Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Start-Zuschuss von der Abteilung für Pathologie, Universität von Utah, J.C.S.B.

1. Identifizierung Synergie Vorhersage Mutanten aus chemisch-Genetik Dataset durch die Überlappung2 Methode (O2M)
Hinweis: Dies ist die Methode zur Identifizierung von Synergie Vorhersage Mutanten mit der veröffentlichten Dataset von Nichols Et Al. 17 in E. Coli. Allerdings kann dies auf alle chemisch-Genetik-Dataset und Mikroorganismus erfolgen. Diese Datensätze enthalten eine Bibliothek von Ko-Mutanten gewachsen in Anwesenheit von mehr als 100 kleine Moleküle geben ein quantitatives Wachstum Punktzahl für jede Mutante in jedem kleinen Molekül. Eine synergistische Paar muss bekannt sein sollte, und es Wachstum Noten für beide kleine Moleküle, die in dem Dataset enthalten.
<ol><li>
Berechnen Sie die mittlere Wachstum Partitur und Standardabweichung für alle Mutanten in Anwesenheit einer einzigen Konzentration jedes kleine Molekül gewachsen. Hinweis: Dies kann mit jedem Tabellenkalkulations-Software. Die braunen Lab verwendet Excel und die Funktionen =AVERAGE(B3:B3981) und =STDEV(B3:B3981) für die Berechnungen der einzelnen Spalten kleiner Moleküle.<ol>
<li>Berechnen Sie die Mittel und die Standardabweichungen aus jeder Spalte kleiner Moleküle, obwohl diese Ausrichtung unterschiedlich sein kann, wenn ein anderes Dataset verwenden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Z-Scores für jede Konzentration kleiner Moleküle mit der gleichen Dataset von Nichols Et al.zu berechnen. 17 in einem Tabellenkalkulationsprogramm. Hierzu werden negative Z-Scores Z(2.5) = bedeuten - 2,5 * Standardabweichung und positive Z-Scores werden Z(2.5) = Mittelwert + 2,5 * Standardabweichung.</li>
	<li>Bestimmen Sie, welche gen Mutanten enthalten bedeutende Z-Scores in den kleinen Molekülen, aus denen das bekannte synergistische Paar, als sicher zu betrachten alle Konzentrationen von diesen Molekülen besteht. Wenn das Wachstum, das Ergebnis einer Mutante ist weniger als die negative Z (2.5) Punkten oder größer als die positive Z (2.5) Punktzahl für dieses kleine Molekül ist, ist es als signifikant betrachtet.</li>
	<li>Festzustellen Sie, ob eines der bedeutenden gen Mutanten zu einem Operon gehören. Hinweis: Für E. Coli, die Autoren empfehlen "Ecoli Wiki" für Informationen bezüglich wenn Gene als Bestandteil einer Polycistronic RNA transkribiert werden.</li>
	<li>Gen/Operon Mutanten, die für die Mehrzahl der kleinen Moleküle von Interesse bei verschiedenen Konzentrationen sind zu identifizieren (z. B.., bei der Suche nach Molekülen, die mit dem Antibiotikum Trimethoprim synergize identifizieren Mutanten, die eine signifikante Z zeigen Ergebnis, wenn in Gegenwart von Trimethoprim und ihren bekannten synergistischen Partnern wie Sulfamethizole oder Sulfamethoxazole gewachsen). Dies sind vermeintliche Synergie Vorhersage Mutanten.</li>
</ol>(2) Vorhersage von Synergizers innerhalb der Chemie-Genetik-Dataset von O2M
<ol><li>Rückkehr in das Dataset17, identifizieren Sie jede Konzentration von kleines Molekül, das eine deutliche Zuwächse Punktzahl aus der Synergie Vorhersage Mutante entlockt. Dies geschieht anhand der Z-Scores berechnet für jede Konzentration von kleinen Molekülen. Wiederum ist ein signifikantes Wachstum Ergebnis kleiner als der negativen Z-Score oder größer als die positive Z-Score für diese Konzentration kleiner Moleküle. Hinweis: Wenn ein Molekül auch nur eines ihrer Konzentrationen angezeigt wird, wird das Molekül eine prognostizierte Synergizer betrachtet. Jedes Molekül, das kein deutliches Wachstum Partitur entlocken ist eine vorhergesagte nicht Synergizer.</li>
</ol>3. Überprüfung der vorhergesagten synergistische Wechselwirkungen
<ol><li>Suche nach minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) der prognostizierten Synergizers.
	<ol>
<li>Wachsen einer Übernachtung Kultur von E. Coli in M9 minimal Media bei 37 ° C. Hinweis: Jede Nacht Kultur kann in angemessen definierte Medium für den Organismus von Interesse gewachsen. Die braunen Lab empfiehlt nicht rich-Media wie LB oder YPD. M9 minimalste Medien besteht aus 10,5 g/L M9 Brühe, 0,2 % Casamino Säuren, 0,1 M CaCl2, 0,4 % Glukose, 1 M MgSO4, Nikotinsäure 0,25 % und 0,33 % Thiamin in H2O.</li>
		<li>Wenn keine MHK-Daten für Erreger von Interesse in der Literatur nach Erhalt die kleinen Moleküle gefunden wird in Dimethyl Sulfoxid (DMSO) in einer hohen Konzentration auflöst (> 10 mg/mL).</li>
		<li>Fügen Sie mithilfe einer 96-Well-Platte 100 µL der M9 Medien in jede Vertiefung. Fügen Sie eine zusätzliche 100 µL der M9 Medien in Spalte 1, so es eine Gesamtmenge von 200 µL enthält.</li>
		<li>Fügen Sie eine beliebige Anzahl (~ 10 µL) konzentrierte niedermolekularer Lösung in Spalte 1. Ein kleines Molekül pro Bohrloch von Spalte 1 (8 kleine Moleküle pro Platte). Hinweis: Dies sind die kleinen Moleküle des Interesses, die voraussichtlich synergize. Das braune Labor fügt in der Regel 10 µL der hochkonzentrierten niedermolekularer Lösung, die unter dem Betrag von 100 % DMSO ist, die E. Colihemmen können.</li>
		<li>Sobald die kleinen Moleküle hinzugekommen sind, verdünnen Sie die kleinen Moleküle auf der x-Achse der Platte. Nehmen Sie 100 µL Lösung von Spalte 1, in Spalte 2 und vermischen. Nehmen Sie 100 µL aus Spalte 2, Spalte 3 und vermischen. Fortfahren Sie, bis 100 µL in Spalte 11 platziert sind. Spalte 11 mischen, dann nehmen Sie 100 µL aus der Spalte und verwerfen. Lassen Sie die Spalte 12 mit nur Medien, die Daten zu normieren.</li>
		<li>Die Platte zu impfen. Erhalten Sie die optische Dichte (OD600) von einer Übernacht-Kultur. Bereiten Sie eine Lösung mit der Kultur und M9-Medien auf einem OD-600 von 0,002 (oder entsprechende Konzentration, die 500 Zellen/µL für den gewünschten Organismus von Interesse darstellt). Pipette 2 µL Kulturlösung in jede Vertiefung der Platte, so gibt es 1.000 Zellen pro Bohrloch.</li>
		<li>Schütteln Sie die Platte und erhalten Sie die OD600 für die 0 h lesen. Lassen Sie die Platte bei 37 ° C für 24 Std. erhalten die OD600 für die 24 h lesen wachsen. Hinweis: Verwendung geeigneten Anbaubedingungen für andere Organismen von Interesse.</li>
		<li>Berechnen Sie die Netto-Wachstum für jeden gut mit einem Tabellenkalkulationsprogramm.</li>
		<li>Durchschnitt der Nettozuwachs der Spalte 12 im Durchschnitt keine Droge Wachstum zu erhalten. Die weiteren Bohrungen auf den Durchschnitt der kein Medikament Wachstum mit einem Tabellenkalkulationsprogramm zu normalisieren. Suchen Sie nach jeder gut mit weniger als 10 % Wachstum, die MIC90 zu identifizieren. Alle gut mit weniger als 50 % Wachstum zeigt die MIC50. Berechnen Sie die Konzentration der kleinen Molekül in den Brunnen.</li>
	</ol></li>
	<li>Schachbrett-Assays für die synergistische Wechselwirkungen
	<ol>
<li>Wachsen Sie eine Übernachtung Kultur von E. Coli in M9 minimal Medien wie vor. Hinweis: Verwendung geeigneten Anbaubedingungen für andere Organismen.</li>
		<li>Jede Vertiefung einer 96-well-Platte und eine zusätzliche 100 µL in Spalte 1 100 µL der M9 Medien hinzufügen.</li>
		<li>Fügen Sie das Test kleines Molekül (~ 8 x MIC) zueinander auch in Spalte 1 und fügen Sie verdoppeln die Konzentration (~ 16 x MIC) gut a1 (ein kleines Molekül getestet pro Platte). Hinweis: Dieser Betrag ergibt sich aus der MIC Test abgeschlossen vor und unterscheidet sich für jede mögliche Synergizer.</li>
		<li>Erstellen Sie eine Farbverlauf Verdünnung auf der x-Achse von 100 µL aus Spalte 1 und Spalte 2. Fortfahren Sie, bis 100 µL, Spalte 11 hinzugefügt wird. Mischen, dann 100 µL aus Spalte 11 nehmen und entsorgen. Spalte 12 (Abbildung 1A) keines Medikament hinzufügen.</li>
		<li>Das zweite Medikament Gefälle über die y-Achse für die Eingabe Droge eingerichtet. Fügen Sie 100 µL Medium mit 2 x MIC input Moleküls in Zeile A. Mix und als vor dem verdünnen, wobei 100 µL aus Zeile A und Platzierung in B. weiter bis 100 µL in Zeile G. Mix platziert wird, nehmen Sie 100 µL und entsorgen, Gewährleistung nicht fügen Sie jede Eingabe Droge in Reihe H. Dadurch können Zeilen-H und 12 einzelne Mikrofone der Droge paar getestet (Abbildung 1 b) enthalten.</li>
		<li>Die Platte zu impfen. Fügen Sie 2 µL einer E. Coli -Kultur von OD600 0,002 in jede Vertiefung (1.000 Zellen pro Well).</li>
		<li>Messen Sie die OD600 von jedem Bohrloch in der Platte für die 0 h Lesung.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte für 24 h bei 37 ° c</li>
		<li>Messen Sie die OD600 von jedem Bohrloch um 24 Uhr.</li>
	</ol></li>
	<li>Berechnung des fraktionierten hemmende Konzentration Index (FICI) von Schachbretter
	<ol>
<li>Berechnen Sie die Netto-Wachstum für jede Vertiefung der Platte durch Subtraktion der OD600 um 0 Uhr die OD600 bei 24 h in einem Tabellenkalkulationsprogramm.</li>
		<li>Das Wachstum in der Software durch Teilung jedes gut durch gut H12, enthält kein kleines Molekül zu normalisieren.</li>
		<li>Finden Sie die MIC90 des Eingabe-Moleküls in Spalte 12 und die MIC90 von potenziellen Synergist in Reihe H.</li>
		<li>Suchen Sie nach alle Brunnen, die 90 % Wachstum zu hemmen.</li>
		<li>Berechnen Sie die FICI90 für die gut, die entweder die niedrigste unten (synergistische) oder oben (antagonistisch) höchste beide MIC90 Werte, unter Verwendung der Gleichung: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57241/57241eq1.jpg">
</li>
		<li>Betrachten alle FICI ≤ 0,5 als synergistische und FICI ≥ 4 als antagonistisch (Abbildung 2). Hinweis: Dies geht auch mit MIC50 (50 % Hemmung des Wachstums), ein FICI50, basierend auf diesen Werten MIC zu bekommen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bliss-Unabhängigkeit-Assay Hinweis: Bliss Unabhängigkeit wird mit jeder möglichen Synergist geführt, die nicht über ein Mikrofon auf eigene.<ol>
<li>Wie zuvor wachsen Sie eine Nacht Kultur von E. Coli in M9 Medien bei 37 ° C. Hinweis: Können geeignete Wachstumsbedingungen für andere Organismen von Interesse in diesem Schritt wiederverwendet werden.</li>
		<li>Bereiten Sie 96-Well Platten für die Prüfung der potentiellen synergistischen Molekül, das Eingabe-Molekül und die Kombination einer unbehandelten Kontrolle vor.</li>
		<li>Erstellen Sie die potenziellen Synergist Platte durch Zugabe von 50 µL der M9 Medien in jede Vertiefung. Jede Vertiefung einer Zeile fügen Sie 50 µL der Medien mit einer bestimmten Konzentration (10 µM oder 100 µM hinzu) von den potenziellen Synergist. Testen Sie 8 Moleküle pro Platte.</li>
		<li>Erstellen Sie die Eingabe-Molekül-Platte durch Zugabe von 50 µL der Medien in jede Vertiefung. Fügen Sie 50 µL mit 4 X MIC input Droge in jede Vertiefung in Spalte 1. Erstellen Sie eine Farbverlauf Verdünnung entlang der x-Achse ähnlich MIC Platten, wobei 50 µL aus Spalte 1, Dispergieren und mischen in Spalte 2. Fortfahren Sie, bis Spalte 12, 50 µL aus Spalte 12 Entsorgung. Fügen Sie eine zusätzliche 50 µL der Medien in jede Vertiefung, also Ende insgesamt für jedes gut 100 µL.</li>
		<li>Fügen Sie die Kombination Platte mithilfe einer 96-well-Platte erstellen hinzu, 50 µL der Medien in jede Vertiefung. Fügen Sie 50 µL mit 4 X MIC input Droge in jede Vertiefung in Spalte 1. Verdünnen Sie entlang der x-Achse ähnlich wie MIC Platten, wobei 50 µL aus Spalte 1, Dispergieren und mischen in Spalte 2. Auch weiterhin diese den ganzen Weg bis Spalte 12, 50 µL aus Spalte 12 Entsorgung. Fügen Sie 50 µL Medium, das die potenziellen Synergisten bei 10 µM oder 100 µM in jede Vertiefung einer Zeile enthält. Auch hier sollte eine Konzentration oder Medikament pro Zeile.</li>
		<li>Erstellen der unbehandelten Kontrolle durch Zugabe von 100 µL der M9 Medien in alle Vertiefungen der Platte.</li>
		<li>Impfen Sie alle Platten durch Zugabe von 2 µL der Bakterienkultur mit einem OD-600 von 0,002 oder 1.000 Zellen in jede Vertiefung als vor.</li>
		<li>Messen Sie die OD600 von jedem Bohrloch bei 0 und 24 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Berechnung der Glückseligkeit Unabhängigkeit Gäste
	<ol>
<li>Berechnen Sie die Netto-Wachstum für jede Vertiefung der Platte durch Subtraktion der OD600 um 0 Uhr vom Wachstum um 24 Uhr mit einem Tabellenkalkulationsprogramm.</li>
		<li>Normalisieren der Brunnen, das durchschnittliche Wachstum von der keine Droge-Platte in einem Tabellenkalkulationsprogramm.</li>
		<li>Berechnen Sie Tabellenkalkulations-Software verwenden, die Hemmung durch Subtrahieren der Nettozuwachs von 1.</li>
		<li>Durchschnitt der Spalten in der Steuerelement-Platte, die nur die Eingabe Gradienten in der Tabellenkalkulations-Software enthalten.</li>
		<li>Berechnen Sie die Glückseligkeit Score für jede Vertiefung durch die Gleichung: Bliss-Score = (auch X + Eingabespalte X) – kombiniert gut X
</li>
		<li>Suchen Sie nach negativen Punktzahlen in Brunnen unter die MIC90 des Eingangs. Hinweis: Negative Resultate über mehrere Konzentrationen würde eine synergistische Interaktion zeigen.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Hochdurchsatz-Screen mit Synergy Vorhersage Mutanten, neuartige synergistische Paare zu identifizieren
<ol><li>
Synergie-Vorhersage-Mutanten zu identifizieren Hinweis: Schritt 1.5 identifiziert vermeintliche Synergie Vorhersage Mutanten. Hier bestimmen wir, welche diese Mutanten funktioniert am besten in einem Hochdurchsatz-Bildschirm für synergistische Drogen. Dieser Assay in einer Bioscreen-Maschine durchgeführt, aber 96-well-Platte-Leser sollte auch akzeptabel.<ol>
<li>Wachsen Sie jede vermeintliche Synergie Vorhersage Mutanten und Wildtyp Zellen in M9 minimal Medien.</li>
		<li>Richten Sie die 100 gut Waben-Platte (oder 96-well-Platte) mit dem entsprechenden Wachstumsmedium, Wachstumsmedium + Eingabe Medikament, Wachstumsmedium + bekannte synergistische Partner der Eingabe Droge und Wachstumsmedium + bekannte nicht synergistische Droge. Sicherstellen Sie, dass Fahrzeug Steuerelemente enthalten. Hinweis: Wir empfehlen, dass vier Brunnen für jede Belastung/Wirkstoffkonzentration replizieren.</li>
		<li>Impfen Sie 1.000 Zellen pro Bohrloch, einschließlich der leeren Kontroll-Vertiefungen.</li>
		<li>48 h bei 37 ° C mit schütteln, zu wachsen und alle 20 min OD600 zu lesen.</li>
		<li>Bestimmen Sie Medikament Konzentration und Zeit-Punkt, der das größte Wachstum Unterschied zwischen Wildtyp und Synergie Vorhersage mutierten Zellen in Anwesenheit der Eingabe Medikament und seine bekannten synergistische Partner zeigt. An der optimalen Zeitpunkt und Konzentration sollte nicht viel Wachstum Unterschied zwischen Wildtyp und Synergie Vorhersage mutierten Zellen wenn in Gegenwart von Drogen bekannt Handlungsfähigkeit nicht synergistisch mit dem Eingang Medikament (Abbildung 3) gewachsen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hochdurchsatz-Bildschirm für synergistische Drogen
	<ol>
<li>Wachsen Sie Wildtyp Zellen und Synergie Vorhersage mutierten Zellen in M9 minimal Medien. Hinweis: Verwenden Sie geeignete Wachstumsmedium für Organismus von Interesse.</li>
		<li>Fügen Sie Medikamente aus der Bibliothek hinzu, um Medien so dass jeder auch die 100 µL Medien mit kleinen Molekülen in festgelegten Konzentration enthält, die im vorherigen Schritt ermittelt wurde. Sind leere Brunnen (ohne Zellen) und Brunnen mit Fahrzeug-Kontrollen (ez., DMSO) zu einer Wachstumshemmung durch das Medikament Verdünnung Fahrzeug entfallen.<ol>
<li>Bereiten Sie mindestens vier Fahrzeug-Kontroll-Vertiefungen pro Platte, im Idealfall verstreut über die Platte gut Positionseffekte berücksichtigen. Wenn Assays variabel sind, dann gehören Sie mindestens eine Fahrzeugkontrolle auch pro Zeile/Spalte und verwenden Sie jede Zeile/Spalte Kontrolle sowie die Steuerung, um Z-Scores für jede Zeile/Spalte anstatt für eine ganze Platte (Schritt 4.2.5) zu berechnen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fügen Sie 2 µL der Kultur in jede Vertiefung als vor. (Eine Platte für Wildtyp-Bakterien und eine Platte für die vorhergesagten Synergie mutierten Bakterien).</li>
		<li>Beurteilen Sie die OD600 bei 0 und 18 h für E. Coli oder 48 h für C. Neoformans.</li>
		<li>Berechnen Sie Tabellenkalkulations-Software verwenden, die Netto-Wachstum durch Subtraktion der OD-600 von leeren Brunnen aus der Fahrzeug-Kontroll-Vertiefungen. Brunnen mit einem Z-Score von-2,5 identifizieren (Z-Score = Mittelwert - 2,5 * Standardabweichung). Diese Vertiefungen enthalten ein potenzieller Synergist kleines Molekül.</li>
		<li>Validieren Sie Bildschirm-Hits mit den Methoden in Schritt 3 beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Synergistische niedermolekularer Paare können ein mächtiges Werkzeug in der Behandlung von mikrobiellen Infektionen, doch sie haben nicht ihre volle klinische Potenzial erreicht, weil synergistische Paare schwierig zu identifizieren sind. Dieses Dokument beschreibt eine Methode zur Identifizierung von synergistischen Paare viel schneller als einfache paarweisen Kombinationen. Durch die Verwendung chemischer Genetik Datasets, identifiziert O2M Mutanten mit Gen-Knockouts, die dann als einer Anzeige auf Bildschirm große ...

Antibiotika-resistente Bakterien dazu führen, dass mehr als 2 Millionen Infektionen und 23.000 Todesfälle jährlich in den Vereinigten Staaten nach der CDC-1. Neue Behandlungen sind erforderlich, um diese Infektionen zu überwinden. Strategien zu identifizieren, diese neuen Behandlungen umfassen die Entwicklung neuer antimikrobielle Medikamente oder die Wiederverwendung von kleinen Molekülen, die für andere Bedingungen zur Behandlung von mikrobiellen Infektionen2,3,4zugelassen. Neue Drogeentdeckung ist jedoch sehr kostspielig und zeitaufwendig. Wiederverwendung von Drogen kann nicht identifizieren neuartiger Medikamente oder Drogen richtet sich an5,6. Unser Labor konzentriert sich auf eine dritte Strategie als synergistische Kombinationstherapien bekannt. Synergistische Kombinationen auftreten, wenn zwei kleine Moleküle zusammen eine Wirksamkeit größer als die additive Wirkung von ihrer individuellen Wirksamkeiten7haben. Darüber hinaus können synergistische Kombinationen gegen einen Erreger resistent gegen eines der kleinen Moleküle des Paares neben mit weniger unerwünschten Wirkungen Ziel, wodurch sie große potenzielle8,9wirksam, 10.
Synergistische Paare sind selten, auftreten bei etwa 4-10 % der Droge Kombinationen11,12,13. So sind traditionelle Techniken wie paarweisen Bildschirmen schwieriger und zeitaufwendiger, mit Tausenden von möglichen Kombinationen aus einer kleinen Bibliothek von hundert Moleküle. Synergistische Wechselwirkungen können darüber hinaus in der Regel von der Aktivität der Verbindungen14vorhergesagt werden. Jedoch entwickelten die Autoren einen Hochdurchsatz-Ansatz für Bildschirm für synergistische Paare, genannt die Überlappung2 Methode (O2M)12. Diese hier beschriebene Methode ermöglicht schnellere, effizientere Identifikation dieser synergistischen Paare. O2M erfordert den Einsatz eines bekannten synergistische Paares und ein Chemie-Genetik-Dataset. Chemie-Genetik-Datasets werden generiert, wenn eine Bibliothek von Knockout-Mutanten in Anwesenheit von vielen verschiedenen kleinen Molekülen angebaut wird. Wenn ein Molekül in einem bekannten synergistische paar den gleichen Phänotyp aus einer bestimmten ko-Mutante als das zweite synergistische Molekül induziert, sollten alle anderen kleines Molekül, das den Phänotyp aus diesem gleichen Mutant entlockt auch mit jedem Mitglied der bekannten synergize. synergistische Paar. Diese Begründung wurde in der braunen Lab verwendet, um synergistische Antibiotika wirksam gegen Escherichia coli (E. Coli) und synergistische pilzbefallverhütende Droge Paare aktiv gegen die pathogenen Pilzes Cryptococcus Neoformans (C. identifizieren Neoformans)11,12. O2M ist nicht nur anpassungsfähig für verschiedene Krankheitserreger, sondern ermöglicht für das Screening der großen Bibliotheken der Moleküle, synergistische Paare einfach und schnell zu identifizieren. Screening mit der genetischen Mutant bezeichneten O2M ermöglicht es uns, nur diesen kleinen Molekülen vorhergesagt für Synergie zu validieren. So würde eine 2.000-Molekül-Bibliothek paarweise testen Monate dauern, während gäbe es nur 20 Moleküle in dieser Bibliothek synergize voraussichtlich, Test für Synergie jetzt eine Frage von Tagen dauert. O2M erfordert keine Programmierkenntnisse und das benötigte Equipment gibt es in den meisten Labors oder zentrale Einrichtungen. Neben der Forscher Wirkstoffkombinationen interessieren ist O2M Analyse für jeden von Interesse, die hat einen Drogentest absolviert und will ihre Hits zu erweitern, indem Sie wichtige Wechselwirkungen zu identifizieren. Unten ist das Protokoll für synergistische kleine Moleküle in Bakterien zu identifizieren, sowie die Validierung der vorhergesagten synergistischen Interaktionen in bekannten Assays15,16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="520">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:179px;">Bioscreen C</td>
			<td style="width:88px;">instrument</td>
			<td style="width:136px;">Growth Curves USA</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy H1</td>
			<td>instrument</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9 broth</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J863-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Casamino Acids</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1424-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-10KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinic Acid</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12683</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiamine</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>148991000</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2 Dihydrate</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4 Heptahydrate</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chemical-genetics dataset</td>
			<td>dataset</td>
			<td>examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trimethoprim (example input drug; any can be used)</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19552701</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sulfamethoxazole (example test drug; any can be used)</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN15671125</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput identification of synergistic drug combinations by the overlap2 method

Obwohl antimikrobielle Medikamente erheblich die Lebensdauer und die Qualität des Lebens im20. Jahrhundert zugenommen haben, droht Antibiotikaresistenz unsere gesamte Gesellschaft Fähigkeit, systemische Infektionen zu behandeln. In den Vereinigten Staaten allein töten Antibiotika-resistente Infektionen etwa 23.000 Menschen pro Jahr und rund 20 Milliarden US-Dollar im Gesundheitswesen zusätzliche Kosten. Ein Ansatz zur Bekämpfung der Antibiotikaresistenz ist die Kombinationstherapie, die in der kritischen frühen Phase der Infektion, besonders nützlich ist, bevor der infizierenden Organismus und seine Droge-Widerstand-Profil identifiziert wurden. Viele antimikrobielle Behandlungen verwenden Kombinationstherapien. Jedoch die meisten dieser Kombinationen sind additiv, d. h., dass die kombinierte Wirkung die gleiche wie die Summe der einzelnen antibiotische Wirksamkeit ist. Einige Kombinationstherapien sind synergistische: die kombinierte Wirkung ist viel größer als Additiv. Synergistische Kombinationen sind besonders nützlich, weil sie das Wachstum von Antibiotika resistente Stämme hemmen können. Diese Kombinationen sind jedoch selten und schwer zu identifizieren. Dies ist aufgrund der schieren Anzahl der Moleküle, die in gewissem Sinne paarweise getestet werden: eine Bibliothek mit 1.000 Moleküle hat 1 Million Kombinationsmöglichkeiten. So wurden Anstrengungen unternommen, Moleküle für Synergie vorherzusagen. Dieser Artikel beschreibt unsere Hochdurchsatz-Methode für die Vorhersage synergistische niedermolekularer Paare als Überlappung2 Methode (O2M) bekannt. O2M verwendet Muster aus chemisch-genetische Datasets Mutanten zu identifizieren, die überempfindlich auf jedes Molekül in einem synergistischen paar aber nicht auf andere Moleküle. Die braunen Lab nutzt dieses Wachstum Unterschied durch Ausführen eines Hochdurchsatz-Bildschirms für Moleküle, die das Wachstum von Mutant aber nicht Wildtyp-Zellen hemmen. Das Labor Arbeit zuvor identifizierten Moleküle, die mit dem Antibiotikum Trimethoprim und der antimykotische Wirkstoff Fluconazol mit dieser Strategie synergize. Hier präsentieren die Autoren eine Methode, um Bildschirm für neuartige synergistische Kombinationen, die für mehrere Mikroorganismen verändert werden kann.

Schachbrett-Assays sind eine semi-quantitative Methode zur Messung von synergistischer Interaktionen. Das Endergebnis ausgegeben, FICI, bestimmt wenn eine Arzneimittelkombination synergistische (FICI ≤0.5) gilt, nicht-wechselwirkenden (0,5 < FICI < 4), oder antagonistischen (FICI ≥4.0). Abbildung 1 veranschaulicht, wie die Droge Gradienten in einem Schachbrettmuster-Assay einrichten. Abbildung 2 veranschaulicht gemeinsame Erg...

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High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistische Wirkstoffkombinationen sind schwierig und zeitaufwändig, empirisch zu identifizieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung und Validierung von synergistischen kleine Moleküle.

Hochdurchsatz-Identifizierung von synergistischen Wirkstoffkombinationen durch die Überlappung2 Methode

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

high-throughput-identification-synergistic-drug-combinations-overlap2

Research

JoVE Journal

Genetics

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

11.6K Aufrufe.  University of Utah. Synergistische Wirkstoffkombinationen sind schwierig und zeitaufwändig, empirisch zu identifizieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung und Validierung von synergistischen kleine Moleküle.

Serie: High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Forschung

Genetik

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

Hochdurchsatz-robotically Assisted Isolation von temperaturempfindlichen Lethal Mutants in<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Erzeugung von nativen Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Bibliotheken für Nukleosom Dichteanalyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have been directed toward elucidation of the location and timing of initiation of genome duplication rather than its completion. However, it is critical that we understand regions of the genome that are last to complete replication, because these regions suffer elevated levels of chromosomal breakage and mutation, and they have been associated with both disease and aging. Here we describe how we have extended a technique that has been used to monitor replication initiation to instead identify those regions of the genome last to complete replication. This approach is based on a combination of flow cytometry and high throughput sequencing. Although this report focuses on the application of this technique to yeast, the approach can be used with any cells that can be sorted in a flow cytometer according to DNA content.

We describe a technique for combining flow cytometry and high throughput sequencing to identify late replicating regions of the genome.

G2-Seq: Ein hoher Durchsatz Sequenzierung-basierten Methode zur Identifizierung von spät repliziert Regionen des Genoms

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus allowing a single investigator to screen more treatments or conditions over the same amount of time without loss of data quality. The method requires common equipment found in most laboratories working with C. elegans and is thus simple to adopt. The approach centers on assaying independent samples of a population at each observation point, rather than a single sample over time as with traditional longitudinal methods. Scoring entails adding liquid to the wells of a multi-well plate, which stimulates C. elegans to move and facilitates quantifying changes in healthspan. Other major benefits of the Replica Set method include reduced exposure of agar surfaces to airborne contaminants (e.g. mold or fungus), minimal handling of animals, and robustness to sporadic mis-scoring (such as calling an animal as dead when it is still alive). To appropriately analyze and visualize the data from a Replica Set style experiment, a custom software tool was also developed. Current capabilities of the software include plotting of survival curves for both Replica Set and traditional (Kaplan-Meier) experiments, as well as statistical analysis for Replica Set. The protocols provided here describe the traditional experimental approach and the Replica Set method, as well as an overview of the corresponding data analysis.

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Here we describe the Replica Set method, an approach to quantitatively measure C. elegans lifespan/survival and healthspan in a high-throughput and robust manner, thus allowing screening of many conditions without sacrificing data quality. This protocol details the strategy and provides a software tool for analysis of Replica Set data.

Die Replica-Set-Methode: Eine Hochdurchsatz-Ansatz zu quantitativ Messen Caenorhabditis Elegans Lebensdauer

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT employs two purification steps. First, immunoprecipitation of a tagged RNP subunit is followed by mild RNase digestion and subsequent non-denaturing affinity elution. A second immunoprecipitation of another RNP subunit allows for enrichment of a defined complex. Following a denaturing elution of RNAs and proteins, the RNA footprints are converted into high-throughput DNA sequencing libraries. Unlike the more popular ultraviolet (UV) crosslinking followed by immunoprecipitation (CLIP) approach to enrich RBP binding sites, RIPiT is UV-crosslinking independent. Hence RIPiT can be applied to numerous proteins present in the RNA interactome and beyond that are essential to RNA regulation but do not directly contact the RNA or UV-crosslink poorly to RNA. The two purification steps in RIPiT provide an additional advantage of identifying binding sites where a protein of interest acts in partnership with another cofactor. The double purification strategy also serves to enhance signal by limiting background. Here, we provide a step-wise procedure to perform RIPiT and to generate high-throughput sequencing libraries from isolated RNA footprints. We also outline RIPiT&#39;s advantages and applications and discuss some of its limitations.

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Here, we present a protocol to enrich endogenous RNA binding sites or &#34;footprints&#34;&#160;of RNA:protein (RNP) complexes from mammalian cells. This approach involves two immunoprecipitations of RNP subunits and is therefore dubbed RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT).

Identifizierung von Fußabdrücken von RNA:Protein-Komplexe über RNA-Immunpräzipitation im Tandem gefolgt von Sequenzierung (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...