이 작품은 NIH에 의해 지원 되었다 DK32083, JDRF 그랜트 2-SRA-2015-51-Q-R를 부여.

1. 버퍼 준비
<ol><li>버퍼 (2 x PBS, pH 7.9) 라벨: 이온된 (DD) 증류수의 400 Ml에서 100 mL 10 x PBS의 추가, NaOH와 7.9에 pH를 조정.</li>
	<li>Biotin의 3 m m: 버퍼 라벨의 588 µ L에서 1mg Biotin의 해산.</li>
	<li>3mm Sulfo 태그: 버퍼 라벨의 50 µ L에 Sulfo 태그의 해산 150 nmol.</li>
	<li>항 원 버퍼 (5 %BSA): 1 x PBS의 500 Ml, 25 g 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 추가.</li>
	<li>0.5 M 초 산 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>Tris HCl 버퍼 pH 9.0의 1.0 M: 준비 1 M Tris-HCl 9.0 HCl로 pH를 조정 하 고, 버퍼.</li>
	<li>코팅 버퍼 (3% 차단 A): 1 x PBS의 500 Ml, 추가 차단 A. 15 g</li>
	<li>세척 버퍼 (0.05% 트윈 20, PBST): 1 x PBS의 5000 Ml에서 2.5 mL 트윈 20의 추가.</li>
	<li>읽기 버퍼 (계면 활성 제와 읽기 버퍼 T x 2): DD 물 500 Ml, 500 mL 계면 활성 제 (자료 테이블)와 읽기 버퍼 T x 4의 추가.</li>
	<li>-20 ° C 냉장고에 Biotin과 Sulfo 태그를 저장 합니다. 참고: 모두 Biotin과 Sulfo 태그 솔루션 항상 갓 준비 해야 레이블 프로시저의 바로 전에.</li>
</ol>2. 인간의 섬 Autoantigen Biotin과 Sulfo 태그 라벨
참고: 높은 농도의 항 원, 이들 mg/mL, 보다 효율적인 라벨 반응 좋습니다.
<ol><li>Biotin과 Sulfo 태그에 대 한 인간의 섬 autoantigen의 어 금 니 비율을 결정 합니다.<ol>
<li>분자 무게에 의해 항 원 무게를 분할 하 여 항 원 어 금 니 번호를 가져올.</li>
		<li>작은 분자량 (≤ 10 kd)와 항 원에 대 한 1: 5의 어 금 니 비율을 사용 하 여 더 큰 분자량과 항 원에 대 한 1시 20분의 어 금 니 비율 (> 50 kd).</li>
		<li>농도 의해 몰 수를 나누어 Biotin 또는 Sulfo 태그에 대 한 볼륨을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>인간의 섬 autoantigen Biotin 또는 Sulfo 태그와 어 금 니 비율 1: 5의 믹스. 참고: ph 7.9 크기 조정 스핀을 사용 하 여 PBS 버퍼 x 2로 교환 한다 tris 또는 글리신 버퍼 시스템 단백질 열.</li>
	<li>Biotin과 Sulfo 태그 빛에 민감한 때문에, 알루미늄 호 일로 반응 튜브 커버. 상 온 (RT) 1 시간에 대 한 반응을 품 어.</li>
	<li>부 화, 동안 프라임 스핀 열 PBS 버퍼 x 디스 2 열에 3 번. 원심 2 분 1000 x g에서 솔루션 각 시간. 참고: 현재 라벨 반응, 브리징, 통해 여전히 발생 하 고 중지 해야 합니다.</li>
	<li>레이블이 지정 된 인간의 섬 autoantigen 정화 하 여 라벨 반응을 중지 합니다. 정화, 스핀 열 통해 autoantigen를 통과 하 고 2 분 1000 x g 열 원심.</li>
	<li>항 원 단백질 및 최종 볼륨을 사용 하 여 레이블이 지정 된 항 원 농도 (µ g / µ L)를 결정 합니다. 참고: 약, 있을 것입니다 분류 항 원의 90-95% 보존 후 모든 스핀 열 전달.</li>
	<li>약-80 ° c.에 레이블이 지정 된 항 원 및 저장소 분류 항 수</li>
</ol>3. 정의 최고의 농도 및 비율 두 분류 항 원에 대 한 분석 결과 (검사기 보드 분석 결과)에 대 한
<ol><li>2 혈 청 샘플, 높은 긍정 및 1 네거티브, 각 200 µ L의 총 볼륨 하나를 준비 합니다.</li>
	<li>혈 청의 aliquot 4 µ L까지 최종 볼륨은 잘 PCR 96 잘 접시 당 20 µ L 1 x PBS를 추가. 그림 2A와 같이 높은 긍정적인 샘플 및 부정적인 샘플에 대 한 나머지 절반에 대 한 접시의 절반을 사용 합니다.</li>
	<li>10 µ L 비타민 b 복합체의 Sulfo 태그에 표시 된 그림 2A로 두 다르게 분류 항 원에 대 한 항 원 및 행위 직렬 희석 분류의 10 µ L를 추가 합니다. 한 분류 항에 대 한 수평 직렬 희석 및 다른 분류 항 원에 대 한 수직 직렬 희석 실행 합니다.</li>
	<li>5.3 9.1에서 설명 하는 분석 결과 단계의 나머지 부분을 계속.</li>
	<li>그림 2B에 부정적인 샘플에서 해당 신호 각각에 대 한 높은 긍정적인 샘플에서 신호의 비율을 계산 합니다.</li>
	<li>Biotin에 최고의 농도 식별 하 고 Sulfo 태그 최고 또는 네거티브 긍정적인의 높은 비율에 가까운 지점을 선택 하 여 항 원 표시. 비율을 식별 하는 부정적인 샘플에서 낮은 배경 신호를 고려 하십시오. 참고: 분석 결과 하루 1 단계 6 단계 4 포함 되어 있습니다.</li>
</ol>4. 준비 Biotin/Sulfo-태그 항 원 표시의 정확한 농도 사용 하 여 항 원 버퍼
<ol><li>검사기 보드 분석 결과에 따라 각 항의 합리적인 농도 선택 합니다.</li>
	<li>3 mL 접시, 합리적인 Biotin/Sulfo-태그 분류 항 버퍼에 대 한 항 원 농도 사용 하 여 당 항 원 솔루션의 준비.</li>
</ol>5. 분류 항 원과 혈 청 샘플을 품 어
참고:이 섹션에서 두 프로토콜, 혈 청 산 성 치료를 하지 않고과 혈 청 산 치료 하나 있습니다. IAA 분석 결과 제외한 모든 섬 autoantibody 분석 IAA 분석 결과 이러한 단계를 생략 하 고 단계 5.6 5.9에서에서 혈 청 산 치료 프로토콜을 사용 하 여 단계 5.1-5.5에서에서 산 치료 혈 청 하지 않고 일반 프로토콜을 사용 합니다.
<ol><li>혈 청의 aliquot 4 µ L까지 최종 볼륨은 잘 PCR 96 잘 접시 당 20 µ L 1 x PBS를 추가.</li>
	<li>잘 당 분류 항 원 솔루션의 20 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>빛을 피하기 위해 호 일 씰링과 PCR 플레이트 커버.</li>
	<li>2 시간에 대 한 실시간에 (저속) 통에 접시를 넣어.</li>
	<li>4 ° C 냉장고에 접시를 넣고 품 어 하룻밤 (18-24 h). 참고: 5.9 5.6에서 단계의 다음 프로토콜은만 위해 IAA 분석 결과 및 다른 autoantibody 분석 실험이이 단계를 건너뜁니다.</li>
	<li>혼합 15 µ L의 혈 청 0.5 M 초 산 각 혈 청 샘플의 18 µ L로. 45 분 RT에이 혼합물을 품 어.</li>
	<li>비타민 b 복합체의 Sulfo-태그 레이블이 검사기 보드 분석 결과에 따라 항 원 antigen 버퍼를 사용 하 여 합리적인 농도와 항 원 솔루션을 준비 합니다. 각 잘, Biotin Sulfo 태그를 포함 하는 항 원 버퍼의 aliquot 35 µ L 분류 항 원, 새로운 PCR 격판덮개로.</li>
	<li>45 분 인큐베이션 (5.6 단계) 단계를 완료 하기 전에 항 원 접시 (단계 5.6)에 각 측에 1 M Tris 버퍼 pH 9.0의 8.3 µ L를 추가 합니다. 그것은 Tris 버퍼와 항 원 간의 혼합을 제한 해야 합니다. 즉시 단계 5.6, 각 우물에서에서 산 처리는 혈 청의 25 µ L를 전송 하 고 솔루션을 선동. 빛을 피하기 위해 호 일 씰링과 PCR 플레이트 커버.</li>
	<li>2 헤 4 ℃ 냉장고에 접시를 넣어에 대 한 실시간에 셰이 커 (저속)에 접시를 넣어 고 품 어 접시 하룻밤 (18-24 h).</li>
</ol>6. 준비 Streptavidin 플레이트
<ol><li>4 ℃ 냉장고에서 streptavidin 접시 하 고 실시간에와 서 접시를 허용</li>
	<li>Streptavidin 접시 RT에 일단 각 잘을 3% 차단 A의 150 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>커버 호 일 씰링과 PCR 접시.</li>
	<li>4 ℃ 냉장고에서 플레이트를 밤새 품 어. 참고: 분석 결과 주 2 단계 9 단계 7 포함 되어 있습니다.</li>
</ol>7. 전송 혈 청/항 Streptavidin 플레이트에 잠복
<ol><li>다음 날, 냉장고에서 streptavidin 접시를 꺼내 고 접시에서 버퍼를 삭제. 테이블에 몇 가지 마른 종이 수건 밖으로 설정 하 고 우물 안에 없다 더 많은 버퍼 때까지 접시를 거꾸로 누릅니다.</li>
	<li>잘 당 PBST의 150 µ L로 빈 streptavidin 접시를 총 세 세척 접시에서 PBST을 삭제.</li>
	<li>전송 30 µ L의 혈 청/항 streptavidin 접시에 잘 당 잠복.</li>
	<li>빛을 피하기 위해 호 일 접시 커버. 1 시간에 대 한 실시간에 낮은 설정에서 접시, 흔들.</li>
</ol>8. 세척 접시 및 읽기 버퍼를 추가
<ol><li>삭제는 접시에서 잠복. 잘 당 PBST의 150 µ L을 추가 하 고 총 세 세척 접시에서 PBST을 삭제.</li>
	<li>세척, 후 읽기 버퍼의 당 150 µ L를 추가 합니다. 참고:이 플레이트 판독기 컴퓨터에 격판덮개를 읽는 방법에 영향을 미칠 것입니다 때문에 솔루션에 기포를 방지 하기 위해 중요 하다.</li>
</ol>9. 접시 읽기 및 데이터 분석
<ol><li>플레이트 리더 기계에 접시를 계산 합니다. 항 체 값 (CPS) 초당 수로 표시 됩니다.</li>
	<li>상대 인덱스 플레이트 리더 기계 로부터 받은 항 체 수준을 전달 합니다. 다음 방정식에서 인덱스를 계산. 값을 인덱스 [CPS (샘플)-CPS (부정적인 제어)] = / [CPS (긍정적인 제어)-CPS (부정적인 제어)].</li>
	<li>긍정적이 고 부정적인 항 체 결과 100 건강 한 제어 과목 (어떤 알려진된 자가 면역 질환과 당뇨병의 가족 역사 없이 없이 비 당뇨병 개인) 99th 백분위 수에 따라 양성, 정의 대 한 커트 오프를 사용 하 여 식별 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Insel, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+presymptomatic+type+1+diabetes:+a+scientific+statement+of+JDRF,+the+Endocrine+Society,+and+the+American+Diabetes+Association.">Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association.</a> Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).</li><li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes:+new+perspectives+on+disease+pathogenesis+and+treatment.">Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment.</a> Lancet. 358 (9277), 221-229 (2001).</li><li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEDDY+Study+Group.+The+6+year+incidence+of+diabetesassociated+autoantibodies+in+genetically+at-risk+children:+the+TEDDY+study.">TEDDY Study Group. The 6 year incidence of diabetesassociated autoantibodies in genetically at-risk children: the TEDDY study.</a> Diabetologia. 58 (5), 980-987 (2015).</li><li>Achenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stratification+of+type+1+diabetes+risk+on+the+basis+of+islet+autoantibody+characteristics.">Stratification of type 1 diabetes risk on the basis of islet autoantibody characteristics.</a> Diabetes. 53 (2), 384-392 (2004).</li><li>Achenbach, P., Bonifacio, E., Koczwara, K., Ziegler, A. 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G., Bonifacio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+high-affinity+immune+responses+to+(pro)insulin+anticipate+the+autoimmune+cascade+that+leads+to+type+1+diabetes.">Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes.</a> J Clin Invest. 114 (4), 589-597 (2004).</li><li>Yu, L., Dong, F., Miao, D., Fouts, A. R., Wenzlau, J. M., Steck, A. K. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinsulin/insulin+autoantibodies+measured+with+electrochemiluminescent+assay+are+the+earliest+indicator+of+prediabetic+islet+autoimmunity.">Proinsulin/insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity.</a> Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).</li><li>Yu, L., Miao, D., Scrimgeour, L., Johnson, K., Rewers, M., Eisenbarth, G. S. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+persistent+insulin+autoantibodies+with+differential+risk:+nonradioactive+bivalent+proinsulin/insulin+autoantibody+assay.">Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay.</a> Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).</li><li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAD65+autoantibodies+detected+by+electrochemiluminescence+assay+identify+high+risk+for+type+1+diabetes.">GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).</li><li>Yu, L. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+Autoantibody+Detection+by+Electrochemiluminescence+(ECL)+Assay.">Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay.</a> Methods Mol Biol. 1433, 85-91 (2016).</li><li>Myler, H. A., McVay, S., Kratzsch, J. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+PEG-hGH+detection+supporting+pharmacokinetic+evaluation+in+growth+hormone+deficient+patients.">Troubleshooting PEG-hGH detection supporting pharmacokinetic evaluation in growth hormone deficient patients.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 61 (2), 92-97 (2010).</li><li>Zhong, Z. D., Dinnogen, S., Hokom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+inhibition+of+drug+target+interference+in+immunogenicity+assays.">Identification and inhibition of drug target interference in immunogenicity assays.</a> J Immunol Methods. 355 (1-2), 21-28 (2010).</li><li>Barker, J. M., Yu, J., Yu, L., Wang, J., Miao, D., Bao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody+&#34;subspecificity&#34;+in+type+1+diabetes:+risk+for+organ-specific+autoimmunity+clusters+in+distinct+groups.">Autoantibody &#34;subspecificity&#34; in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups.</a> Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).</li><li>Triolo, T. M., Armstrong, T. K., McFann, K., Yu, L., Rewers, M. J., Klingensmith, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+autoimmune+disease+found+in+33%+of+patients+at+type+1+diabetes+onset.">Additional autoimmune disease found in 33% of patients at type 1 diabetes onset.</a> Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).</li><li>de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+clinical+significance+of+organ-specific+autoantibodies+in+type+1+diabetes+mellitus.">Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus.</a> Neth J Med. 65 (7), 235-247 (2007).</li></ol>

저자는 공개 없다.

섬 신경은 타입-1 당뇨병의 면역에 대 한 가장 신뢰할 수 있는 biomarkers 현재. 그들은 섬 특정 자가 면역의 개시를 표시 하 고 명백한 질병 위험을 결정 합니다. ECL 분석 결과 섬 신경에 대 한 광범위 하 게 여러 국가 및 국제 타입-1 당뇨병 임상 시험에서 유효성이 검증 되었습니다. 분석 결과 보여주었다 증가 감도 특이성 전류 '골드'에 비해 표준 RBAs. ECL 분석 결과 차별 높은 선호도와 위험이 높은 섬 자가 RBA에 의해 발생 하는 낮은 위험, 낮은 선호도 신호에서 더 높은 질병 특이성에 대 한 그것의 우수한 장점을 보이고 있다. 이 과목만 단일 섬 autoantibody 긍정적인 사람에 특히 주의 하 고 제 1 형 당뇨병에 결코 진행. 이러한 낮은 친 화력 신경 동안 손실 될 것을 발견 했다의 대부분 테스트 년 개월 이내 '과도 긍정적인.'로 서 행동 후속 이전 가설, 이러한 낮은 선호도 '단일' 자가 가능성이 cross-reactive 분자 면역에서 결과. 높은 선호도, 동안 높은 위험 섬 자가 스스로 섬 항 원 가진 면역에서 유래 했다. 또한, ECL 분석 년 출생에서 임상 당뇨병을 미행 했다 사전 당뇨병을 가진 아이 들에 의해 현재 표준 라디오 바인딩 분석 실험 (RBA)에서 '혈'의 시간을 antedate 수 설명 했다. 지속적인 국제 임상 시험는 환경 결정 요인의 당뇨병에는 영 (테 디), 타이밍 및 첫 번째 섬 autoantibody 섬의 처음을 표시 하는 ' 혈'의 모양을 정확 하 게 정확한 감지에 따라 달라 집니다. 면역 및 환경 트리거를 식별. ECL 분석 결과에 감도 증가 대 한 가능한 이유는 그 분석 결과 캡처 모든 면역 글로불린 클래스: IgG, IgM, IgA, ige의 보다는 오히려 전통적인 RBA 또는 ELISA IgG의 탐지에만 의존 하는.
ECL 분석 실험, IAA, 같은 일부 특정 신경에 대 한 자가 항 원에의 바인딩 정상적인 인간 혈 청에 있는 일부 구성 요소에 의해 저해 될 것으로 보인다. 제거 하거나이 저해를 해제, 혈 청 샘플의 산 성 치료 전에 혈 청은 항 원과 인 큐베이 팅 할 필요 했다. [그림 5]에 표시 된 ECL IAA 분석 결과로 마우스 인슐린 단일 클론 항 체와 항 원 가진 환자의 혈 청 신경의 바인딩 활동은 크게 향상 되었습니다. 항 체 분석 실험에서 사용 하는 혈 청 샘플의 산성화 끊을 기존 바운드 단지에 일반적으로 적용 됩니다. IAA 신호는 인간의 혈 청 샘플에 저해 방법과 혈 청의 산성화에 의해 발표 뒤에 메커니즘은 알려져 있지, 하지만이 방법은 다른 ECL 기반 분석14,15에 사용 되었습니다.
몇 가지 경우, 분자 라벨, 비오 틴 또는 항 원 단백질 분자의 라벨 positionsinside Sulfo 태그에는, 또는 항 체 바인딩을 항 체 바인딩 활동을 방해할 수 있는 주요 epitopes 가깝습니다. 이 분석 결과 감도 감소 시킬 것 이다 하 고 완전히 분석 결과 아래로 찢을 수 있다. 루틴 절차를 라벨에 대 한 극대화 또는 채도 모든 가능한 라벨 위치 라벨 용량을 극대화 하 여 최대 활동 또는 레이블이 분자 당 신호를 생성 하기 위해 각 항 원 단백질 분자에 대 한 원한다. 불포화 라벨 (Biotin과 Sulfo 태그) 분자 항 원 단백질에 항 체 바인딩 활동의 중단에 대 한 가능한 이유 되는 항 원에 라벨 라벨의 어 금 니 비율을 감소 시켜 수행 되어야 한다. 주요 epitopes 예약 더 수 있으며 항 체 바인딩 작업의 중단 불포화 라벨 전략을 사용 하 여 대부분의 경우에서 출시 될 수 있습니다.
각 분석 결과 내부 표준 높은 긍정 및 부정적인 제어 알 수 없는 샘플의 인덱스 계산에 포함 되어야 합니다. 일반 컨트롤의 분석 결과 상한 근처 낮은 긍정적인 통제 분석 결과 감도의 모니터링에 대 한 포함 하도록 중요 하다. 실험실 장기 사용에 대 한 표준 긍정적이 고 부정적인 컨트롤의 충분 한 aliquots를 유지 해야 하 고 모든 aliquots는-20 ° c.에 저장 되어야 한다 분석 결과 품질 보증, 각 샘플에 대 한 중복에서 분석 실험을 실행 해야 합니다 및 별도 분석 결과에 샘플을 반복 하 여 모든 긍정적인 결과 확인 해야 합니다. 세 번째 분석 결과 두 번째 확인 분석 결과 첫 번째 분석 결과 동의 하는 2 개의 분석 실험의 결과와 동의 하지 않는 경우 필요 (예:., +, + 또는-,-), 긍정적 이거나 부정적인 결과의 최종 결정 될 것입니다.
플랫폼으로 단일 ECL 분석 실험에 대 한 설정, 다중화 된 분석 결과 이들에서 시 확장 수 있습니다. 그것은 동시에 최대 10 다른 신경에 혈 청의 작은 금액으로 한 단일 잘 확인할 수 있습니다. 현재, 4 개의 섬 자가 IAA를 포함 하 여, 4 월, IA-2A, 및 ZnT8A가 T1D와 일반 인구 환자의 두 친척에서 T1D 진행의 위험 예측에 대 한 중요성. 현재 단일 autoantibody 측정을 사용 하 여 이러한 4 자가 검사에 대 한 활용 방법을 힘들고 비효율적이 고, 특히 대규모 인구 심사에 대 한 있습니다. 중요 한 것은, 최대 T1D 환자의 40% 있다 추가 면역 상태16,,1718. 불행히도, 이러한 조건에 대 한 화면을 간단 하 고 저렴 한 도구가입니다. 멀티플렉스 ECL 분석 결과 오직 하나, 4 현재 주요 섬 autoantibody 분석 실험 결합 가능 하지만 또한 더욱 다른 관련 자가 면역 질환에서 더 많은 autoantibody 분석을 결합 하 여 수 있습니다. 이 효율적으로 대규모 인구에서 동시에 여러 자가 면역 질환에 대 한 심사는 높은 처리량을 가능 하 게. 멀티플렉스 ECL 분석 결과에서 [그림 6]와 같이 액체 단계에서 형성 된 각 항 체 항 원 복합물 것 이다 수 제 지 같은 특정 링커 소스 자리에 잘. 플레이트 리더 기계에 신호 수신기는 관광 명소의 10 다른 소스 로부터 신호를 인식할 수 있습니다. 그러나, 매우 높은 신호 명소 높은 분석 결과 배경 생성 하 고 크로스 토크를 통해 인접 장소에 간섭을 일으킬 수 있습니다. 이러한 이유로, 각 autoantibody 분석 결과 대 한 상한 신호 미만 20000 카운트에 제한 되어야 합니다. 우리의 경험에서는, 더 낮은 배경 가진 자가 높은 카운트 자리 지도 설계 하는 데 그 장소에서 상대적으로 멀리 배치 되어야 합니다. 장기 연구 멀티플렉스 ECL 분석 실험을 사용 하 여, 같은 링커 같은 autoantibody 분석 결과 대 한 분석 결과 일관성 유지를 사용할 수 것이 좋습니다.

최근 준비 분류 체계는 환자에서 T1D의 초기 단계의 진단을 지원 하기 위해 만들어졌습니다. 인간의 섬 신경의 정확한 탐지 식별에 중요 한 역할 그리고 presymptomatic 준비 제 1 형 당뇨병, 섬 자가 존재 β-세포 면역의 존재를 나타냅니다. 당뇨병에 징후 질병에 β-세포 면역의 초기 발생에서 영향을 미치는 환자 수와 섬 신경의 종류와 관련 된 속도가 변수2,3.
Autoantibody 혈, titer, 그리고 섬 신경의 선호도의 시대 증상 타입-1 당뇨병4,5,6,7,8 진행의 속도 영향을 미칠 수 있습니다. ,910. 최근에, 개발된 ECL 분석 실험, 광범위 하 게 검증 된 감도 증가 증명 하고있다 그리고 더 많은 질병-특정10,11,,1213. 이 분석 실험 강화 섬 신경의 이전 검색을 통해 당뇨병 위험의 준비와 예측. 그들은 더 정확 하 게 섬 autoimmunity의 개시를 표시 하 고 당뇨병 관련이 없는 낮은 친 화력과 낮은 위험 신호를 무시 한다.
ECL 분석 결과, 혈 청에 있는 자가 있으면, 액체 단계에서 Sulfo 태그 활용 된 항 원 biotinylated 캡처 항 원에 다리. 브리징, 후 Biotin 링커 단단한 단계에 고 ECL 통해 Sulfo 태그 streptavidin 입히는 격판덮개 (그림 1)에 의해 감지.
이 리뷰에서 인간의 섬 자가 함께 단일 항 체 ECL 분석을 주로 활용 하 고 있습니다. 간단히, 다중화 항 체 분석 실험 단일 ECL 분석에 따라 논의 될 것입니다. 멀티플렉스 분석 결과 15 µ L의 혈 청을 사용 하 여 잘, 10, 하나의 내 신경까지 여러를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 간단한 높은 처리량 분석 결과 화면, 동시에, 일반 인구에서 여러 관련 자가 면역 질환에 대 한 여러 신경에 사용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="643">
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:292px;">Human recombinant proinsulin protein(PINS)</td>
			<td style="width:151px;">AmideBio</td>
			<td style="width:137px;">Human Proinsulin, Rec</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human recombinant GAD65 protein</td>
			<td style="width:151px;">Diamyd</td>
			<td style="width:137px;">rhGAD65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human recombinant IA-2 protein</td>
			<td style="width:151px;">Creative BioMart</td>
			<td style="width:137px;">IA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10x PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:151px;">SIGMA-ALORICH</td>
			<td style="width:137px;">A7906-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well PCR plate&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>14230232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin coated plate</td>
			<td style="width:151px;">MSD</td>
			<td style="width:137px;">L15SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba sizing spin column</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Twen-20</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HCl</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma Base</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EZ-Link Biotin</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sulfo-tag</td>
			<td style="width:151px;">MSD</td>
			<td>R91AO-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blocker A</td>
			<td style="width:151px;">MSD</td>
			<td style="width:137px;">R93AA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4x Read Buffer T with Surfactant</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R92TC-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>ThermoScience</td>
			<td>21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sulfo-TAG</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R91AO-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well polymerase chain reaction (PCR) plate</td>
			<td style="width:151px;">Fisher brand</td>
			<td style="width:137px;">14230232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-Well Streptavidin plate</td>
			<td style="width:151px;">MSD GOLD</td>
			<td style="width:137px;">L 15SA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td style="width:151px;">ThermoScience</td>
			<td style="width:137px;">PL208984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Plate Shaker</td>
			<td style="width:151px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:137px;">1296-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plate Reader</td>
			<td style="width:151px;">MSD</td>
			<td style="width:137px;">QuickPlex SQ120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Benchtop centrifuge with bucket rotary</td>
			<td style="width:151px;">Beckman</td>
			<td style="width:137px;">Allegra X-15R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrochemiluminescence assays for human islet autoantibodies

1 형 당뇨병과 관련 된 섬 자가 정확히 파악 (T1D) 리드 프로젝트 및 일반 인구에 있는이 질병을 억제 하는 방법. 새로운 ECL 분석 결과 높은 감도와 특이성 현재 '골드' 표준 라디오 바인딩 분석 결과 (RBA) 보다 섬 신경에 대 한 nonradioactive 액체 단계 분석 결과가 이다. ECL 분석 보다 정확 하 게 RBAs, 그리고 기존의 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISA에 생성 된 낮은 위험, 낮은 친 화력 신경에서 위험, 높은 선호도 자가 구분 하 여 presymptomatic T1D의 발병을 정의할 수 있습니다. ). ECL 분석 결과이에 사용 되는 항 원 단백질 Sulfo 태그와 Biotin, 각각 표시 됩니다. 특정 항 원 단백질을 사용 하 여 각 ECL autoantibody 분석 결과 실험실 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다 최적화 단계를 필요 합니다. 이 단계는 혈 청 산 성 트리 트 먼 트, 농도, 및 Sulfo 태그와 Biotin 표시 된 두 개의 서로 다른 항 원의 비율에 대 한 요구 사항을 결정 하는 데 특히 중요 합니다. 분석 결과 수행 하기 위해 혈 청 샘플은 혼합 Sulfo 태그 활용 및 biotinylated 캡처 항 원 단백질에 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS), 5%를 포함 하 소 혈 청 알 부 민 (BSA). 나중에, 예제는 인 큐베이 팅 하룻밤 4 ° c.에 같은 날 streptavidin 입히는 격판덮개 차단기 버퍼와 함께 준비 되 고 하룻밤에 4 ° c. 인 큐베이 팅 둘째 날에는 streptavidin 접시를 세척 하 고 접시에 혈 청 항 원 혼합물을 전송 합니다. 판 통에 접시를 놓고 낮은 속도로 그것을 설정 하 고 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어. 그 후, 접시를 다시 세척 하 고 리더 버퍼 추가 됩니다. 접시는 접시 리더 기계에 다음 계산 됩니다. 결과 내부의 양수와 음수를 제어 하는 표준 혈 청 샘플에서 생성 되는 인덱스를 통해 전달 됩니다.

그림 2 는 검사기 보드를 표시합니다. 그것은 Biotin의 그 250 ng/mL 및 250 ng/mL Sulfo 태그 분류 항은 분석 결과 배경, 그리고의 비율으로 높은 긍정적인 컨트롤 샘플, 부정적인 컨트롤 샘플에서 신호를 고려 하는 분석 결과에 사용 하는 가장 합리적인 농도의 표시 긍정 부정적인 신호. 을 최적화 된이 두 분류 항 원 농도 분석 결과 T1D와 건강 한 컨트롤 100 100 새롭게 진단된 된 환자에서 혈 청 샘플 수행 했다. 0.023의 인덱스 값은 양성의 분석 결과 컷오프로 정의 했다. 이 특성 (ROC) 곡선 그림 3A에서 운영 하는 수신기를 사용 하 여 건강 한 컨트롤에서 환자와 99% 특이성 85% 감도를 나타냅니다. 알 수 없는 샘플에 대 한 분석 결과 내부 표준 높은 반응, 낮은 긍정 및 부정적인 컨트롤 샘플 실시 됐다. CPS의 결과에 표시 됩니다 표 2A. 높고 낮은 긍정적인 컨트롤의 CPS 17903 [(19940+15866)/2 빨간색으로 강조 표시 됩니다 의미] 839 [(857+820)/2], 그리고 부정적인 컨트롤 168 [(170+165)/2 녹색으로 강조 표시 됩니다]. 알 수 없는 샘플에 대 한 인덱스 계산 "(CPS샘플-168)/(17903-168)." 표 2B 모든 샘플에 대 한 계산 된 인덱스 값을 보여 줍니다. 0.023는 또한 표 2A에 빨간색으로 작성 된 CPS 값에 해당 하는 빨간색으로 작성 하는 보다 큰 인덱스 값입니다. 이러한 값은 긍정적인 결과 보다 건강 한 제어 인구 99번째 백분위 수로 정의 됩니다. 표 2 c에서와 같이 분석 결과 높은 배경을 해야한다 불합리 한 항 원 농도 사용 하는 경우 긍정적인 항 체의 저급은 A2, A5, D1, 및 H4 테이블 2D에 회색으로 강조 표시 값 처럼 그리울 것 이다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig1.jpg"> 그림 1 : 단일 ECL IAA 분석 결과 대가 판 캡처의 그림. 섬 autoantibody Sulfo 태그 활용 streptavidin 입히는 격판덮개에 단단한 단계에 있는 biotinylated 캡처 항 원에 항 원 혈 청 다리에. 플레이트 캡처 Sulfo 태그 활용된 항 원의 검출 ECL 통해 수행 됩니다. 이 그림에서 유, 수정 된 외. 11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig2.jpg"> 그림 2 : 결정 분석 결과 양성의 컷오프가 ROC 곡선. 감도 85%에 해당 하는 특이성의 99번째 백분위 수 선정 되었다 고 0.023의 인덱스 값으로 표시 됩니다. 분석 결과의이 상한 100 건강 한 컨트롤에서 찍은. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig3.jpg"> 그림 3 : ECL IAA 신호를 차단 하는 정상적인 인간 혈 청의 그림. A: 인슐린 단일 클론 항 체 (모 압)으로 ECL IAA 분석 실험에서 신호 과감 하 게 정상적인 인간 혈 청의 추가 의해 차단 되었습니다. 비교할 때 PBS에서 모 압, 인간의 혈 청은 산으로 대우 될 때 신호 복원 부분적으로 되었다. B: 4 환자 세라와 ECL IAA 분석 결과에서 신호 산 성 치료 크게 향상 했다. 이 그림에서 유, 수정 된 외. 11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig4.jpg"> 그림 4 : 의 Mutiplex ECL 분석 결과 그림. 항 체 항 원 복합물은 특정 링커와 액체 단계에서 형성 된다. 특정 항 체-항 원-링커 단지는 잘 같은 특정 링커 관광 명소의 각 제 지. 플레이트 리더 기계 관광 명소의 다른 소스에서 신호를 구별할 수 이며 각각 10 다른 채널에 CPS 카운트를 제공 합니다. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1.jpg"> 표 1: 농도 및 Biotin의 비율을 결정 하는 검사기 보드 분석 결과 Sulfo 태그 표시 항. A: 원시 CPS 접시 및 다른 반쪽에 부정적인 혈 청의 절반에 높은 긍정적인 혈 청 검사기 보드 판에 대 한 건의. Biotinylated 항 원 농도 시리즈에서 가로로 희석 했다 고 Sulfo 태그 분류 항 원 농도 시리즈에서 수직으로 희석 되었다. B:는 CPS의 비율 값 부정적인 혈 청에서 그들의 해당 CPS의 각각에 대하여 높은 긍정적인 혈 청에서 계산 됩니다. 노란색 강조 표시 된 웰 스 대표 패널 b에서 네거티브 긍정적인의 최고의 비율 이 비율은 250 ng/mL Biotin에 해당 하며 250 ng/mL Sulfo 태그 표시 패널 A 부정적인 혈 청에 대 한 수락 가능 하 게 낮은 CPS 수 있는 항 원 농도. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1large.jpg" target="_blank">이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2.jpg"> 표 2: 시험 결과의 분석. A: 원시 CPS 시험 접시에서 빨간색과 녹색으로 강조 표시 하는 표준 부정적인 컨트롤에서 강조 표시 표준 및 로우 긍정적인 컨트롤과 계산 합니다. 각 샘플 분석 결과에서 중복 되었다. B: 분석 결과 프로토콜에 설명 된 대로 인덱스 값 계산 했다. 0.023 보다 큰 모든 인덱스 값은 빨간색으로 강조 표시, 긍정적인 결과로 정의 했다. C: 원시 CPS는 불합리 한 항 원 농도 사용 된 샘플의 동일한 집합을 가진 시험 접시에서 계산 합니다. 이 높은 배경 귀착되 고 일반적으로 검색, 일부 낮은 반응 패널 B와 같이 패널 디에 회색으로 강조 하는 네거티브에 개조 되었다 <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2large.jpg" target="_blank">이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

여기, 우리는 인간의 섬 자가 electrochemiluminescence (ECL) 분석 실험을 사용 하 여 검색 하는 방법을 제시. 타입 1 당뇨병을 예측 하는 데 사용 되는 프로토콜 자가 다른 자가 면역 질환에 대 한 검색에 따라 확장할 수 있습니다.

인간의 섬 신경에 대 한 Electrochemiluminescence 분석 실험

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

electrochemiluminescence-assays-for-human-islet-autoantibodies

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.4K 조회수.  University of Colorado Denver. 여기, 우리는 인간의 섬 자가 electrochemiluminescence (ECL) 분석 실험을 사용 하 여 검색 하는 방법을 제시. 타입 1 당뇨병을 예측 하는 데 사용 되는 프로토콜 자가 다른 자가 면역 질환에 대 한 검색에 따라 확장할 수 있습니다.

비디오: Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

Bluetongue 바이러스에 대한 항 바이러스제 소설의 식별에 대한 분석

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

연구

면역학 및 감염병학

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

이중 색깔 시간 게이트 자극 방출 고갈 (STED) Nanoscopy에 의한 면역 시냅스의 시각화

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

사용하여 전통과 소설 오버레이 시스템 : 플라크 분석 실험을 통해 바이러스 농도 결정

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

초기 바이러스 성 항목 식별을위한 분석 실험 및 항 바이러스 화합물의 평가

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

정성 및 정량 검출을위한 시험 법 및 단백질 항생제 특성

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels of autoantibodies to specific antigens are typically detected with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique. However, screening for multiple autoantibodies with ELISA can be time-consuming and requires a large quantity of patient sample. The antigen microarray technique is an alternative method that can be used to screen for autoantibodies in a multiplex fashion. In this technique, antigens are arrayed onto specially coated microscope slides with a robotic microarrayer. The slides are probed with patient serum samples and subsequently fluorescent-labeled secondary antibodies are added to detect binding of serum autoantibodies to the antigens. The autoantibody reactivities are revealed and quantified by scanning the slides with a scanner that can detect fluorescent signals. Here we describe methods to generate custom antigen microarrays. Our current arrays are printed with 9 solid pins and can include up to 162 antigens spotted in duplicate. The arrays can be easily customized by changing the antigens in the source plate that is used by the microarrayer. We have developed a two-color secondary antibody detection scheme that can distinguish IgG and IgM reactivities on the same slide surface. The detection system has been optimized to study binding of human and murine autoantibodies.

We describe here a method to generate customizable antigen microarrays that can be used for the simultaneous detection of serum IgG and IgM autoantibodies from humans and mice. These arrays allow for high-throughput and quantitative detection of antibodies against any antigens or epitopes of interest.

의 IgG 및 IgM의자가 항체의 동시 검출을위한 2 색 항원 마이크로 어레이의 생성

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin acquisition at the bacterial cell surface plays in resistance to the host immune system. Flow cytometry experiments identified human plasma vitronectin as a ligand for the bacterial receptor outer membrane protein H of Haemophilus influenzae type f. An enzyme-linked immunosorbent assay was employed to characterize the protein-protein interactions between purified recombinant protein H and vitronectin, and binding affinity was assessed using bio-layer interferometry. The biological importance of the binding of vitronectin to protein H at the bacterial cell surface in evasion of the host immune response was confirmed using a serum resistance assay with normal and vitronectin-depleted human serum. The importance of vitronectin in bacterial adherence was analyzed using glass slides with and without vitronectin coating, followed by Gram staining. Finally, bacterial adhesion to human alveolar epithelial cell monolayers was investigated. The protocols described here can be easily adapted to the study of any bacterial species of interest.

This report describes protocols for characterizing interactions between bacterial outer membrane proteins and the human complement regulator vitronectin. The protocols can be used to study the binding reactions and biological function of vitronectin in any bacterial species.

세균성 접착 및 혈 청 저항에 Vitronectin의 역할을 공부에 대 한 분석

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

심사 분석 실험 소설 내 피 레 귤 레이 터 염증 반응에 관여 하

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

사용 하 여 MDCK SIAT1 세포 분석 실험 측정 인플루엔자 항 체 응답 Microneutralization에 의해 인간의 세라에 A(H3N2) 바이러스를 중화

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to the development of type 2 diabetes mellitus (T2DM). Although the mechanisms for the chemical-induced &#946; cell damage were unclear and likely to be complex, one recurring finding is that these chemicals induce oxidative stress leading to the generation of excessive reactive oxygen species (ROS) which induce damage to the &#946; cell. To identify potential diabetogenic environmental chemicals, we isolated pancreatic islet cells from C57BL/6 mice and cultured islet cells in 96-well cell culture plates; then, the islet cells were dosed with chemicals and the ROS generation was detected by 2',7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) fluorescent dye. Using this method, we found that bisphenol A (BPA), Benzo[a]pyrene (BaP), and polychlorinated biphenyls (PCBs), could induce high levels of ROS, suggesting that they may potentially induce damage in islet cells. This method should be useful for screening diabetogenic xenobiotics. In addition, the cultured islet cells may also be adapted for in vitro analysis of chemical-induced toxicity in pancreatic cells.

Here we present a protocol to isolate mouse pancreatic islet cells for screening the ROS inductions by the xenobiotics in order to identify the potential diabetogenic xenobiotic chemicals.

Diabetogenic 환경 화학 물질에 대 한 Murine 췌 장 섬 세포 기반 검사

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...