선 그림 3A에서 운영 하는 수신기를 사용 하 여 건강 한 컨트롤에서 환자와 99% 특이성 85% 감도를 나타냅니다. 알 수 없는 샘플에 대 한 분석 결과 내부 표준 높은 반응, 낮은 긍정 및 부정적인 컨트롤 샘플 실시 됐다. CPS의 결과에 표시 됩니다 표 2A. 높고 낮은 긍정적인 컨트롤의 CPS 17903 [(19940+15866)/2 빨간색으로 강조 표시 됩니다 의미] 839 [(857+820)/2], 그리고 부정적인 컨트롤 168 [(170+165)/2 녹색으로 강조 표시 됩니다]. 알 수 없는 샘플에 대 한 인덱스 계산 "(CPS샘플-168)/(17903-168)." 표 2B 모든 샘플에 대 한 계산 된 인덱스 값을 보여 줍니다. 0.023는 또한 표 2A에 빨간색으로 작성 된 CPS 값에 해당 하는 빨간색으로 작성 하는 보다 큰 인덱스 값입니다. 이러한 값은 긍정적인 결과 보다 건강 한 제어 인구 99번째 백분위 수로 정의 됩니다. 표 2 c에서와 같이 분석 결과 높은 배경을 해야한다 불합리 한 항 원 농도 사용 하는 경우 긍정적인 항 체의 저급은 A2, A5, D1, 및 H4 테이블 2D에 회색으로 강조 표시 값 처럼 그리울 것 이다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig1.jpg"> 그림 1 : 단일 ECL IAA 분석 결과 대가 판 캡처의 그림. 섬 autoantibody Sulfo 태그 활용 streptavidin 입히는 격판덮개에 단단한 단계에 있는 biotinylated 캡처 항 원에 항 원 혈 청 다리에. 플레이트 캡처 Sulfo 태그 활용된 항 원의 검출 ECL 통해 수행 됩니다. 이 그림에서 유, 수정 된 외. 11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig2.jpg"> 그림 2 : 결정 분석 결과 양성의 컷오프가 ROC 곡선. 감도 85%에 해당 하는 특이성의 99번째 백분위 수 선정 되었다 고 0.023의 인덱스 값으로 표시 됩니다. 분석 결과의이 상한 100 건강 한 컨트롤에서 찍은. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig3.jpg"> 그림 3 : ECL IAA 신호를 차단 하는 정상적인 인간 혈 청의 그림. A: 인슐린 단일 클론 항 체 (모 압)으로 ECL IAA 분석 실험에서 신호 과감 하 게 정상적인 인간 혈 청의 추가 의해 차단 되었습니다. 비교할 때 PBS에서 모 압, 인간의 혈 청은 산으로 대우 될 때 신호 복원 부분적으로 되었다. B: 4 환자 세라와 ECL IAA 분석 결과에서 신호 산 성 치료 크게 향상 했다. 이 그림에서 유, 수정 된 외. 11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig4.jpg"> 그림 4 : 의 Mutiplex ECL 분석 결과 그림. 항 체 항 원 복합물은 특정 링커와 액체 단계에서 형성 된다. 특정 항 체-항 원-링커 단지는 잘 같은 특정 링커 관광 명소의 각 제 지. 플레이트 리더 기계 관광 명소의 다른 소스에서 신호를 구별할 수 이며 각각 10 다른 채널에 CPS 카운트를 제공 합니다. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1.jpg"> 표 1: 농도 및 Biotin의 비율을 결정 하는 검사기 보드 분석 결과 Sulfo 태그 표시 항. A: 원시 CPS 접시 및 다른 반쪽에 부정적인 혈 청의 절반에 높은 긍정적인 혈 청 검사기 보드 판에 대 한 건의. Biotinylated 항 원 농도 시리즈에서 가로로 희석 했다 고 Sulfo 태그 분류 항 원 농도 시리즈에서 수직으로 희석 되었다. B:는 CPS의 비율 값 부정적인 혈 청에서 그들의 해당 CPS의 각각에 대하여 높은 긍정적인 혈 청에서 계산 됩니다. 노란색 강조 표시 된 웰 스 대표 패널 b에서 네거티브 긍정적인의 최고의 비율 이 비율은 250 ng/mL Biotin에 해당 하며 250 ng/mL Sulfo 태그 표시 패널 A 부정적인 혈 청에 대 한 수락 가능 하 게 낮은 CPS 수 있는 항 원 농도. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1large.jpg" target="_blank">이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2.jpg"> 표 2: 시험 결과의 분석. A: 원시 CPS 시험 접시에서 빨간색과 녹색으로 강조 표시 하는 표준 부정적인 컨트롤에서 강조 표시 표준 및 로우 긍정적인 컨트롤과 계산 합니다. 각 샘플 분석 결과에서 중복 되었다. B: 분석 결과 프로토콜에 설명 된 대로 인덱스 값 계산 했다. 0.023 보다 큰 모든 인덱스 값은 빨간색으로 강조 표시, 긍정적인 결과로 정의 했다. C: 원시 CPS는 불합리 한 항 원 농도 사용 된 샘플의 동일한 집합을 가진 시험 접시에서 계산 합니다. 이 높은 배경 귀착되 고 일반적으로 검색, 일부 낮은 반응 패널 B와 같이 패널 디에 회색으로 강조 하는 네거티브에 개조 되었다 <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2large.jpg" target="_blank">이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

여기, 우리는 인간의 섬 자가 electrochemiluminescence (ECL) 분석 실험을 사용 하 여 검색 하는 방법을 제시. 타입 1 당뇨병을 예측 하는 데 사용 되는 프로토콜 자가 다른 자가 면역 질환에 대 한 검색에 따라 확장할 수 있습니다.

인간의 섬 신경에 대 한 Electrochemiluminescence 분석 실험

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

electrochemiluminescence-assays-for-human-islet-autoantibodies

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.4K 조회수.  University of Colorado Denver. 여기, 우리는 인간의 섬 자가 electrochemiluminescence (ECL) 분석 실험을 사용 하 여 검색 하는 방법을 제시. 타입 1 당뇨병을 예측 하는 데 사용 되는 프로토콜 자가 다른 자가 면역 질환에 대 한 검색에 따라 확장할 수 있습니다.

비디오: Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, this assay was used to analyze intrinsic levels of MeCP2 in mouse brain tissue and the uptake of TAT-MeCP2 in human dermal fibroblasts. The MeCP2-ECLIA produces highly accurate and reproducible measurements with low intra- and inter-assay error. In summary, we developed a quantitative method for the evaluation of MeCP2 protein variants that can be utilized in high-throughput screens.

The electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) is a novel approach for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants, which produces highly quantitative, accurate and reproducible measurements with low intra- and inter-assay error over a wide working range. Here, the protocol for the MeCP2-ECLIA in a 96-well format is described.

MeCP2 단백질 변이체에 대한 전기 화학 발광 기반 분석

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

연구

생화학

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels of autoantibodies to specific antigens are typically detected with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique. However, screening for multiple autoantibodies with ELISA can be time-consuming and requires a large quantity of patient sample. The antigen microarray technique is an alternative method that can be used to screen for autoantibodies in a multiplex fashion. In this technique, antigens are arrayed onto specially coated microscope slides with a robotic microarrayer. The slides are probed with patient serum samples and subsequently fluorescent-labeled secondary antibodies are added to detect binding of serum autoantibodies to the antigens. The autoantibody reactivities are revealed and quantified by scanning the slides with a scanner that can detect fluorescent signals. Here we describe methods to generate custom antigen microarrays. Our current arrays are printed with 9 solid pins and can include up to 162 antigens spotted in duplicate. The arrays can be easily customized by changing the antigens in the source plate that is used by the microarrayer. We have developed a two-color secondary antibody detection scheme that can distinguish IgG and IgM reactivities on the same slide surface. The detection system has been optimized to study binding of human and murine autoantibodies.

We describe here a method to generate customizable antigen microarrays that can be used for the simultaneous detection of serum IgG and IgM autoantibodies from humans and mice. These arrays allow for high-throughput and quantitative detection of antibodies against any antigens or epitopes of interest.

의 IgG 및 IgM의자가 항체의 동시 검출을위한 2 색 항원 마이크로 어레이의 생성

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

면역학 및 감염병학

Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

Systemic autoimmune connective tissue disorders are characterized by circulating antinuclear antibodies (ANA). Although there are several technologies available for ANA screening, indirect immunofluorescence (IIF) using Human epithelial cells-2 (HEp-2) substrate remains the primary and recommended method because of its superior sensitivity. HEp-2 substrates can detect a multitude of patterns resulting from autoantibody binding to various protein and nucleic acid autoantigens distributed throughout the nucleus and cytoplasm of the cells. The great diversity of monospecific and mixed patterns resulting from positive reactions on HEp-2 substrate also complicate the interpretation and accuracy of reporting. One specific example which received utmost attention recently is the dense fine speckled 70 (DFS70) pattern resulting from autoantibodies that specifically bind to a protein called lens epithelium derived growth factor (LEDGF). Lack of clear association with a specific systemic autoimmune disease and high prevalence in healthy populations have made accurate interpretation of DFS70 pattern important. Accurate distinction of DFS70 pattern from disease-associated patterns using conventional HEp-2 substrate is challenging. Moreover, frequent co-occurrence of DFS70 pattern along with disease-associated patterns such as homogeneous, speckled, and mixed homogeneous-speckled patterns complicate the IIF interpretation. The goal of this paper is to demonstrate the utility of a novel engineered HEp-2 IIF substrate that retains all advantages of conventional HEp-2 substrate while simultaneously providing the ability to distinguish DFS70 pattern with high confidence in both monospecific and mixed ANA positive examples. The new substrate is further able to unmask disease-associated ANA patterns previously concealed by DFS70 pattern.

DFS70 autoantibodies mimic common disease-associated antinuclear antibody patterns making accurate interpretation challenging when using conventional HEp-2 substrates. The protocol describes advantages of novel engineered HEp-2 substrate over conventional HEp-2 in ANA screening and distinguishing DFS70 patterns with high confidence in both monospecific and mixed ANA positive cases.

Monospecific 및 소설 형 간염-2 엘리트/DFS70 녹아웃 기판으로 아나 심사 중 혼합된 DFS70 패턴의 동시 구별

Systemic autoimmune connective tissue disorders are characterized by circulating antinuclear antibodies (ANA). Although there are several technologies ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune diseases and cancer2. Our aim is to investigate the antigens recognized by human T cells in the autoimmune disease type 1 diabetes 1,3,4,5. To analyze human T-cell responses against tissue where the antigens recognized by T cells are not identified we developed a method to extract protein antigens from human tissue in a format that is compatible with functional assays 6. Previously, T-cell responses to unpurified tissue extracts could not be measured because the extraction methods yield a lysate that contained detergents that were toxic to human peripheral blood mononuclear cells. Here we describe a protocol for extracting proteins from human tissues in a format that is not toxic to human T cells. The tissue is homogenized in a mixture of butan-1-ol, acetonitrile and water (BAW). The protein concentration in the tissue extract is measured and a known mass of protein is aliquoted into tubes. After extraction, the organic solvents are removed by lyophilization. Lyophilized tissue extracts can be stored until required. For use in assays of immune function, a suspension of immune cells, in appropriate culture media, can be added directly to the lyophilized extract. Cytokine production and proliferation by PBMC, in response to extracts prepared using this method, were readily measured. Hence, our method allows the rapid preparation of human tissue lysates that can be used as a source of antigens in the analysis of T-cell responses. We suggest that this method will facilitate the analysis of adaptive immune responses to tissues in transplantation, cancer and autoimmunity.

A simple protocol for preparing extracts of human tissue to be used as a source of antigens in functional T-cell assays is described. This method allows T-cell responses to tissue-derived antigens to be measured in vitro.

기능 Assays을위한 조직 항원의 추출

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

생물학

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the spontaneous non-obese diabetes (NOD) mouse model, insulin is the primary target, and genetic manipulation of these animals to remove a single key insulin epitope prevents disease. Thus, selective elimination of professional antigen presenting cells (APCs) bearing this pathogenic epitope is an approach to inhibit the unwanted insulin-specific autoimmune responses, and likely has greater translational potential.
Chimeric antigen receptors (CARs) can redirect T cells to selectively target disease-causing antigens. This technique is fundamental to recent attempts to use cellular engineering for adoptive cell therapy to treat multiple cancers. In this protocol, we describe an optimized T-cell retrovirus (RV) transduction and in vitro expansion protocol that generates high numbers of functional antigen-specific CD8 CAR-T cells starting from a low number of naive cells. Previously multiple CAR-T cell protocols have been described, but typically with relatively low transduction efficiency and cell viability following transduction. In contrast, our protocol provides up to 90% transduction efficiency, and the cells generated can survive more than two weeks in vivo and significantly delay disease onset following a single infusion. We provide a detailed description of the cell maintenance and transduction protocol, so that the critical steps can be easily followed. The whole procedure from primary cell isolation to CAR expression can be performed within 14 days. The general method may be applied to any mouse disease model in which the target is known. Similarly, the specific application (targeting a pathogenic peptide/MHC class II complex) is applicable to any other autoimmune disease model for which a key complex has been identified.

This article describes a protocol for the generation of antigen-specific CD8 T cells, and their expansion in vitro, with the aim of yielding high numbers of functional T cells for use in vitro and in vivo.

자가 면역 당뇨병 모델에서 기능 테스트를 위한 항원 특이적 원발성 원발성 T 세포의 고효율 생성

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous insulin assays have existed for decades, the recent advent of homogeneous time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer (HTRF) technology has significantly simplified these measurements. This is a rapid, cost-effective, reproducible, and robust optical assay reliant upon antibodies conjugated to bright fluorophores with long lasting emission which facilitates time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer. Moreover, HTRF insulin detection is amenable for the development of high-throughput screening assays. Here we use HTRF to detect insulin secretion in INS-1E cells, a rat insulinoma-derived cell line. This allows us to estimate basal levels of insulin and their changes in response to glucose stimulation. In addition, we use this insulin detection system to confirm the role of dopamine as a negative regulator of glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). In a similar manner, other dopamine D2-like receptor agonists, quinpirole, and bromocriptine, reduce GSIS in a concentration-dependent manner. Our results highlight the utility of the HTRF insulin assay format in determining the role of numerous drugs in GSIS and their pharmacological profiles.

Here, we present homogeneous time resolved FRET (HTRF) as an efficient method for rapid detection of insulin secreted from cells.

균질 시간 해결 포스터 공명 에너지 전송 기반 분석 결과 인슐린 분 비의 검출에 대 한

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

의학

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated insulin release. Assessment of mitophagy is challenging and often requires genetic reporters or multiple complementary techniques not easily utilized in tissue samples, such as primary human pancreatic islets. Here we demonstrate a robust approach to visualize and quantify formation of key endogenous mitophagy complexes in primary human pancreatic islets. Utilizing the sensitive proximity ligation assay technique to detect interaction of the mitophagy regulators NRDP1 and USP8, we are able to specifically quantify formation of essential mitophagy complexes in situ. By coupling this approach to counterstaining for the transcription factor PDX1, we can quantify mitophagy complexes, and the factors that can impair mitophagy, specifically within beta cells. The methodology we describe overcomes the need for large quantities of cellular extracts required for other protein-protein interaction studies, such as immunoprecipitation (IP) or mass spectrometry, and is ideal for precious human islet&#160;samples generally not available in sufficient quantities for these approaches. Further, this methodology obviates the need for flow sorting techniques to purify beta cells from a heterogeneous islet population for downstream protein applications. Thus, we describe a valuable protocol for visualization of mitophagy highly compatible for use in heterogeneous and limited cell populations.

This protocol outlines a method for quantitative analysis of mitophagy protein complex formation specifically in beta cells from primary human islet samples. This technique thus allows analysis of mitophagy from limited biological material, which are crucial in precious human pancreatic beta cell samples.

근접 결찰 분석분석서를 활용한 인간 췌장 베타 세포에서 내인성 미토파기 복합체의 시각화

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19

An ongoing clinical trial, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), is the first screening study in the general population for type 1 diabetes (T1D) and celiac disease in the United States. With the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic, the epidemiology of COVID-19 in the general population and knowledge about the association between COVID-19 infection and T1D development are urgently needed. The currently standard screening method of the radio-binding assay (RBA) has met two great challenges: low efficiency with a single assay format and low disease specificity with a large proportion of low-affinity antibodies generated in screening. With the platform of the multiplex electrochemiluminescence (ECL) assay we established previously, a novel 6-Plex ECL assay was developed that combines, in a single well, all four islet autoantibodies (IAbs) to insulin, glutamic acid decarboxylase (GAD65), insulinoma antigen 2 (IA-2), and Zinc transporter 8 (ZnT8) for T1D, transglutaminase autoantibodies (TGA) for celiac disease, and severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) receptor-binding domain (RBD) antibodies for COVID-19. The assay was validated in blind using 880 samples from the ASK study, including 325 positive samples and 555 all antibody-negative samples, and compared with the standard RBAs and a single ECL assay. With the advantages of high efficiency, low cost, and low serum volume, this assay has been accepted as the primary screening tool for the ASK study.

In line with the urgent need for screening for type 1 diabetes, celiac disease, and coronavirus disease 2019, we developed a high throughput 6-Plex electrochemiluminescence assay to simultaneously detect all four islet autoantibodies, tissue transglutaminase autoantibodies, and antibodies to the receptor binding domain of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2.

제1형 당뇨병, 체강 질병 및 COVID-19에 대한 고처리량 멀티플렉스 스크리닝

An ongoing clinical trial, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), is the first screening study in the general population for type 1 diabetes (T1D) and ...

A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases

Islet autoantibodies (IAbs) are widely used in type 1 diabetes (T1D) diagnosis and prediction. Four major IAbs to insulin (IAA), glutamate decarboxylase-65 (GADA), insulinoma antigen-2 (IA-2A), and zinc transporter-8 (ZnT8A) are equally important in disease prediction. Presently, up to 40% of patients diagnosed with T1D go on to develop other autoimmune disorders. Unfortunately, current screening methods using a single autoantibody for measurement are laborious and inefficient for large scale screening studies. We recently developed a simple multiplexed electrochemiluminescence (ECL) assay to address these current issues. The assay combines all 7 autoantibody tests into one well. Each well includes three IAbs (IAA, GADA, and IA-2A), autoantibodies to thyroid peroxidase (TPOA) and thyroid globulin (ThGA) to detect autoimmune thyroid disease, autoantibodies to tissue transglutaminase (TGA) for celiac disease, and autoantibodies to interferon alpha (IFN&#945;A) for autoimmune polyglandular syndrome-1 (APS-1); all of which screen for T1D and other relevant autoimmune diseases, simultaneously. The multiplex ECL assay is based on the single ECL assay platform, but instead uses the multiplex plate combining multiple autoantibody assays, up to 10, into a single well. The main difference from the single ECL assay is that each antibody-antigen complex formed in the fluid-phase is restrained onto a specific spot on each well through a linker system on the multiplex plate. The 7-Plex ECL assay, in the present study, is validated against standard radio-binding assays (RBA) and single ECL assays, using a large cohort of newly diagnosed T1D patients and age-matched healthy controls, resulting in excellent assay sensitivity and specificity.

We model a simple multiplexed ECL assay that combines 7 autoantibody assays together. The assay is capable of screening for T1D and multiple other autoimmune diseases, simultaneously, including celiac disease, autoimmune thyroid disease, and autoimmune polyglandular syndrome 1.