1. Vorbereitungsschritte
<ol><li>Muller-Hinton-Brühe (MHB) zubereiten, indem Sie 25 g MH-Brühe zu 1 L destilliertem Wasser geben und mischen. Autoklav bei 121 °C für 2,5 h. Anschließend lagern Sie die autoklavierten Medien bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank.</li>
	<li>Subkulturieren Sie die betreffenden Bakterien (E. coli ESBL) auf dem Agarmedium mit der Vier-Quadranten-Streifenmethode und inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C.<ol>
<li>Nehmen Sie mit einer sterilen Schlaufe eine Kolonie und verteilen Sie sie in der ersten Hälfte der MacConkey-Agarplatte, indem Sie enge parallele Streifen machen.</li>
		<li>Verteilen Sie mit der Schleife die Bakterien im zweiten Quadranten, indem Sie sie aus dem ersten Quadranten streifen.</li>
		<li>Verlängern Sie vom zweiten Quadranten aus die Streifen im dritten Quadranten mit engen parallelen Streifen.</li>
		<li>Verbreiten Sie die Bakterien in der Mitte des vierten Quadranten, indem Sie sie aus dem dritten Quadranten streifen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung des Panels
<ol><li>Platzieren Sie vier 96-Well-Platten nebeneinander, um ein Quadrat zu bilden. Kleben Sie ihren Boden mit einem Band zusammen.</li>
	<li>Wiederholen Sie diesen Schritt, um vier Panels mit jeweils 4 Platten zu erhalten und sie A1, A2, A3 und A4 zu nennen.</li>
	<li>50 μL MH-Brühe in die Vertiefungen zwischen Spalte 2 und Spalte 11 in den 16 96-Well-Platten der vier Paneele geben.</li>
	<li>Fügen Sie 200 μL MH-Brühe in die Vertiefung H12 ein, die als Negativkontrollbohrung in den 16 96-Well-Platten der vier Panels dient.</li>
	<li>Fügen Sie 150 μL MH-Brühe zu den Vertiefungen A1 und H1 hinzu, die als Positivkontrollbrunnen in den 16 96-Well-Platten der vier Panels dienen.</li>
</ol>3. Medikament 1, Cefotaxim, serielle Verdünnung
<ol><li>In ein konisches Röhrchen werden 15 ml sterilesdH2O gegeben.<ol>
<li>Berechnen Sie das Volumen, das aus der Stammlösung des Arzneimittels nach der FormelC1V1 =C2 V2entfernt werdensoll. Somit istV1 = (C2 x 15 mL) / C1. HINWEIS: In unserem Fall beträgt die Cefotaxim-Stammlösung 105 μg / ml und C2 256 μg / ml; somitV1 = 38,4 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie das berechnete Volumen aus den 15 ml sterilem dH2O und fügen Sie dann das Medikament hinzu.</li>
	<li>50 μL der hergestellten Wirkstofflösung werden in jede Vertiefung in Spalte 11 und Spalte 12 außer H12 pipetten.</li>
	<li>Beginnen Sie die serielle Verdünnung, indem Sie 50 μL aus Spalte 11 entfernen und in die entsprechenden Vertiefungen in Spalte 10 und dann von 10 bis zum Erreichen von Spalte 2 geben, wo die 50 μL aus Spalte 2 verworfen werden.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.5 für alle 16 96-Well-Platten der vier Panels.</li>
</ol>4. Medikament 2, Amkacin, serielle Verdünnung
<ol><li>In ein konisches Röhrchen werden 10 ml sterilesdH2O gegeben.</li>
	<li>Berechnen Sie das Volumen, das aus der Stammlösung des Arzneimittels nach der FormelC1V1 =C2 V2entfernt werdensoll. Somit istV1 = (C2 x 10 mL) / C1. HINWEIS: In unserem Fall beträgt die Amikacin-Stammlösung 103 μg/ml undC2 64 μg/ml; somitV1 = 64 μL.</li>
	<li>Entfernen Sie das berechnete Volumen aus den 10 ml sterilem dH2O und fügen Sie dann das Medikament hinzu.</li>
	<li>Nehmen Sie acht separate 96-Well-Platten.</li>
	<li>Zu jeder Platte werden 100 μL MHB zu den Vertiefungen zwischen den Reihen G und B hinzugefügt.</li>
	<li>100 μL der zuvor hergestellten Wirkstoff-2-Lösung in die Vertiefungen der Reihe G geben.</li>
	<li>Verdünnen Sie seriell von Zeile G nach Reihe B, indem Sie 100 μL aus jeder Vertiefung nehmen und schließlich die 100 μL aus den Vertiefungen von Reihe B verwerfen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.5, 4.6 und 4.7, um acht Platten vorzubereiten.</li>
</ol>5. Übertragung von Medikament 2 auf die vier Panels
<ol><li>Pipetten Sie 50 μL des Arzneimittels 2 aus den Vertiefungen zwischen den Reihen G und B in die entsprechenden Vertiefungen in jeder Platte in den vier Paneelen. Eine vorbereitete 96-Well-Platte enthält 100 μL Medikament 2, was für zwei Platten in einem Panel ausreicht.</li>
</ol>6. Arzneimittel 3, Levofloxacin, Zusatz
<ol><li>Zu vier verschiedenen konischen Röhrchen werden 14 ml sterilesdH2Ohinzugefügt.</li>
	<li>Berechnen Sie das Volumen, das aus der Stammlösung des Arzneimittels nach der FormelC1V1 =C2 V2entfernt werdensoll. Somit istV1 = (C2 x 14 mL) / C1. HINWEIS: In unserem Fall wird Levofloxacin in vier verschiedenen Konzentrationen aus einer Stammlösung von 5 x 103 μg/ml hergestellt. C1 = 2 μg/ml, V1 = 5,6 μL C2 = 4 μg/ml,V1 = 11,2 μL C3 = 8 μg/ml, V1 = 22,4 μL C4 = 16 μg/ml, V1 = 44,8 μL</li>
	<li>Entfernen Sie das berechnete Volumen aus den 14 ml sterilem dH2O aus jedem Röhrchen und fügen Sie dann das Medikament hinzu.</li>
	<li>Nach der Herstellung der erforderlichen Konzentrationen des dritten Arzneimittels nehmen Sie 50 μL und fügen Sie es den entsprechenden Vertiefungen zwischen den Reihen B und G und den Spalten 2 und 12 in der entsprechenden Platte in jeder Platte hinzu, wobei C1 den vier P1-Platten in den vier Platten entspricht, C2 entspricht den vier P2-Platten in den vier Platten C3 entspricht den vier P3-Platten in den vier Panels und C4 entspricht den vier P4-Platten in den vier Panels.</li>
</ol>7. Arzneimittel 4, Trimethoprim-Sulfamethoxazol, Zusatz
<ol><li>In ein konisches Röhrchen werden 14 ml sterilesdH2O gegeben.</li>
	<li>Berechnen Sie das Volumen, das aus der Stammlösung des Arzneimittels nach der FormelC1V1 =C2 V2entfernt werdensoll. Somit istV1 = (C2 x 14 mL) / C1. HINWEIS: In unserem Fall wird Trimethoprim-Sulfamethoxazol in vier verschiedenen Konzentrationen aus einer Stammlösung von 48 x 103 μg/ml hergestellt. C1 = 512 μg/ml, V1 = 149,33 μL C2 = 1024 μg/ml, V1 = 298,66 μL C3 = 2048 μg/ml, V1 = 597,33 μL C4 = 4096 μg/ml, V1 = 1 194,66 μL</li>
	<li>Entfernen Sie das berechnete Volumen aus den 14 ml sterilem dH2O jedes Röhrchens und fügen Sie dann das Medikament hinzu.</li>
	<li>Nach der Vorbereitung der erforderlichen Konzentrationen des vierten Arzneimittels nehmen Sie 50 μL und fügen Sie es den entsprechenden Vertiefungen zwischen den Reihen B und G und den Spalten 2 und 12 in den vier Platten des entsprechenden Panels hinzu, wobei C1 Panel 1, C2 Panel 2, C3 Panel 3 und C4 Panel 4 entspricht.</li>
</ol>8. Herstellung und Zugabe von bakteriellem Inoculum E. coli ESBL
<ol><li>Übertragen Sie mit einer sterilen Schleife eine Kolonie des Bakterienisolats E. coli ESBL, das zuvor auf einer Platte kultiviert wurde, in 2 ml steriles MHB und Wirbel.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Trübung, wo sie 0,5 McFarland mit einem Densitometer betragen sollte.</li>
	<li>Fügen Sie 80 ml sterile MH-Brühe in einen sterilen Urinbecher hinzu.</li>
	<li>Bakterielles Inokum aus dem 0,5 McFarland Inokum in den Urinbecher nachC1V1 =C2V2hinzufügen, wobeiV1 = (106 x 80 ml) / 108 = 800 μL.</li>
	<li>Pipette 50 μL der Inokkulumlösung 106 KBE/ml in jede Vertiefung außer H12, die die Sterilitätskontrollbohrung ist.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C über Nacht.</li>
	<li>Nach der Inkubation 50 μL Iodotetrazolium hinzufügen, um das Wachstum in den Vertiefungen aufzuzeichnen.</li>
</ol>9. Protokoll für die FIC-Vorlage (Supplemental File)
<ol><li>Schreiben Sie die höchste Konzentration von Medikament 1 (Cefotaxim) in die gelbe Zelle in Panel A.</li>
	<li>Schreiben Sie die höchste Konzentration von Medikament 2 (Amikacin) in die gelbe Zelle in Panel B.</li>
	<li>Schreiben Sie die höchste Konzentration von Medikament 3 (Levofloxacin) in die gelbe Zelle in Panel C.</li>
	<li>Schreiben Sie die höchste Konzentration von Medikament 4 (Trimethoprim-Sulfamethoxazol) in Panel D.</li>
	<li>Verfolgen Sie die rote Linie (Growth/no Growth interface), indem Sie die Bohrbrunnen mit Wachstum rot hervorheben.</li>
	<li>Schreiben Sie das MIC von Medikament 1 in die Tabelle von Medikament 1 (ATB1).</li>
	<li>Schreiben Sie das MIC von Medikament 2 in die Tabelle von Medikament 2 (ATB2).</li>
	<li>Schreiben Sie das MIC von Medikament 3 in die Tabelle von Medikament 3 (ATB3).</li>
	<li>Schreiben Sie das MIC von Medikament 4 in die Tabelle von Medikament 4 (ATB4).</li>
	<li>So berechnen Sie FIC für ATB1<ol>
<li>Bestimmen Sie die Vertiefungen auf der Schnittstelle Wachstum/kein Wachstum.</li>
		<li>Doppelklicken Sie in Tabelle ATB1 auf die Zelle neben FIC1 und ziehen Sie die gelbe Zelle links neben Bedienfeld A an die erste ausgewählte Vertiefung.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 9.10.2 für jede ausgewählte Vertiefung, bei der Vertiefung 1 FIC1, Vertiefung 2 FIC2 usw. entspricht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>So berechnen Sie den FIC für ATB2<ol>
<li>Doppelklicken Sie in tabelle ATB2 auf die Zelle neben FIC1 und ziehen Sie die gelbe Zelle links neben Feld B zur ersten vorausgewählten Vertiefung.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 9.11.1 für jede vorausgewählte Vertiefung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>So berechnen Sie den FIC für ATB3<ol>
<li>Doppelklicken Sie in Tabelle ATB3 auf die Zelle neben FIC1 und ziehen Sie die gelbe Zelle links neben Bedienfeld C zur ersten vorausgewählten Vertiefung.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 9.12.1 für jede vorausgewählte Vertiefung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>So berechnen Sie den FIC für ATB4<ol>
<li>Doppelklicken Sie in Tabelle ATB4 auf die Zelle neben FIC1 und ziehen Sie die gelbe Zelle links neben Feld D zur ersten vorausgewählten Vertiefung.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 9.13.1 für jede vorausgewählte Vertiefung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Summieren Sie in der Tabelle atB1+2+3+4 automatisch den FIC1 jedes ATB. Dasselbe gilt für die anderen FICs (FIC2, FIC3 usw.).<ol>
<li>Doppelklicken Sie in der Zelle, die FIC enthält und gelb hervorgehoben ist, darauf und wählen Sie die summierten ΣFICs aus der Tabelle ATB1+2+3+4 aus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wiederholen Sie diese Schritte für jedes der neun Blätter, die die neun Blätter darstellen. HINWEIS: Im Blatt FIC all zeigt die Tabelle den endgültigen summierten FIC mit der Interpretation des erhaltenen Wertes.</li>
</ol>10. MIC-Bestimmung mit dem Mikrodilutionsassay für die vier Medikamente
<ol><li>Kennzeichnen Sie vier verschiedene Zeilen mit der Abkürzung jedes getesteten Medikaments. Zum Beispiel CTX für Cefotaxim, AMK für Amikacin, LEVO für Levofloxacin und SXT für Trimethoprim-Sulfamethoxazol.</li>
	<li>200 μL sterile Muller Hinton Brühe in Vertiefung Nummer 1 und Vertiefung Nummer 12 in jeder verwendeten Reihe pipetten. Bohrfach Nummer 12 wird als Negativkontrollbrunnen dienen.</li>
	<li>100 μL sterile Muller Hinton Brühe in die Vertiefungen 2 bis 11 in jeder verwendeten Reihe pipetten.</li>
	<li>Berechnen Sie das Volumen jedes zuzugesetzten Arzneimittels mit der FormelC1V1 =C2V2. Somit ist V1 = (C2 x 4 x V2) / C1. V2 ist das Endvolumen in den Bohrungen, das 200 μL beträgt, C1 ist die Konzentration der Stammlösung undC2 ist die Anfangskonzentration, die wir in der ersten Bohrung haben müssen. HINWEIS: Hier verwenden wir Folgendes: Cefotaxim:C1 = 105 μg/ml, wobei wir es auf 104 μg/ml verdünnen,C2 = 256 μg/ml; somitV1 = 20,48 μL Amikacin: C1 = 103 μg/ml,C2 = 64 μg/ml; somitV1 = 51,2 μL Levofloxacin: C1 = 5 x 103 μg/ml, wobei wir es auf 5 x 102 μg/ml verdünnen,C2 = 16 μg/ml; somitV1 = 25,6 μL Trimethoprim-Sulfamethoxazol:C1 = 48 x 103 μg/ml,C2 = 4096 μg/ml; somitV1 = 68,26 μL</li>
	<li>Pipetten Sie das erforderliche Volumen für jedes Medikament in der ersten Vertiefung der entsprechenden Reihe, nachdem Sie das gleiche Volumen aus der 200 μL-Brühe entfernt haben, um nach der Zugabe des Arzneimittels ein Gesamtvolumen von 200 μL zu erhalten.</li>
	<li>Seriell verdünnen, indem 100 μL aus Bohrung 1 in Vertiefung 2 und so weiter entfernt werden, bis Bohrung 10 erreicht wird, wo die aus Vertiefung 10 entfernten 100 μL verworfen werden. Beachten Sie, dass Gut 11 als Positivkontrollbrunnen dient.</li>
	<li>Pipette 100 μL von 106 vorbereiteten bakteriellen Inokum in jede Vertiefung in jeder verwendeten Reihe mit Ausnahme von Bohrstätte Nummer 12, die als Negativkontrolle dient.</li>
	<li>Über Nacht bei 37 °C inkubieren.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ibezim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+resistance+to+antibiotics.">Microbial resistance to antibiotics.</a> African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).</li><li>Ventola, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibiotic+resistance+crisis:+part+1:+causes+and+threats.">The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats.</a> P &amp; T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).</li><li>Alanis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antibiotics:+Are+we+in+the+post-antibiotic+era.">Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era.</a> Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+at+the+crossroads.">Antibiotics at the crossroads.</a> Nature. 431 (7011), 899-902 (2004).</li><li>Bollenbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+interactions:+mechanisms+and+implications+for+drug+discovery+and+resistance+evolution.">Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).</li><li>Mehta, K. C., Dargad, R. R., Borade, D. M., Swami, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+antibiotic+resistance+in+common+infectious+diseases:+role+of+antibiotic+combination+therapy.">Burden of antibiotic resistance in common infectious diseases: role of antibiotic combination therapy.</a> Journal of Clinical and Diagnostic Research: JCDR. 8 (6), (2014).</li><li>Chanda, S., Rakholiya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy:+Synergism+between+natural+plant+extracts+and+antibiotics+against+infectious+diseases.">Combination therapy: Synergism between natural plant extracts and antibiotics against infectious diseases.</a> Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. , (2011).</li><li>Cottarel, G., Wierzbowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+drugs,+an+emerging+option+for+antibacterial+therapy.">Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy.</a> Trends in Biotechnology. 25 (12), 547-555 (2007).</li><li>Kristiansen, J., Amaral, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+management+of+resistant+infection+with+non-antibiotics.">The potential management of resistant infection with non-antibiotics.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 40, 319-327 (1997).</li><li>Tamma, P. D., Cosgrove, S. E., Maragakis, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+for+treatment+of+infections+with+gram-negative+bacteria.">Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria.</a> Clinical Microbiology Reviews. 25 (3), 450-470 (2012).</li><li>Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+principles+of+antimicrobial+therapy.">General principles of antimicrobial therapy.</a> Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).</li><li>Eliopoulos, G. M., Eliopoulos, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+combinations:+Should+they+be+tested.">Antibiotic combinations: Should they be tested.</a> Clinical Microbiology Reviews. 1 (2), 139-156 (1988).</li><li>Doern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+does+2+plus+2+equal+5?+A+review+of+antimicrobial+synergy+testing.">When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).</li><li>Stein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+dimensional+checkerboard+synergy+analysis+of+colistin,+meropenem,+tigecycline+against+multidrug-resistant+clinical+klebsiella+pneumonia+isolates.">Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates.</a> PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).</li><li>Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+essential+oil+components+and+antibiotics:+a+review.">Synergy between essential oil components and antibiotics: a review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).</li><li>Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-kill+assay+and+Etest+evaluation+for+synergy+with+polymyxin+B+and+fluconazole+against+Candida+glabrata.">Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).</li><li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy,+antagonism,+and+what+the+chequerboard+puts+between+them.">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).</li></ol>

Die Quadruple Checkerboard-Methode ähnelt in ihrem Protokoll dem Schachbrett und dem dreidimensionalen Schachbrett. Es sollten jedoch bestimmte entscheidende Schritte berücksichtigt werden, um Fehler während des Experiments zu vermeiden.
Stellen Sie sicher, dass Sie das MIC jedes Arzneimittels gegen das getestete Isolat testen, bevor Sie das Protokoll starten, um zu wissen, welche Konzentrationen erforderlich sind, um die Verdünnungen für Medikament 1 und Medikament 2 zu starten, die in d...

Mit der Zunahme der Resistenz aufgrund des übermäßigen Einsatzes und Missbrauchs von Antibiotika1,2ist die Notwendigkeit, neue Medikamente und Mittel zur Behandlung bakterieller Infektionen zu entwickeln, entscheidend geworden. Neue Ansätze wie die Entwicklung neuer Medikamente sind sehr wichtig, um die Resistenzkrise zu überwinden. Die pharmaindustrie ist jedoch nicht daran interessiert, neue antimikrobielle Wirkstoffe zu entwickeln. Darüber hinaus werden sich Bakterien, wenn neue Medikamente entwickelt werden, weiterentwickeln und Resistenzen gegen diese neuen Medikamente entwickeln3,4. Somit wird das Problem der Resistenz nicht gelöst, was die Notwendigkeit eines anderen Ansatzes zu einem Muss macht, das in Betracht gezogen und untersucht werden sollte, um bakterielle Resistenzen zu überwinden.
Die Arzneimittelkombination ist ein sehr wichtiges Konzept zur Behandlung bakterieller Infektionen, hauptsächlich solche, die durch multiresistente Erreger verursacht werden5,6. Es verringert den Verlauf der Behandlung, verringert die verabreichte Dosis; So hilft die Verringerung der Toxizität des gegebenen Arzneimittels, die Rate der Resistenzentwicklung zu verringern und sensibilisiert in gewisser Weise die Bakterien für die gegebenen Arzneimittel, wie im Konzept der Kollateralempfindlichkeit5,7,8,9beschrieben .
Die Entwicklung von Resistenzen gegen ein Medikament erfordert eine einzige Mutation; Die Entwicklung von Resistenzen gegen eine Kombination von Medikamenten, die auf mehrere Signalwege abzielen, erfordert jedoch mehrere unabhängige Mutationen, die durch diese Kombination verlangsamt werden. Ein Beispiel für eine verminderte Resistenz während der Kombinationstherapie ist die verminderte Resistenzrate gegen Rifampin bei Mycobacterium Tuberculosis10. Ein weiteres Beispiel ist eine Studie von Gribble et al., die zeigte, dass die Rate des Auftretens resistenter Stämme bei Patienten, die Piperacillin allein einnehmen, höher ist als bei Patienten, die eine Kombination aus Carboxypenicillin und Aminoglycosid10einnehmen. Studien haben gezeigt, dass die Entwicklung von Resistenzen gegen Aminoglykoside in sich entwickelnden Bakterien diese Stämme empfindlich gegenüber verschiedenen anderen Medikamenten machte5. Die Kombination zwischen dem Beta-Lactam-Klasse-Medikament Amoxicillin und dem Lactamase-Inhibitor Clavulansäure zeigte Erfolge bei der Behandlung resistenter Bakterienstämme8.
Die Verkürzung der Behandlungszeit ist ein guter Vorteil, der sich aus Arzneimittelkombinationen ergibt. Zum Beispiel wird eine Therapie von kombiniertem Penicillin oder Ceftriaxon mit Gentamicin für 2 Wochen die gleiche Wirksamkeit von Penicillin oder Ceftriaxon allein geben, wenn es für 4 Wochen11gegeben wird. Die Kombination von Medikamenten ermöglicht die Verwendung niedrigerer Dosierungen von Medikamenten, die nicht wirksam sind, wenn sie allein verabreicht werden, wie die Sub-MICs. Das Beispiel von Sulfonamiden kann gegeben werden, wenn die Verwendung von Tripelsulfonamiden bei niedrigeren Dosen die Toxizität minimiert, die bei der Verwendung unlöslicher Sulfonamide in vollen Dosen entsteht12.
So wird die Verringerung der verabreichten Dosierung und der Behandlungszeit schließlich die Toxizität der Medikamente auf dem Körper verringern. Die Idee, Methoden zu entwickeln, um die Wechselwirkung zwischen kombinierten Medikamenten zu bewerten, ist sehr wichtig. In einer Studie zeigten die Ergebnisse, dass die Kombinationstherapie bei der Behandlung resistenter Arten von Acinetobacter und P. aeruginosa wirksamerist8.
Medikamente in Kombination verern Es gibt verschiedene Methoden, mit denen wir Arzneimittelkombinationen untersuchen können, wie die Schachbrettmethode, die Time-Kill-Kurvenmethode und die E-Testmethode13. Die Schachbrettmethode kann alle möglichen Kombinationen zwischen den beiden fraglichen Medikamenten in einem Experiment selbst untersuchen. Darüber hinaus wurde es entwickelt, um eine Kombination von drei Medikamenten14zu untersuchen. Nun erweitern wir dies, um eine Kombination von vier Medikamenten hauptsächlich zur Behandlung von multiresistenten Krankheitserregern zu untersuchen.
Der Time-Kill-Curve-Assay wird normalerweise durchgeführt, um die bakterizide Wirkung eines bestimmten Arzneimittels zu testen. Es wurde auch verwendet, um die Wirkung von Arzneimittelkombinationen zu testen, bei denen mehrere Medikamente in bestimmten Konzentrationen kombiniert werden. Dieses Protokoll erfordert die Herstellung mehrerer steriler Röhrchen oder Becher, in denen wir in jede Tasse die Brühe, die Kombination von Medikamenten und den erforderlichen Bakterienstamm hinzufügen. Nach Inkubation und Aufzeichnung der optischen Dichte zu mehreren Zeitpunkten werden die Ergebnisse mit der normalen Wachstumsrate der verwendeten Sorte verglichen, um zu sehen, ob die Wachstumsrate zugenommen, abgenommen oder sich nicht verändert hat13.
Die E-Test-Methode wird normalerweise durchgeführt, um auf die minimale hemmende Konzentration (MIC) zu testen, bei der ein Streifen, der eine Gradientenkonzentration des betreffenden Arzneimittels enthält, auf eine geimpfte Platte gelegt wird. Es wurde auch verwendet, um die Kombination zwischen zwei Medikamenten zu testen, bei denen zwei Streifen senkrecht zur Platte hinzugefügt werden, die sich an ihren MICs13schneiden.
Laut Literatur gibt es keinen Goldstandard, um Synergien zu definieren und zu untersuchen; Daher ist es schwierig zu beurteilen, welche der Methoden, die zur Untersuchung der Kombination verwendet werden, besser ist und welche bessere und zuverlässigere Ergebnisse liefert, hauptsächlich13. Der Time-Kill-Assay ist jedoch arbeitsintensiv, zeitaufwendig und teuer15,16, während die E-Test-Methode entwickelt wurde, um nur eine Kombination zwischen zwei Medikamenten zu untersuchen. Checkerboard kann alle möglichen Kombinationen zwischen den beiden getesteten Medikamenten untersuchen und deshalb wurde diese Technik ausgewählt, um entwickelt zu werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330000402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330-0013-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>For drug 3 and 4 preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polysterene round-bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td>For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90mm petri dishes</td>
			<td>JRZ Plastilab</td>
			<td></td>
			<td>As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>For serial diltuion and combining drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole</td>
			<td>By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France</td>
			<td>10177403</td>
			<td>Drug 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceforane, 1 g (Cefotaxime)</td>
			<td>PHARCO Pharmaceuticals</td>
			<td>24750/2006</td>
			<td>Drug 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Densitometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Coli ESBL strain</td>
			<td>Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon</td>
			<td></td>
			<td>Bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac Conkey + crystal violet agar</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>64169508</td>
			<td>For making agar plates used for subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)</td>
			<td>HIKMA Pharmaceuticals</td>
			<td>2BXMIA56N-AEF</td>
			<td>Drug 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller-Hinton Broth</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>69444</td>
			<td>For making bacterial media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>GJ54761</td>
			<td>For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OH19855 HH40868</td>
			<td>For the addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)</td>
			<td>sanofi aventis</td>
			<td>221937/2009</td>
			<td>Drug 3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quadruple-checkerboard: a modification of the three-dimensional checkerboard for studying drug combinations

Das Konzept der Arzneimittel-Kombinationstherapie gewinnt vor allem mit der drastischen Zunahme der Arzneimittelresistenz an Bedeutung. Das Quadruple Checkerboard, auch Q-Checkerboard genannt, zielt darauf ab, die Anzahl der möglichen Kombinationen zu maximieren, die zwischen vier Medikamenten in einem Experiment erhalten werden können, um die Zeit und Arbeit zu minimieren, die erforderlich sind, um die gleichen Ergebnisse mit anderen Protokollen zu erzielen. Dieses Protokoll basiert auf der einfachen Mikroverdünnungstechnik, bei der die Medikamente verdünnt und in mehreren 96-Well-Platten kombiniert werden.
Im ersten Satz von 96-Well-Platten wird Muller-Hinton-Brühe hinzugefügt, gefolgt von dem ersten erforderlichen Medikament (z. B. Cefotaxim hier), um es seriell zu verdünnen. Nachdem der erste Schritt abgeschlossen ist, wird ein weiterer Satz von 96-Well-Platten verwendet, um das zweite Medikament (z. B. Amikaci) zu verdünnen, das durch Entfernen eines bestimmten Volumens von Medikament 2 übertragen und in die entsprechenden Vertiefungen in den ersten Satz von 96-Well-Platten, die Medikament eins enthalten, gelegt wird. Der dritte Schritt erfolgt durch Zugabe der erforderlichen Konzentrationen des dritten Arzneimittels (z. B. Levofloxacin) zu den entsprechenden Platten im Ausgangssatz, der die Kombination von Arzneimittel 1 und 2 enthält. Der vierte Schritt erfolgt durch Zugabe der erforderlichen Konzentrationen des vierten Arzneimittels (z. B. Trimethoprim-Sulfamethoxazol) in die entsprechenden Platten im ersten Satz. Dann wird E. coli ESBL bakterielles Inokum hergestellt und hinzugefügt.
Diese Methode ist wichtig, um alle möglichen Kombinationen zu bewerten und hat ein breiteres Spektrum an Möglichkeiten, die darüber hinaus für In-vivo-Tests getestet werden können. Obwohl es sich um eine ermüdende Technik handelt, die viel Konzentration erfordert, sind die Ergebnisse bemerkenswert und zeitsparend, wo viele Kombinationen in einem einzigen Experiment getestet werden können.

Abbildung 2A stellt die Ergebnisse dar, die durch die Kombination von Cefotaxim und Amikacin mit spezifischen Konzentrationen von Levofloxacin und Trimethoprim-Sulfamethoxazol erzielt werden. Wir können im linken Teil der Abbildung die vier Platten sehen, die schematisch mit den Konzentrationen der Medikamente im rechten Teil der Abbildung dargestellt sind. Die Pfeile stellen die Vertiefungen auf der Schnittstelle Wachstum/kein Wachstum dar. Die farbigen Brunnen sind die Brunnen, die Wachst...

Watch this Scientific Journal Video about Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations at JoVE.com

Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

Dieses Protokoll beschreibt, wie alle möglichen Kombinationen untersucht werden können, die zwischen vier Medikamenten in einem einzigen Experiment erhalten werden können. Diese Methode basiert auf dem Standard-96-Well-Platten-Mikroverdünnungsassay und der Berechnung fraktionaler inhibitorischer Konzentrationen (FICs) zur Bewertung der Ergebnisse.

Vierfach-Schachbrett: Eine Modifikation des dreidimensionalen Schachbretts zur Untersuchung von Arzneimittelkombinationen

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The ...

quadruple-checkerboard-modification-three-dimensional-checkerboard

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biology

Unit 1

Pharmacodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

4.3K Aufrufe.  University of Balamand. Dieses Protokoll beschreibt, wie alle möglichen Kombinationen untersucht werden können, die zwischen vier Medikamenten in einem einzigen Experiment erhalten werden können. Diese Methode basiert auf dem Standard-96-Well-Platten-Mikroverdünnungsassay und der Berechnung fraktionaler inhibitorischer Konzentrationen (FICs) zur Bewertung der Ergebnisse.

Serie: Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

Chip-basierte dreidimensionale Zellkultur in perfundierten Micro-Bioreaktoren

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Forschung

Biologie

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Microfabrication der Chip-Größe Gerüste für die dreidimensionale Kultivierung der Zellen

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hallo-C: eine Methode, um die dreidimensionale Architektur des Genoms Study.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Ein analytisches Werkzeug, das zelluläre Morphologie Änderungen von Dreidimensionale Fluorescence Images Quantifiziert

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

Mit hochauflösenden Computertomographie, die dreidimensionale Struktur und Funktion pflanzlicher Gefäßsystem Visualisieren

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET-Imaging im dreidimensionalen Hydrogelen

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

Dreidimensionale Rekonstruktion der vaskulären Architektur des Eierstocks Passive Klarheit geclearte Maus

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Ein Gewebe Clearing-Methode für die dreidimensionale Darstellung von Fettgewebe

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful industrial commodities. Recent advances in synthetic biology have led to development of several cloning toolkits such as CyanoGate, a standardized modular cloning system for building plasmid vectors for subsequent transformation or conjugal transfer into cyanobacteria. Here we outline a detailed method for assembling a self-replicating vector (e.g., carrying a fluorescent marker expression cassette) and conjugal transfer of the vector into the cyanobacterial strains Synechocystis sp. PCC 6803 or Synechococcus elongatus UTEX 2973. In addition, we outline how to characterize the performance of a genetic part (e.g., a promoter) using a plate reader or flow cytometry.

Here, we present a protocol describing how to i) assemble a self-replicating vector using the CyanoGate modular cloning toolkit, ii) introduce the vector into a cyanobacterial host by conjugation, and iii) characterize transgenic cyanobacteria strains using a plate reader or flow cytometry.

Genetische Modifikation von Cyanobakterien durch Konjugation mit dem CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Single-Cell Resolution Dreidimensionale Bildgebung intakter Organoide

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...