Name: high-throughput identification of synergistic drug combinations by the overlap2 method
Uploaded: 2018-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method at JoVE.com

Bu eser patoloji departmanı, Utah Üniversitesi J.C.S.B. için bir başlangıç hibe tarafından desteklenmiştir

1. sinerji tahmin mutantlar örtüşme2 yöntemi (O2M) DataSet'in kimyasal-genetik üzerinden belirlenmesi
Not: Bu sinerji tahmin mutantlar Nichols ve arkiçin yayımlanan veri kümesi kullanarak tanımlamak için yöntemidir. 17 E. coli'. Ancak, bu herhangi bir kimyasal-genetik veri kümesi ve mikroorganizma yapılabilir. Bu veri kümeleri 100'den fazla küçük moleküller varlığında, yetiştirilen nakavt mutantlar için her küçük molekül her mutant bir kantitatif büyüme puan veren kütüphanesi içerir. İki tane sinerjik bilinmesi gereklidir ve büyüme puanları dahil veri kümesindeki her iki küçük moleküller için olmalıdır.
<ol><li>
Tüm mutantlar her küçük molekül tek bir konsantrasyon huzurunda yetiştirilen ortalama büyüme puanı ve standart sapmayı hesaplayın. Not: Bu yapılabilir herhangi bir elektronik tablo yazılımı kullanarak. Kahverengi laboratuvar Excel ve işlevlerini kullanır =AVERAGE(B3:B3981) ve =STDEV(B3:B3981) küçük molekül her sütununun hesaplamalar için.<ol>
<li>Bu yönlendirme Eğer farklı bir veri kümesi kullanarak farklı olabilir rağmen anlamına gelir ve standart sapmalar küçük molekül, her sütundaki hesaplayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Küçük molekül Nichols ve diğerleriiçin aynı veri kümesi kullanarak her konsantrasyon için Z puanları hesaplayın. 17 bir elektronik sayfa programında. Bunun için Z(2.5) negatif z skorları olacak = demek - 2,5 * standart sapma ve pozitif z score-ecek var olmak Z(2.5) = ortalama + 2,5 * standart sapma.</li>
	<li>Bu moleküller tüm konsantrasyonları bakmak için emin olmak bilinen sinerjik çifti oluşturan küçük moleküller önemli Z skorları mutantlar hangi gen içeren belirlemek. Bir mutant puan büyüme daha az negatif Z (2.5) puan edinildi veya bu küçük molekül için pozitif Z (2.5) puan daha büyük, önemli kabul edilir.</li>
	<li>Herhangi bir önemli gen mutantlar bir operon ait belirlemek. Not: E. coliiçin yazarlar tavsiye "Ecoli wiki" bilgi için kontrol eğer bir polycistronic RNA parçası olarak genlerin transkripsiyonu ile ilgili olarak.</li>
	<li>Farklı konsantrasyonlarda ilgi küçük moleküller çoğunluğu için ortak gen/operon mutantlar tanımlamak (Örn., antibiyotik trimetoprim ile synergize molekülleri tanımlamak için önemli bir Z gösteren mutantlar ararken ««puan) huzurunda trimetoprim ve bilinen sinerjik ortakları sulfamethizole veya sulfamethoxazole gibi büyüdü. Bunlar sözde sinerji tahmin mutantız.</li>
</ol>2. Synergizers O2M kimyasal-genetik Dataset içinde tahmin
<ol><li>Veri kümesi17' ye dönersek, sinerji tahmin mutant bir önemli bir büyüme puanı aydınlığa çıkartıyor küçük molekül her konsantrasyonu belirlemek. Bu küçük moleküller her konsantrasyon için hesaplanan Z skorları bakarak yapılır. Yine, bir önemli bir büyüme puan olumsuz Z skor veya küçük molekül bu konsantrasyon için pozitif Z puanı daha büyük olan. Not: bir molekül bile onun konsantrasyonları birinde görüntülenirse, molekül tahmin edilen bir synergizer olarak kabul edilir. Önemli bir büyüme puanı temin etmez herhangi bir tahmin edilen sigara synergizer moleküldür.</li>
</ol>3. öngörülen sinerjik etkileşim doğrulama
<ol><li>Tahmin edilen synergizers minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) bulma.
	<ol>
<li>E. coli bir gecede kültür 37 ° C'de M9 en az medyada büyümek Not: Herhangi bir gecede kültür faiz organizma için uygun şekilde tanımlanmış ortamda yetiştirilen olabilir. Kahverengi laboratuvar LB veya YPD gibi zengin medya önermez. M9 en az medya 10.5 g/L M9 suyu, %0,2 casamino asitler, 0.1 M CaCl2, % 0,4 glikoz, 1 M MgSO4, % 0.25 Nikotinik asit ve %0,33 tiamin H2o oluşur</li>
		<li>Eğer patojen ilgi küçük moleküller alınması üzerine literatürde bulundu mikrofon veri yüksek bir konsantrasyon dimetil sülfoksit (DMSO) dağıtılması (> 10 mg/mL).</li>
		<li>96-şey plaka kullanarak 100 µL M9 medya her şey için ekleyin. Toplam 200 µL içerecek şekilde bir ekstra 100 µL M9 medya sütun 1 ekleyin.</li>
		<li>Çoklukta (~ 10 µL) konsantre küçük molekül çözüm 1 sütun ekleyin. Sütun 1 (8 plaka küçük moleküller) kuyu başına bir küçük molekül. Not: Bu synergize tahmin edilmektedir küçük moleküller ilgi vardır. Kahverengi laboratuvar genellikle yüksek konsantrasyonlu küçük molekül çözümün E. coliinhibe olabilir % 100 DMSO miktarın altına olan 10 µL ekler.</li>
		<li>Küçük moleküller eklendikten sonra küçük moleküller plaka x ekseni oranında seyreltin. 100 µL çözüm sütun 1, sütun 2 yer alıp karıştırın. 100 µL sütun 2, 3 sütun içinde yer alıp karıştırın. 100 µL yerleştirilir kadar 11 sütununda bu işleme devam edin. Sütun 11 karıştırın, sonra o sütundaki 100 µL alıp atmak. Sütun 12 ile sadece medya verileri normalleştirmek için bırakın.</li>
		<li>Plaka aşılamak. Optik yoğunluk (OD600) bir gecede kültür elde etmek. Kültür ve OD600 0,002 itibaren M9 medyaya bir çözüm hazırlamak (veya uygun 500 hücre/µL ilgi istenen organizma için temsil eden konsantrasyon). Yani iyi başına 1.000 hücre kültür çözüm 2 µL plaka her kuyuya pipet.</li>
		<li>Yavaşça plaka sallamak ve 0 h okuma OD600 elde edilir. Plakayı 24 h 24 h okuma OD600 elde edilir için 37 ° C'de büyümeye izin. Not: Kullanım uygun diğer organizmalar için koşullar ilgi büyüyor.</li>
		<li>Her şey bir elektronik tablo programı kullanmanız için net büyüme hesaplamak.</li>
		<li>Ortalama hiçbir ilaç büyüme elde etmek için sütun 12 net büyüme ortalama. Bir elektronik tablo yazılımı kullanarak hiçbir ilaç büyüme ortalaması için diğer wells normalleştirmek. Bakmak için herhangi bir şey ile az % 10 büyüme MIC90 tanımlamak için. Herhangi bir MIC50 büyüme de az %50 ile gösterir. Bu Wells küçük molekül konsantrasyonu hesaplayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Dama tahtası deneyleri sinerjik etkileşim için
	<ol>
<li>E. coli bir gecede kültür medyada M9 en az önce büyümek. Not: Uygun kullanım koşulları diğer organizmalar için büyüyen.</li>
		<li>Her şey bir 96 iyi tabak ve bir ekstra 100 µL sütun 1 100 µL M9 medya ekleyin.</li>
		<li>Test küçük molekül eklemek (~ 8 MIC x) her şey sütun 1 ve çift konsantrasyon ekleyin (~ 16 x mikrofon) iyi A1 için (bir küçük molekül test plaka). Not: Bu miktar mikrofon test tamamlandı önceden belirlenir ve her potansiyel synergizer için farklıdır.</li>
		<li>Bir degrade seyreltme alarak 100 µL sütun 1 ve sütun 2 aktarma x ekseni üzerinde oluşturun. 100 µL sütun 11 eklenene kadar bu işleme devam edin. Karıştırın, sonra sütun 11 100 µL alıp atın. Herhangi bir ilaç sütun 12 (Şekil 1A) eklemeyin.</li>
		<li>Giriş uyuşturucu için y ekseni boyunca ikinci ilaç degradenin ayarlayın. Medya içeren 2 x mikrofon giriş molekülün satırındaki A. Mix ve seyreltik olarak daha önce alarak 100 µL satır A ve 100 µL satır G. Mix yerleştirilir kadar B. Continue (devam) yerleştirerek üzerinden 100 µL eklemek, 100 µL ve elden çıkarma giriş herhangi bir ilaç satır H. eklemek için sağlanması, Bu satır H ve sütun 12 test ilaç çifti (Şekil 1B) tek tek doz içeren sağlar.</li>
		<li>Plaka aşılamak. 2 µL OD600 0,002 bir E. coli kültürün her şey (iyi başına 1.000 hücreleri) ekleyin.</li>
		<li>0 h okuma plaka her kuyuya OD600 ölçmek.</li>
		<li>37 ° C'de 24 h plaka kuluçkaya</li>
		<li>24 saat her kuyuda OD600 ölçmek.</li>
	</ol></li>
	<li>Çözünme kesirli inhibitör konsantrasyon dizinden (FICI) hesaplama
	<ol>
<li>Her şey için net büyüme plaka, 0 h, bir elektronik tablo programında 24 h OD600 OD600 çıkararak hesaplar.</li>
		<li>Yazılım büyüme yok küçük molekül içerir her şey iyi H12 bölerek normalize.</li>
		<li>Sütun 12 giriş molekülünün MIC90 ve H. satırda potansiyel synergist MIC90 bulmak</li>
		<li>Büyüme yüzde 90'ını inhibe tüm kuyular için bak.</li>
		<li>Ya da en düşük (sinerjik) aşağıda o FICI90 hesaplamak veya yukarıda (düşman) en üst denklemi kullanarak her iki MIC90 değeri: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57241/57241eq1.jpg">
</li>
		<li>Herhangi bir FICI ≤ 0,5 olarak sinerjik düşünün ve FICI ≥ 4 antagonistik (Şekil 2). Not: Bu da MIC50 ile yapılabilir (% 50 büyüme inhibisyonu) bu mikrofon değerlerine göre bir FICI50 almak için.</li>
	</ol></li>
	<li>Bliss bağımsızlık tahlil Not: Bliss bağımsızlık bir mikrofon, kendi yoktu herhangi bir potansiyel synergist ile çalıştırılır.<ol>
<li>E. coli bir gecede kültür M9 medya 37 ° C'de daha önce olduğu gibi büyür. Not: Bu adımda yine, uygun yetişme şartlarına ilgi diğer organizmalar için kullanılabilir.</li>
		<li>96-şey plakaları potansiyel sinerjik molekül, giriş molekül, kasanın ve sigara tedavi kontrol testleri için hazır olun.</li>
		<li>Potansiyel synergist plaka her şey için 50 µL M9 medya ekleyerek oluşturun. 50 µL medya kümesi bir konsantrasyon (10 µM veya 100 µM) içeren bir satır her şey için potansiyel synergist ekleyin. Plaka başına 8 molekülleri sınayın.</li>
		<li>Giriş molekül plaka her şey için 50 µL medya ekleyerek oluşturun. 50 µL 4 x içeren eklemek her kuyuya 1 sütun için giriş ilacın MIC. X ekseni boyunca bir degrade seyreltme mikrofon tabak, sütun 1 50 µL alarak, dispersiyon ve sütun 2 karıştırma benzer oluşturun. Sütun sütun 12 50 µL atılması 12, kadar bu işlemi sürdürün. Her şey için bitiş toplam 100 µL bu yüzden her şey için bir ek 50 µL medya ekleyin.</li>
		<li>Kombinasyon plaka 96 iyi plaka kullanarak oluşturma, her şey için 50 µL medya ekleyin. 50 µL 4 x içeren eklemek her kuyuya 1 sütun için giriş ilacın MIC. Benzer sütun 1 50 µL alarak, dispersiyon ve sütun 2 karıştırma mikrofon tabak, x ekseni boyunca oranında seyreltin. Bu sütun 12, 50 µL 12 sütundan atılması için tüm yol devam. 50 µL 10 µM ya da her şey bir satır için 100 µM potansiyel synergist içeren medya ekleyin. Yine, bir konsantrasyon veya satır başına ilaç olmalıdır.</li>
		<li>Sigara tedavi kontrol plaka bütün wells için 100 µL M9 medya ekleyerek oluşturun.</li>
		<li>Tüm plakaları her yanı sıra daha önce bakteri kültürü 2 µL 0,002 veya 1.000 hücrelerin bir OD600 ile ekleyerek aşılamak.</li>
		<li>Her şey 0 ile 24 h OD600 ölçmek.</li>
	</ol></li>
	<li>Bliss bağımsızlık puan hesaplama
	<ol>
<li>Her şey için net büyüme plaka 0 h 24 h bir elektronik tablo programı kullanmanız büyümeden OD600 çıkararak hesaplar.</li>
		<li>Kuyuları ortalama büyüme için bir elektronik tablo programında hiçbir ilaç plaka normalleştirmek.</li>
		<li>Elektronik tablo yazılımı kullanarak, inhibisyon 1 net büyüme çıkararak hesaplar.</li>
		<li>Elektronik tablo yazılımı yalnızca giriş degradede içeren denetim plaka sütunlarda ortalama.</li>
		<li>Her şey için bliss puanı denklemi tarafından Hesapla: Bliss puanı (iyi X + giriş sütun X) -iyi X kombine =
</li>
		<li>Olumsuz puanları Wells giriş MIC90 aşağıda bulabilirsiniz. Not: Birden fazla konsantrasyonları arasında negatif puanları bir sinerjik etkileşim gösterir.</li>
	</ol></li>
</ol>4. yüksek üretilen iş ekran roman sinerjik çiftleri tanımlamak için sinerji tahmin mutantlar ile
<ol><li>
Sinerji tahmin mutantlar tanımlamak Not: Adım 1.5 sözde sinerji tahmin mutantlar tespit edilmiştir. Burada, hangi bu mutant bir yüksek üretilen iş ekran sinerjik ilaçlar için en iyi çalışacaktır belirlemek. Biz bir Bioscreen makine bu tahlil gerçekleştirilen ama 96 iyi plaka okuyucu sayısı-meli da var olmak kabul edilebilir.<ol>
<li>Her sözde sinerji tahmin mutantlar ve vahşi-türü hücre M9 en az medyada büyümek.</li>
		<li>100 kadar set de petek plaka (veya 96 iyi plaka) uygun büyüme orta, büyüme orta + giriş uyuşturucu, büyüme orta + giriş ilaç ve büyüme orta + sinerjik sigara uyuşturucu bilinen sinerjik ortağı ile. Araç denetimleri eklemek için emin olun. Not: Dört kuyu her zorlanma/ilaç/yoğunlaşması çoğaltmak öneririz.</li>
		<li>Şey, boş denetim wells de dahil olmak üzere başına 1.000 hücre aşılamak.</li>
		<li>48 h 37 ° C'de sallayarak ile büyümek ve OD600 her 20 dk okuyun.</li>
		<li>Vahşi-türü ve sinerji arasındaki en büyük büyüme fark giriş uyuşturucu ve bilinen sinerjik ortakları huzurunda tahmin mutant hücreleri gösterir ilaç konsantrasyonu ve saat noktayı belirlemek. Uygun zaman nokta ve konsantrasyon uyuşturucu huzurunda sinerjik giriş uyuşturucu (Şekil 3) ile hareket değil bilinen yetiştirilen vahşi tipi ve sinerji tahmin mutant hücreleri arasında fazla büyüme fark olmamalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sinerjik uyuşturucu için yüksek üretilen iş ekran
	<ol>
<li>Vahşi-türü hücreleri ve sinerji tahmin mutant hücreleri M9 en az medyada büyümek. Not: uygun büyüme orta vade farkı organizma için kullanın.</li>
		<li>Uyuşturucu de, önceki adımda belirlenen küme toplama, küçük moleküller ile 100 µL ortamı içeren ortam her kitaplıktan ekleyin. Boş wells (olmadan hücreleri) ve wells ile araç denetimleri içerir (e.g., DMSO) herhangi bir büyüme inhibisyonu için uyuşturucu seyreltme araç tarafından hesap için.<ol>
<li>En az dört araç kontrol kuyu başı plaka, ideal iyi pozisyon etkileri için hesap için plaka dağılmış hazırlayın. Deneyleri değişken varsa, de satır/sütun başına en az bir araç denetim içerir ve her satır/sütun denetim de denetimi olarak yerine bir bütün plaka (adım 4.2.5) için her satır/sütun için Z score hesaplamak için kullanın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kültür 2 µL her yanı sıra daha önce ekleyin. (Vahşi türü bakteri ve tahmin edilen sinerji mutant bakteriler için bir tabak bir tabak).</li>
		<li>0 ile 18 h E. coli için veya 48 h OD600 C. neoformansiçin değerlendirmek.</li>
		<li>Elektronik tablo yazılımı kullanarak, net büyüme araç kontrol kuyulardan boş Wells OD600 çıkararak hesaplar. Kuyu-2.5, Z-score ile tanımlamak (Z puanı demek - 2.5 = * standart sapma). Bu wells bir potansiyel synergist küçük molekül içerir.</li>
		<li>3. adımda açıklanan yöntemleri kullanarak ekran sayısı doğrulayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Antimicrobial+Resistance+Crisis:+Causes,+Consequences,+and+Management.">The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management.</a> Front Public Health. 2, 145 (2014).</li><li>Butts, A., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+Drug+Discovery:+Something+Old+and+Something+New.">Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New.</a> PLOS Pathogens. 8 (9), e1002870 (2012).</li><li>Roemer, T., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+Drug+Development:+Challenges,+Unmet+Clinical+Needs,+and+New+Approaches.">Antifungal Drug Development: Challenges, Unmet Clinical Needs, and New Approaches.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (5), a019703 (2014).</li><li>Oprea, T. I., Mestres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Repurposing:+Far+Beyond+New+Targets+for+Old+Drugs.">Drug Repurposing: Far Beyond New Targets for Old Drugs.</a> AAPS J. 14 (4), 759-763 (2012).</li><li>Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosing+the+decline+in+pharmaceutical+R&amp;D+efficiency.">Diagnosing the decline in pharmaceutical R&amp;D efficiency.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (3), 191-200 (2012).</li><li>Rangel-Vega, A., Bernstein, L. R., Mandujano-Tinoco, E. A., Garc&#237;a-Contreras, S. J., Garc&#237;a-Contreras, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+repurposing+as+an+alternative+for+the+treatment+of+recalcitrant+bacterial+infections.">Drug repurposing as an alternative for the treatment of recalcitrant bacterial infections.</a> Front Microbiol. 6, 282 (2015).</li><li>Torella, J. P., Chait, R., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+Drug+Synergy+in+Antimicrobial+Treatments.">Optimal Drug Synergy in Antimicrobial Treatments.</a> PLoS Comput Biol. 6 (6), e1000796 (2010).</li><li>Cowen, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+Hsp90+function+as+a+powerful,+broadly+effective+therapeutic+strategy+for+fungal+infectious+disease.">Harnessing Hsp90 function as a powerful, broadly effective therapeutic strategy for fungal infectious disease.</a> P Natl Acad Sci. 106 (8), 2818-2823 (2009).</li><li>Zuo, G. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+Antibacterial+and+Antibiotic+Effects+of+Bisbenzylisoquinoline+Alkaloids+on+Clinical+Isolates+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+Aureus+(MRSA).">Synergistic Antibacterial and Antibiotic Effects of Bisbenzylisoquinoline Alkaloids on Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA).</a> Molecules. 16 (12), 9819 (2011).</li><li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+drug+combinations:+interaction+and+network+perspectives.">Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives.</a> Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 111-128 (2009).</li><li>Wambaugh, M. A., Shakya, V. P. S., Lewis, A. J., Mulvey, M. A., Brown, J. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+identification+and+rational+design+of+synergistic+small-molecule+pairs+for+combating+and+bypassing+antibiotic+resistance.">High-throughput identification and rational design of synergistic small-molecule pairs for combating and bypassing antibiotic resistance.</a> PLOS Biol. 15 (6), e2001644 (2017).</li><li>Brown, J. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+biology+of+a+fungal+meningitis+pathogen+using+chemical+genetics.">Unraveling the biology of a fungal meningitis pathogen using chemical genetics.</a> Cell. 159 (5), 1168-1187 (2014).</li><li>Cokol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+exploration+of+synergistic+drug+pairs.">Systematic exploration of synergistic drug pairs.</a> Mol Syst Biol. 7, 544-544 (2011).</li><li>Borisy, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+discovery+of+multicomponent+therapeutics.">Systematic discovery of multicomponent therapeutics.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (13), 7977-7982 (2003).</li><li>Tang, J., Wennerberg, K., Aittokallio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?+The+Saariselk&#228;+agreement+revisited.">What is synergy? The Saariselk&#228; agreement revisited.</a> Front Pharmacol. 6, 181 (2015).</li><li>Hsieh, M. H., Yu, C. M., Yu, V. L., Chow, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+assessed+by+checkerboard.+A+critical+analysis.">Synergy assessed by checkerboard. A critical analysis.</a> Diagn Microbiol Infect Dis. 16 (4), 343-349 (1993).</li><li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+Landscape+of+a+Bacterial+Cell.">Phenotypic Landscape of a Bacterial Cell.</a> Cell. 144 (1), 143-156 (2011).</li><li>Chandrasekaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies.">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Mol Syst Biol. 12 (5), (2016).</li><li>Pradhan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomic+profiling+of+Plasmodium+falciparum+as+a+tool+to+aid+antimalarial+drug+discovery.">Chemogenomic profiling of Plasmodium falciparum as a tool to aid antimalarial drug discovery.</a> Sci Rep. 5, 15930 (2015).</li><li>Pethe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+screen+in+Mycobacterium+tuberculosis+identifies+carbon-source-dependent+growth+inhibitors+devoid+of+in+vivo+efficacy.">A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy.</a> Nat Commun. 1 (5), 1-8 (2010).</li><li>Diezmann, S., Michaut, M., Shapiro, R. S., Bader, G. D., Cowen, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Hsp90+Genetic+Interaction+Network+in+Candida+albicans+Reveals+Environmental+Contingency+and+Rewired+Circuitry.">Mapping the Hsp90 Genetic Interaction Network in Candida albicans Reveals Environmental Contingency and Rewired Circuitry.</a> PLoS Genetics. 8 (3), e1002562 (2012).</li><li>Robbins, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Antifungal+Combination+Matrix+Identifies+a+Rich+Pool+of+Adjuvant+Molecules+that+Enhance+Drug+Activity+Against+Diverse+Fungal+Pathogens.">An Antifungal Combination Matrix Identifies a Rich Pool of Adjuvant Molecules that Enhance Drug Activity Against Diverse Fungal Pathogens.</a> Cell reports. 13 (7), 1481-1492 (2015).</li><li>Wildenhain, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+Synergism+from+Chemical-Genetic+Interactions+by+Machine+Learning.">Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning.</a> Cell Syst. 1 (6), 383-395 (2015).</li><li>Spitzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+discovery+of+syncretic+drug+combinations+that+potentiate+the+antifungal+fluconazole.">Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole.</a> Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Sinerjik küçük molekül çiftleri mikrobik enfeksiyonları tedavi güçlü bir araç olabilir, henüz sinerjik çiftleri tanımlamak için zor, çünkü onlar tam klinik potansiyellerini ulaşmak değil. Bu kağıt sinerjik çiftleri basit ikili kombinasyonları çok daha hızlı tanımlamak için bir yöntem açıklanır. Kimyasal-genetik veri kümelerini kullanarak, O2M daha sonra ekran büyük kitaplıklarına küçük moleküllerin bir okuma olarak sinerjik çiftleri tahmin etmek için kullanılabilir gen altını...

Antibiyotik dirençli bakteri 2 milyondan fazla enfeksiyonları ve 23.000 ölümlerin her yıl Amerika Birleşik Devletleri'nin CDC1göre neden. Yeni tedaviler bunlar hastalık üstesinden gelmek için ihtiyaç vardır. Bu yeni tedaviler tanımlamak için stratejiler geliştirme yeni antimikrobiyal ilaçların veya küçük moleküller diğer koşullar mikrobiyal enfeksiyonlar2,3,4tedavisi onaylanmış repurposing içerir. Ancak, yeni ilaç keşfi çok pahalı ve zaman alıcı. Uyuşturucu repurposing roman uyuşturucu tanıtabilecek değil veya uyuşturucu5,6hedefler. Laboratuarımızın sinerjik kombinasyon tedavileri bilinen üçüncü bir strateji üzerinde duruluyor. İki küçük molekül birlikte onların bireysel efficacies7katkı etkisi büyük bir etkinlik var sinerjik kombinasyon oluşur. Ayrıca, sinerjik kombinasyonları bir patojen dayanıklı onları büyük potansiyel8,9işleme ek olarak daha az istenmeyen hedef dışı etkilere sahip çift küçük moleküllerin birine karşı etkili olabilir, 10.
Sinerjik çiftleri uyuşturucu kombinasyonları11,12,13yaklaşık % 4-10 meydana nadirdir. Böylece, geleneksel teknikleri ikili ekranlar gibi zor ve zaman alıcı, küçük bir kütüphane üzerinden potansiyel kombinasyon yüz moleküllerin binlerce vardır. Ayrıca, sinerjik etkileşim genellikle bileşikler14aktivitesinden bilinemez. Ancak, yazarlar için örtüşme2 yöntemi (O2M)12olarak adlandırılan sinerjik çiftlerini ekran yüksek üretilen iş yaklaşımı geliştirdi. Burada, açıklanan bu yöntem bu sinerjik çiftleri daha hızlı, daha verimli tanımlanması için sağlar. O2M bilinen bir sinerjik çift ve bir kimyasal-genetik veri kullanımını gerektirir. Nakavt mutantlar Kütüphanesi birçok farklı küçük molekül huzurunda yetiştirilen kimyasal-genetik veri kümeleri oluşturulur. Bir molekül bilinen bir sinerjik çiftindeki ikinci sinerjik molekül olarak belirli nakavt mutant üzerinden fenotip aynı neden olmaktadır, aynı bu mutant üzerinden fenotip aydınlığa çıkartıyor diğer küçük molekül de bilinen her üye ile synergize sinerjik çifti. Bu mantığı kahverengi laboratuarda sinerjik antibiyotik çiftleri Escherichia coli (e.coli) karşı etkin ve sinerjik antifungal ilaç çiftleri patojenik mantar Cryptococcus neoformans (C. karşı etkin tanımlamak için kullanılmıştır neoformans)11,12. O2M sadece çeşitli patojenler için uyarlanabilir değil ama büyük Kütüphaneler moleküllerin tarama için kolayca ve hızla sinerjik çiftleri tanıtılmasına olanak sağlar. O2M tarafından tanımlanan genetik mutant ile tarama sadece sinerji için öngörülen küçük moleküller doğrulamak için bize izin verir. Olsaydı bile sadece 20 molekülleri synergize tahmin bu kitaplıkta, sinerji için şimdi test birkaç gün sürer, ancak böylece, 2.000-molekül kitaplığa ikili test ay, alır. O2M programlama bilgisi gerektirmez ve gerekli ekipman çoğu labs veya çekirdek imkanları mevcuttur. Araştırmacılar yanı sıra uyuşturucu kombinasyonlarda baktılar, O2M analiz bir uyuşturucu testi tamamladı ve önemli ilaç-ilaç etkileşimleri tespit ederek onların sayısı genişletmek isteyen herkese ilgilendirir. Aşağıda bakteri sinerjik küçük moleküllerin belirlenmesi gibi iyi bilinen deneyleri15,16öngörülen sinerjik etkileşim doğrulama protokolüdür.

<table><tbody><tr><td>Bioscreen C</td><td>instrument</td><td>Growth Curves USA</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1</td><td>instrument</td><td>BioTek</td><td></td></tr><tr><td>M9 broth</td><td>reagent</td><td>Amresco</td><td>J863-500G</td></tr><tr><td>Casamino Acids</td><td>reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1424-500</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>reagent</td><td>Sigma</td><td>G7021-10KG</td></tr><tr><td>Nicotinic Acid</td><td>reagent</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12683</td></tr><tr><td>Thiamine</td><td>reagent</td><td>Acros Organics</td><td>148991000</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;Dihydrate</td><td>reagent</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;Heptahydrate</td><td>reagent</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td></tr><tr><td>chemical-genetics dataset</td><td>dataset</td><td>examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text.</td><td></td></tr><tr><td>trimethoprim (example input drug; any can be used)</td><td>reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19552701</td></tr><tr><td>sulfamethoxazole (example test drug; any can be used)</td><td>reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15671125</td></tr></tbody></table>

high-throughput identification of synergistic drug combinations by the overlap2 method

Antimikrobiyal ilaçlar önemli ölçüde yaşam kalitesi ve ömrü 20inci yüzyılda artmıştır rağmen antimikrobiyal direnç tüm toplumumuzun yetenek sistemik enfeksiyonları tedavisi için tehdit ediyor. Yalnız Amerika Birleşik Devletleri'nde, antibiyotik dirençli enfeksiyonlar bir yıl ve maliyeti yaklaşık 20 milyar YTL ek sağlık hizmetlerinde yaklaşık 23.000 kişi öldür. Antimikrobiyal direnç mücadele için bir yaklaşım bulaşmasını organizma ve onun ilaç direnci profil tespit edilmiştir önce enfeksiyon, kritik erken dönemde özellikle yararlı olan kombinasyon tedavisi olduğunu. Birçok antimikrobiyal tedavi kombinasyon tedavileri kullanın. Ancak, bu kombinasyonlar çoğu katkı, Birleşik etkinlik bireysel antibiyotik etkinliğini toplamı ile aynı olduğu anlamına gelir. Bazı kombinasyon tedavileri sinerjik: Birleşik etkinlik katkı daha çok daha büyüktür. Antimikrobiyal ilaç dirençli suşların büyümesini inhibe çünkü sinerjik kombinasyonları özellikle yararlıdır. Ancak, bu kombinasyonlar nadir ve tespit etmek zordur. Bu ikili bir şekilde test edilmesi için gerekli molekülleri sayısının çokluğu kaynaklanmaktadır: 1 milyon potansiyel kombinasyon 1.000 moleküllerin bir kütüphane bulunmaktadır. Böylece, çabaları molekülleri sinerji tahmin etmek için yapılmıştır. Bu makalede çakışma2 yöntemi (O2M) bilinen sinerjik küçük molekül çiftleri oluşabileceğini bizim yüksek-den geçerek yöntemi. O2M desen kimyasal genetik veri kümesinden gelen aşırı duyarlı her molekül sinerjik bir çift, ancak diğer molekülleri mutantlar tanımlamak için kullanır. Kahverengi laboratuvar mutant ama değil vahşi türü hücre büyümesini inhibe molekülleri yüksek üretilen iş ekran gerçekleştirerek bu büyüme fark patlatır. Laboratuar çalışma daha önce antibiyotik trimetoprim ve bu strateji kullanarak antifungal ilaç flukonazol ile synergize molekülleri tanımlanmış. Burada, yazarlar için birden fazla mikroorganizmaların değiştirilebilir roman sinerjik birleşimler için ekran için bir yöntem mevcut.

Dama tahtası deneyleri sinerjik etkileşim ölçmek için yarı nicel bir yöntemdir. FICI, çıkış final skoru belirleyen bir ilaç kombinasyonu sinerjik (FICI ≤0.5) görülürse, Sigara-etkileşim (0,5 < FICI < 4), ya da antagonist (FICI ≥4.0). Şekil 1 bir dama tahtası tahlil uyuşturucu degradeler ayarlamak verilmektedir. Şekil 2 ortak sonuçlar gösterilmektedir. % 90 Büyüme inhibisyon daha az görüntülemek büy...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method at JoVE.com

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Sinerjik uyuşturucu zor ve zaman alıcı ampirik olarak tanımlamak oluşur. Burada, belirlenmesi ve sinerjik küçük moleküller doğrulama yöntemi açıklanmaktadır.

Sinerjik uyuşturucu kombinasyonları örtüşme2 yöntemi tarafından yüksek üretilen iş tanımlaması

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

high-throughput-identification-synergistic-drug-combinations-overlap2

Research

JoVE Journal

Genetics

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

11.6K Görüntüleme.  University of Utah. Sinerjik uyuşturucu zor ve zaman alıcı ampirik olarak tanımlamak oluşur. Burada, belirlenmesi ve sinerjik küçük moleküller doğrulama yöntemi açıklanmaktadır.

Video: High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy against cancer. Here we provide a protocol to identify a rational combination at the preclinical step. First, we describe a cell-based assay to assess the synergism between anticancer mAb and cytotoxic drugs, that uses the combination index equation of Chou and Talalay1. This includes the measurement of tumor cell drug- and antibody-sensitivity using an MTT assay, followed by an automated computer analysis to calculate the combination index (CI) values. CI values of &lt;1 indicate synergism between tested mAbs and cytotoxic agents1. To corroborate the in vitro findings in vivo, we further describe a method to assess the combination regimen efficacy in a xenograft tumor model. In this model, the combined regimen significantly delays tumor growth, which results in a significant extended survival in comparison to single-agent controls. Importantly, the in vivo experimentation reveals that the combination regimen is well tolerated. This protocol allows the effective evaluation of anticancer drug combinations in preclinical models and the identification of rational combination to evaluate in clinical trials.

This protocol describes how to assess synergism between an anticancer antibody and antineoplastic drugs in preclinical models by using the combination index equation of Chou and Talalay.

Antikanser antikor etkinliğinin Antineoplastic uyuşturucu tarafından kullanılmasının muhtemelen: antikor-uyuşturucu Synergism kombinasyon Dizin denklem kullanılarak tespiti

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

Kanser Araştırmaları

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of both synthetic lethal interactors leads to loss of cell viability or cell death. The best studied synthetic lethal interaction is between BRCA1/2 and PARP1, with PARP1 inhibitors being used in clinical practice to treat patients with BRCA1/2 mutated tumors. Large genetic screens in model organisms but also in haploid human cell lines have led to the identification of numerous additional synthetic lethal interaction pairs, all being potential targets of interest in the development of novel tumor therapies. One approach is to therapeutically target genes with a synthetic lethal interactor that is mutated or significantly downregulated in the tumor of interest. A second approach is to formulate drug combinations addressing synthetic lethal interactions. In this article, we outline a data integration workflow to evaluate and identify drug combinations targeting synthetic lethal interactions. We make use of available datasets on synthetic lethal interaction pairs, homology mapping resources, drug-target links from dedicated databases, as well as information on drugs being investigated in clinical trials in the disease area of interest. We further highlight key findings of two recent studies of our group on drug combination assessment in the context of ovarian and breast cancer.

Large genetic screens in model organisms have led to the identification of negative genetic interactions. Here, we describe a data integration workflow using data from genetic screens in model organisms to delineate drug combinations targeting synthetic lethal interactions in cancer.

Sentetik Ölümcül Etkileşimleri Hedefleyen İlaç Kombinasyonlarını Tanımlamak için Veri Entegrasyonu İş Akışı

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in glioblastoma (GBM), the most prevalent and devastating primary brain tumor. The presence of GSCs makes the GBM very refractory to most of individual targeted agents, so high-throughput screening methods are required to identify potential effective combination therapeutics. The protocol describes a simple workflow to enable rapid screening for potential combination therapy with synergistic interaction. The general steps of this workflow consist of establishing luciferase-tagged GSCs, preparing matrigel coated plates, combination drug screening, analyzing, and validating the results.

Hasta Kaynaklı Glioma Kök Hücreleri Kullanarak GBM için Potansiyel Kombinasyon Tedavisini Belirlemek için Hızlı Tarama İş Akışı

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Spheroid Drug Sensitivity Screening in Glioma Stem Cell Lines

In vitro drug sensitivity screens are important tools in the discovery of anti-cancer drug combination therapies. Typically, these in vitro drug screens are performed on cells grown in a monolayer. However, these two-dimensional (2D) models are considered less accurate compared to three-dimensional (3D) spheroid cell models; this is especially true for glioma stem cell lines. Cells grown in spheres activate different signaling pathways and are considered more representative of in vivo models than monolayer cell lines. This protocol describes a method for in vitro drug screening of spheroid lines; mouse and human glioma stem cell lines are used as an example. This protocol describes a 3D spheroid drug sensitivity and synergy assay that can be used to determine if a drug or drug combination induces cell death and if two drugs synergize. Glioma stem cell lines are&#160;modified to express RFP. Cells are plated in low attachment round well bottom 96 plates, and spheres are allowed to form overnight. Drugs are added, and the growth is monitored by measuring the RFP signal over time using the Incucyte live imaging system,&#160;a fluorescence microscope embedded in the tissue culture incubator. Half maximal inhibitory concentration (IC50), median lethal dose (LD50), and synergy score are subsequently calculated to evaluate sensitivities to drugs alone or in combination. The three-dimensional nature of this assay&#160;provides a more accurate reflection of tumor growth, behavior, and drug sensitivities in vivo, thus forming the basis for further preclinical investigation.

In vitro drug sensitivity screens are important tools for discovering anti-cancer drug combinations. Cells grown in spheres activate different signaling pathways and are considered more representative of in vivo models than monolayer cell lines. This protocol describes a method for in vitro drug screening for spheroid lines.

In vitro drug sensitivity screens are important tools in the discovery of anti-cancer drug combination therapies. Typically, these in vitro drug screens ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Drug Repurposing Hypothesis Generation Using the "RE:fine Drugs" System

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The goal of computational methods for drug repurposing is to enable solutions for safer, cheaper and faster drug discovery. Towards this end, we developed a novel method that integrates genetic and clinical phenotype data from large-scale GWAS and PheWAS studies with detailed drug information on the concept of transitive Drug-Gene-Disease triads. We created "RE:fine Drugs," a freely available, interactive dashboard that automates gene, disease and drug-based searches to identify drug repurposing candidates. This web-based tool supports a user-friendly interface that includes an array of advanced search and export options. Results can be prioritized in a variety of ways, including but not limited to, biomedical literature support, strength and statistical significance of GWAS and/or PheWAS associations, disease indications and molecular drug targets. Here we provide a protocol that illustrates the functionalities available in the "RE:fine Drugs" system and explores the different advanced options through a case study.

Here we describe a protocol using the web-based drug repurposing hypothesis generation tool: "RE:fine Drugs." This protocol can be modified to a user's preferences at the level of the query type (gene, drug or disease) and/or the range of available advanced options.

&quot;RE: İnce ilaçlar kullanılması&quot; İlaç repurposing Hipotez Üretim Sistemi

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The ...

Tıp

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR bacteria are increasingly becoming a necessity. One such approach is combination therapy, in which two or more antibiotics are used together to treat an infection against which one or both of the drugs may be ineffective alone. When two drugs, in combination, exert a greater than additive effect, they are considered synergistic. In vitro investigation of synergistic activity is an important first step in evaluating the possible efficacy of drug combinations. Two main in vitro synergy testing methods have been developed: the checkerboard array and the time-kill study. In this paper, we present an automated checkerboard array method that makes use of inkjet printing technology to increase the efficiency and accuracy of this technique, as well as a standard manual time-kill synergy method. The automated checkerboard array can serve as a high-throughput screening assay, while the manual time-kill study provides additional, complementary data on synergistic activity and killing.
The checkerboard array is a modification of standard minimum inhibitory concentration (MIC) testing, in which bacteria are incubated with antibiotics at different concentration combinations and evaluated for growth inhibition after overnight incubation. Manual performance of the checkerboard array requires a laborious and error-prone series of calculations and dilutions. In the automated method presented here, the calculation and dispensing of required antibiotic stock solution volumes are automated through the use of inkjet printer technology. In the time-kill synergy assay, bacteria are incubated with the antibiotics of interest, both together and individually, and sampled at intervals over the course of 24 h for quantitative culture. The results can determine whether a combination is synergistic and whether it is bactericidal, and provide data on inhibition and killing of bacteria over time.

Antimicrobial synergy testing is used to evaluate the effect of two or more antibiotics used in combination and is typically performed by one of two methods: the checkerboard array or the time-kill assay. Here, we present an automated, inkjet printer-assisted checkerboard array synergy technique and a classic time-kill synergy study.

Antimikrobiyal sinerji mürekkep püskürtmeli yazıcı yoluyla tarafından test otomatik Dama Tahtası dizi ve el ile zaman-kill yöntem

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Biyoloji

Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many doses, allow sensitive measurement of drug interactions. However, these assays are costly and do not scale well for measuring interaction among many drugs. Several recent studies have reported drug interaction measurements using a diagonal sampling of the traditional checkerboard assay. This alternative methodology greatly decreases the cost of drug interaction experiments and allows interaction measurement for combinations with many drugs. Here, we describe a protocol to measure the three pairwise interactions and one three-way interaction among three antibiotics in duplicate, in five days, using only three 96-well microplates and standard laboratory equipment. We present representative results showing that the three-antibiotic combination of Levofloxacin + Nalidixic Acid + Penicillin G is synergistic. Our protocol scales up to measure interactions among many drugs and in other biological contexts, allowing for efficient screens for multi-drug synergies against pathogens and tumors.

In this protocol, we describe how to make Loewe additivity-based drug interaction measurements for pairwise and three-way drug combinations.

Ölçü sinerji arasında pek çok uyuşturucu için köşegen yöntemi

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The Quadruple&#160;checkerboard, also called the Q-checkerboard, aims at maximizing the number of possible combinations that can be obtained between four drugs in one experiment to minimize the time and work needed to accomplish the same results with other protocols. This protocol is based on the simple micro dilution technique where the drugs are diluted and combined together in several 96-well plates.
In the first set of 96-well plates, Muller-Hinton broth is added followed by the first required drug (e.g., Cefotaxime here) to serially dilute it. After the first step is done, another set of 96-well plates is used to dilute the second drug (e.g., Amikaci), which will be transferred by removing a specific volume of drug 2 and put in the corresponding wells in the first set of 96-well plates that contains drug one. The third step is done by adding the required concentrations of the third drug (e.g., Levofloxacin), to the appropriate plates in the initial set containing combination of drug 1 and 2. The fourth step is done by adding the required concentrations of the fourth drug (e.g., Trimethoprim-sulfamethoxazol) into the appropriate plates in the first set. Then, E. coli ESBL bacterial inoculum will be prepared and added.
This method is important to evaluate all the possible combinations and has a wider range of possibilities to be tested furthermore for in vivo testing. Despite being a tiring technique requiring a lot of focus, the results are remarkable and time saving where a lot of combinations can be tested in a single experiment.

This protocol describes how to study all possible combinations that can be obtained between four drugs in one single experiment. This method is based on the standard 96-well plate micro dilution assay and the calculation of fractional inhibitory concentrations (FICs) to evaluate the results.

Sinerjik uyuşturucu kombinasyonları örtüşme² yöntemi tarafından yüksek üretilen iş tanımlaması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler