Wir danken Jozsef Storch, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue und Andrea Sanchez für konstruktive und kritische Diskussion. Dr. Sharyn Perry für die phänotypische Fotografien. Dieses Material basiert auf Arbeit von der National Science Foundation unter Genossenschaft Vereinbarung Nr. 1355438 unterstützt.

1. Erstellen einer Verdünnung-Bibliothek
<ol><li>Beschriften Sie 625 Verdünnung Bibliothek Platten von hand um sicherzustellen, dass sie auf die entsprechende Platte aus der chemischen Bibliothek übereinstimmen. Darüber hinaus verbinden im Fluss und Schläuchen, die Multichannel-Tipp Wash automatisiert Labware Positionierer (ALP) indem sie durch das Laufwerk der Konsole an den 5-Gallonen-Behälter (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Auf zugreifen Sie den Computer und die Waschpumpe durch die Verbindung von der Gerätesteuerung bis zur Multichannel-Tipp Wash ALP schalten Sie ein, damit Wasser zirkulieren. Dies schaltet automatisch am Ende des Protokolls.</li>
	<li>Last, befestigt mit der Hand, den Stapler 10 zum Stapler-Karussell in der folgenden Reihenfolge in Hotels A - D (Abbildung 4, Stapler); eine Schachtel AP96 P20 Pipettenspitzen in Saal 1, vier 96-Well-V-Bodenplatten in Zimmer 2-5 mit den beiden oberen Platten, Lager Konzentrationen aus der bestellten Bibliothek und die beiden unteren Platten leer (Abbildung 5, Stapler). Darüber hinaus laden eine Schachtel AP96 P20 Pipettenspitzen in Raum 6 und vier 96-Well-V-Bodenplatten in Zimmer 7-9 mit den beiden oberen Platten, Lager Konzentrationen der bestellten Bibliothek und die beiden unteren Platten leer (Abbildung 5, Stapler).</li>
	<li>Eingestellt von hand, bis das Deck mit einer 300 mL Wasser-Reservoir auf P3, 300 mL 70 % EtOH Badewanne auf P7, Tipp Loader ALP (TL1) und Mehrkanal-Tipp Wash ALP (TW1) (Abbildung 4und Abbildung 5, Deck Deck).</li>
	<li>Mit der Betriebssoftware, präsentieren Sie AP96 P20 Pipettenspitzen aus den Stapler 10 und verschieben Sie sie in die Tipp-Loader-ALP. Hinweis: 1,5 bis 1.12 alle sind mit der Flüssigkeit, die Handhabung des Roboters Betriebssoftware durchgeführt; siehe Tabelle der Materialien.</li>
	<li>2 Zimmer von Hotel A zu präsentieren und trennen Sie alle vier 96-Well-V-Boden Platten auf dem Deck, Platzierung der Unterseite zwei auf P4 und P8 und die beiden oberen auf P5 und P9 (Abbildung 4).</li>
	<li>Laden Sie AP96 P20 Pipettenspitzen mit dem Loader Tipp ALP auf den 96-Kanal 200 µL Kopf. Aspirieren 90 µL aus 300 mL Wasser-Reservoir und verzichten in der 96-Well-V-Verdünnung Bodenplatte auf P4. Wiederholen Sie diesen Schritt für die Platte auf P8.</li>
	<li>Mischen Sie die chemische Bibliothek Platte auf P5 wiederholt Absaugen und 15 µL dreimal. Darüber hinaus Aspirieren Sie 10 µL aus der chemischen Bibliothek Platte auf P5 und verzichten Sie 10 µL in die Verdünnung Platte auf P4 zu.</li>
	<li>Mischen Sie den Lösungen der Platte auf P4 wiederholt Absaugen und 50 µL insgesamt drei Mal. Einmal gemischt, saubere Zeiten der AP96 P20 Pipettenspitzen durch Absaugen und Verzicht auf 70 µL 70 % EtOH von P7, dann waschen in der Multichannel-Tipp Wash ALP durch Absaugen und Verzicht auf eine Volumen von 110 % des Wassers vier.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1,8-1,9 für das zweite paar Platten auf P8 und P9. Beim Erstellen der zweiten 96-Well-V-Verdünnung Bodenplatte, Stapel die Platten in der folgenden Reihenfolge von unten nach oben: P4, P9, P5 und P8. Legen Sie den Stapel auf einem leeren statischen ALP; P1, P2, P6, P10, P11, P12 oder P13.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.6-1.10 bis 5 Zimmer im Hotel A leer ist. Wiederholen Sie Schritt 1.5 auf Raum 6 erreichen, Umzug neue AP96 P20 Pipettenspitzen in der Tipp-Loader-ALP und Platzierung der verwendeten AP96 P20 Pipettenspitzen auf einer leeren statischen Alm.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.6-1.10 bis Zimmer 9 Hotels A leer ist. Jedoch müssen um zur Hotel B zu gelangen, die Platten und Tipps auf dem Deck in Hotel A. zurückgeladen werden</li>
	<li>Nachfüllen Sie, Handarbeit, 300 mL Wasser-Reservoir. Dieser Schritt ist entscheidend, und das Computerprogramm übernehmen eine Pause über diese Nachricht, dass der Benutzer drücken Sie "weiter", vor dem nächsten Schritt fort.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1,5-1.13 für die restlichen Hotels, gewährleistet eine volle 300 mL Wasser-Reservoir jedes Mal vor dem Fortfahren zum nächsten Hotel.</li>
</ol>2. Hinzufügen von Medien-Saatgut-Mischung zu Platten Screening
<ol><li>½ Murashige und Skoog (MS) Medien machen mit 0,1 % Agar durch Zugabe von 4,3 g MS Salts, 0,50 g MES, 1,0 g Agar, 1 L DI H2O. einstellen den pH-Wert 5,7 aber die Zugabe von 5 M Kaliumhydroxid während der Überwachung mit einer pH-Elektrode.</li>
	<li>Sterilisieren Sie Samen durch Schütteln sie in 1 % Bleichmittel und SDS zwischen 15 und 30 min., und spülen Sie dann 4 mal mit einem gleichen Volumen Wasser durch Zentrifugation. Sobald die Samen steril sind, legen Sie sie bei 4 ° C bis zu 24 Stunden, 7 Tage für Vernilization. Das Arabidopsis Biological Resource Center beschreibt zusätzliche Methoden der Sterilisation, Vernilization und Wachstum22.</li>
	<li>Fügen Sie Samen auf Medien von hand bei einer Dichte von 0,1 g/100 mL. Diese Dichte führt zu einem Durchschnitt von 3-10 Samen pro Bohrloch einer 96-Well-Platte.</li>
	<li>Ort, von Hand, vier 96-Well-Wohnung-Bodenplatten in Zimmer 1 und 2 des Hotel A (Abbildung 6, Hotel A). Legen Sie eine Schachtel mit AP96 P250 Pipettenspitzen auf der Tipp-Loader-ALP, 300 mL Reservoir gefüllt mit der Medien-Saatgut-Mischung in Schritten erstellte 2,1-2,3 auf P3 und 300 mL Reservoir gefüllt mit 70 % EtOH auf P7 (Abbildung 4, Deck und Abbildung 6 Deck). Hinweis: 2,5 bis 2,8 erfolgen mit der Betriebssoftware.</li>
	<li>Präsentieren Sie Zimmer 1 und 2 im Hotel A zu, und trennen Sie die Stapel von vier Platten. Setzen Sie eine Platte auf jede der leeren statischen Alpen (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 und P12). Laden Sie AP96 P250 Pipettenspitzen auf 96-Kanal 200 µL Kopf.</li>
	<li>Aspirieren 90 µL aus 300 mL Medien-Samen Reservoir auf P3 und verzichten in den ersten 96-Well-Wohnung-Bodenplatte. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle acht Platten der Medien-Saatgut-Mischung enthalten.</li>
	<li>Reinigen der AP96 P250 Pipettenspitzen durch Absaugen und Verzicht auf 70 µL aus dem 300 mL Behälter gefüllt mit 70 % EtOH auf P7. Waschen Sie die Tipps in Multichannel Tipp waschen ALP durch Absaugen und Verzicht auf eine 110 % Volumen Wasser viermal, entladen Sie die Tipps bei TL1 und sammeln Sie die Platten mit der hand.</li>
</ol>3. Hinzufügen von kleinen Molekülen zu Platten Screening
<ol><li>Last, von Hand, eine Schachtel mit AP96 P250 Pipettenspitzen in Zimmer 1 des Hotel A, zwei 96-Well-V-Verdünnung Bibliothek Bodenplatten in Zimmer 2, 4, 6 und 8 und zwei 96 gut flach-Screening Bodenplatten in Zimmer 3, 5, 7 und 9 (Abbildung 4 Stapler und Abbildung 7, Hotel A). Verbinden Sie Schläuche darüber hinaus zum und vom Multichannel Tipp Wash ALP auf den 5-Gallonen-Tank. Hinweis: 3.2 bis 3.10 erfolgen mit der Betriebssoftware.</li>
	<li>Konfigurieren Sie das Deck um 300 mL 70 % EtOH Wash Reservoir an P7 enthalten; Das Medien-Samen Reservoir kann auf dem Deck auf P3 gelassen werden (Abbildung 4, Deck und Abbildung 7, Deck). Darüber hinaus schalten Sie die Konsole Fahrt durch Verbindung von der Gerätesteuerung Wasser durch Multichannel Tipp Wash ALP zirkulieren. Dies schaltet automatisch am Ende des Protokolls.</li>
	<li>Präsentieren Sie die AP96 P250 Pipette Tip Box von Hotel A und verschieben Sie es an der Spitze Loader ALP.</li>
	<li>Präsentieren die 96-Well-V-Verdünnung Bibliothek Bodenplatten aus Zimmer 2 Hotels A Deck und Platz eins auf statische ALP P4 und auf P8. Die 96-Well-Wohnung zu präsentieren-Screening Bodenplatten aus Zimmer 3 Hotel a auf das Deck und legen Sie eine statische ALP P5 und eine auf P9.</li>
	<li>Laden Sie AP96 P250 Pipettenspitzen mit dem Loader Tipp ALP auf den 96-Kanal 200 µL Kopf.</li>
	<li>Mischen die 96-Well-V-Verdünnung Bodenplatte auf P4 durch Absaugen und Verzicht auf 50 µL dreimal. Im Anschluss daran Aspirieren 10 µL von dieser Platte und verzichten in der 96-Well-Wohnung-Screening Bodenplatte auf P5.</li>
	<li>Mischen Sie die Lösungen in die Platte bei P5 Absaugen und 50 µL dreimal. Reinigen der AP96 P250 Pipettenspitzen mit Ethanol durch Absaugen und Verzicht auf 70 µL 70 % EtOH aus dem Reservoir auf P7 und dann waschen Sie die Tipps in Multichannel Tipp Wash ALP durch Absaugen und Verzicht auf ein Volumen von 110 % des Wasser viermal.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.5 und 3.6 für die zweite 96-Well-V-Verdünnung Bibliothek Bodenplatte (P8) und 96-Well-flach-Screening Bodenplatte (P9).</li>
	<li>Stapel die beiden 96-Well V-Verdünnung Bibliothek Bodenplatten zusammen und die beiden 96-Well flache Unterseite Screening Platten zusammen. Verschieben Sie die Platten an statischen Alpen P1, P2, P6, P10, P11, P12 oder P13.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3,4-3,9 dreimal, insgesamt acht Mal Platten Screening verdünnte Chemikalien hinzufügen. Zu guter Letzt überprüfen Sie die Anzahl der Samen in jede Vertiefung der Screening-Platten durch visuelle Konformation und ergänzen Sie diesen Brunnen mit weniger als drei Samen durch zusätzliche sterilisiert und vernalized Samen.</li>
</ol>(4) Inkubation und Visualisierung von Screening-Platten
<ol><li>Inkubieren Sie 96-Well flach-Boden Screening-Platten für vier Tage in einer Klimakammer bei 22 ° C auf einem 16/8 Hell-Dunkel-Zyklus in ein Behältnis Austrocknung. 96-Well flach-Boden Screening-Platten unter dem sezierenden Mikroskop zu visualisieren. Notieren Sie alle abweichende Phänotypen zur weiteren Untersuchung.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll soll Forscher helfen bei der Bewältigung einer vorwärts Chemische Genetik-Bildschirms auf Arabidopsis. Wir bieten repräsentative Ergebnisse von einem Bildschirm von 50.000 Verbindungen (Abbildung 2 und Abbildung 3), einer der größten vorwärts Chemische Genetik Bildschirme auf Arabidopsis9,13,23bisher durchgeführt. Die Verwendung von einem liquid ...

In den vergangenen 20 Jahren haben Forscher auf dem Gebiet der Pflanzenbiologie große Fortschritte mit Hilfe chemischer Genetik Ansätze, sowohl vorwärts als auch rückwärts, gemacht, ein besseres Verständnis der Zellwand Biosynthese, Zellskelett, Hormon-Biosynthese und Signalisierung, Gravitropismus, Pathogenese, Purin-Biosynthese und Endomembrane Handel mit1,2,3,4,5. Einsatz nach vorne Chemische Genetik Techniken ermöglicht die Identifizierung von Phänotypen von Interesse und erlaubt es den Forschern, die genotypischen Grundlagen für bestimmte Prozesse zu verstehen. Im Gegensatz dazu sucht reverse Chemische Genetik Chemikalien, die mit einer vorher festgelegten Protein Ziel6interagieren. Arabidopsis hat an der Spitze dieser Entdeckungen in Pflanzenbiologie, weil sein Genom klein abgebildet und kommentiert. Es hat eine kurze Generationszeit, und es gibt mehrere Mutant/Reporter Zeilen zur Verfügung, um die Identifizierung von aberranten subzelluläre Maschinen7zu erleichtern.
Es gibt zwei große Engpässe, die verlangsamen den Fortschritt der vorwärts chemische genetische Bildschirme, die ersten screening-Prozess und bestimmen das Ziel der Verbindung von Interesse8. Eine große Hilfe bei der Erhöhung der Geschwindigkeit des kleinen Molekül-Auswahl ist die Verwendung von Automatisierung und automatisierte Anlagen9. Liquid Handling-Roboter sind ein hervorragendes Instrument für den Umgang mit großen Bibliotheken von kleinen Molekülen und maßgeblich voran in den biologischen Wissenschaften10gewesen. Die hier vorgestellten Protokoll wurde entwickelt, um den Engpass zugeordneten Screening-Verfahren ermöglicht die Identifizierung von bioaktiven kleine Moleküle mit einer schnellen Rate. zu lindern Diese Technik verringert die Last der Arbeit und Zeit im Auftrag des Betreibers und auch gleichzeitig die wirtschaftliche Kosten für die Prinzip-Ermittler.
Bisher haben die meisten chemische Bibliotheken analysiert zwischen 10.000 und 20.000 Verbindungen, einige mit mehr als 150.000 andere mit nur 709,11,12,13,14, statt. 15 , 16. das Protokoll hier eingeführt wurde auf einer kleinen Molekül-Bibliothek von 50.000 Verbindungen (siehe Tabelle der Materialien) umgesetzt, die größeren vorwärts Chemische Genetik Bildschirme durchgeführt auf Arabidopsis bis heute. Dieses Protokoll passt mit dem aktuellen Trend zu mehr Effizienz und Geschwindigkeit betreffend vorwärts Chemische Genetik, zumal es bezieht sich auf Fungizid, Herbizid Entdeckung, Insektizid Entdeckung entdecken, drug Discovery und Krebsbiologie17 ,18,19,20,21. Obwohl hier mit Arabidopsis implementiert, könnte dieses Protokoll leicht angepasst werden Zellkulturen, Sporen und möglicherweise sogar Insekten im flüssigen Medium innerhalb 96, 384 oder 1536-Well Platten. Aufgrund seiner geringen Größe ist Arabidopsis zugänglicher Screening in 96-well-Platten. Verteilung von Saatgut gleichmäßig auf alle Brunnen ist jedoch eine Herausforderung. Aussaat von Hand genau, aber arbeitsintensiv ist, und zwar gibt es Geräte, die Samen in 96-Well Platten zu verzichten, sie sind teuer in der Anschaffung. Hier zeigen wir, wie dieser Schritt mit nur einem kleinen Verlust an Genauigkeit umgangen werden kann.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode war eine große chemische Bibliothek gegen Arabidopsis mehr überschaubar, ohne Kompromisse bei der Genauigkeit, über die Verwendung von einem liquid Handling-Roboter screening zu machen. Die Verwendung dieser Methode verbessert die Effizienz des Forschers durch verringern den Zeitaufwand für die anfängliche Verdünnung Serie Management und nachfolgenden phänotypischen Bildschirmen ermöglicht schnelle Visualisierung der Proben unter dem sezierenden Mikroskop und schnelle Runden Identifizierung neuer bioaktiver kleiner Moleküle. Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Ergebnisse dieses Protokolls in 4 Schritten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig1.jpg"> Abbildung 1: allgemeine Workflow des Bildschirms nach vorne Chemische Genetik. Einen Überblick über das Protokoll für jedes der 4 wichtigsten Schritte mit einigen Details beschrieben werden. 1: Erhalt der chemischen Bibliothek, 2: die Verdünnung Bibliothek, 3: macht die Screening-Platten und 4: Inkubation und Visualisierung der Screening-Platten. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table><tbody><tr><td>Keyboard</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Used for protocol design and operating the Biomek FX</td></tr><tr><td>Mouse</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Used for protocol design and operating the Biomek FX</td></tr><tr><td>Computer Screen</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Used for protocol design and operating the Biomek FX</td></tr><tr><td>Computer</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Used for protocol design and operating the Biomek FX</td></tr><tr><td>DIVERSet Diverse Screening Library</td><td>ChemBridge</td><td>N/A</td><td>Chemical library</td></tr><tr><td>Biomek Software</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>Runs and designs the Biomek FX</td></tr><tr><td>Device Controller</td><td>Beckman Coulter</td><td>719366</td><td>Operates the water pump/tip washing station</td></tr><tr><td>Stacker Carousel Pendent</td><td>Beckman Coulter</td><td>148240</td><td>Manual operation of Biomek Stacker Carousel</td></tr><tr><td>Biomek Stacker Carousel</td><td>Beckman Coulter</td><td>148520</td><td>Rotary unit that houses all FX Stacker 10&#039;s</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Elevator unit that houses components for screen</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Elevator unit that houses components for screen</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Elevator unit that houses components for screen</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Elevator unit that houses components for screen</td></tr><tr><td>Biomek FX</td><td>Beckman Coulter</td><td>https://www.beckman.com/liquid-handlers</td><td>Robot that performs the desired operations</td></tr><tr><td>Accuframe</td><td>Artisan Technology Group</td><td>76853-4</td><td>Frames arm to place components corretly</td></tr><tr><td>Framing Fixture</td><td>Beckman Coulter</td><td>719415</td><td>Centers arm in the Accuframe</td></tr><tr><td>Multichannel Tip Wash ALP</td><td>Beckman Coulter</td><td>719662</td><td>Washes the tips after the ethanol bath</td></tr><tr><td>Tip Loader ALP</td><td>Beckman Coulter</td><td>719356</td><td>Pneumatically loads tips onto the arm</td></tr><tr><td>Air Compressor</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Provides air for pneumatic tip loading</td></tr><tr><td>MasterFlex Console Drive</td><td>Cole-Parmer</td><td>77200-65</td><td>Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer</td></tr><tr><td>Air Hose</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Provides air from air compressor to Tip Loader</td></tr><tr><td>Water Hose</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer</td></tr><tr><td>Static ALP&#039;s</td><td>Beckman Coulter</td><td>Comes with Biomek FX</td><td>Supports equipment for the Screen</td></tr><tr><td>5 Gallon Reserviour</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Recirculates the dirty water from cleaning the tips</td></tr><tr><td>Grippers</td><td>Beckman Coulter</td><td>Comes with Biomek FX</td><td>Grabs and moves the equipment to the correct places</td></tr><tr><td>96-Channel 200 &amp;micro;L Head</td><td>Beckman Coulter</td><td>Comes with Biomek FX</td><td>Holds the 96 tips used within the screen</td></tr><tr><td>AP96 P200 Pipette Tips</td><td>Beckman Coulter</td><td>717251</td><td>Used to make the screening library</td></tr><tr><td>96 Well Flat Bottom Plate</td><td>Costar</td><td>9018</td><td>Aids in visulization of screen</td></tr><tr><td>96 Well V-Bottom Plate</td><td>Costar</td><td>3897</td><td>Aids in storing of dilution library</td></tr><tr><td>AlumaSeal 96 Sealing Film</td><td>MedSci</td><td>F-96-100</td><td>Seals for storage both the chemicle library and dilution library</td></tr><tr><td>Plastic ziplock sandwich bags</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Used to ensure a humid environment for screen</td></tr><tr><td>AP96 P20 Pipette Tips</td><td>Beckman Coulter</td><td>717254</td><td>Used in the dilution library creation</td></tr><tr><td>Growth Chamber</td><td>Percival</td><td>AR36L3</td><td>Germinates seeds for phenotypic visulization</td></tr><tr><td>Spatula</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly</td></tr><tr><td>Toothpick</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Pushes seeds from spatula to wells</td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal Salt Mixture</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>M524</td><td>Add to MS media mixture</td></tr><tr><td>MES Free Acid Monohydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19483580</td><td>Added to MS media to decrease pH</td></tr><tr><td>Agar Powder</td><td>Alfa Aesar</td><td>9002-18-0</td><td>Increases thickness of media to support seed suspension</td></tr><tr><td>5M KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484016</td><td>Increases pH to adequate levels</td></tr><tr><td>1L Media Storage Bottle</td><td>Corning</td><td>1395-1L</td><td>Holds enough media for a screen</td></tr><tr><td>Polypropylene Centrifuge Tubes</td><td>Corning</td><td>431470</td><td>Sterilizes seeds prior to vernilization</td></tr><tr><td>pH Probe</td><td>Davis Instruments</td><td>YX-58825-26</td><td>Used for making media</td></tr><tr><td>ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987836</td><td>Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX</td></tr><tr><td>Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide</td><td>Beckman Coulter</td><td>609862-AA</td><td>Aids in setting up the Stacker Carousel</td></tr><tr><td>Biomek FX and FX&lt;sup&gt;P&lt;/sup&gt; Laboratory Automation Workstations Users Manual</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987834</td><td>Used to frame the Multichannel Pod</td></tr><tr><td>Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN B32335AB</td><td>Used to aid in setting up the Biomek FX</td></tr><tr><td>Biomek Software User&#039;s Manual</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987835</td><td>Used to set up and understand the Software</td></tr></tbody></table>

optimizing the use of a liquid handling robot to conduct a high throughput forward chemical genetics screen of arabidopsis thaliana

Chemischer Genetik wird zunehmend Züge in Pflanzen zu entschlüsseln, die widerspenstigen zu traditionellen Genetik durch gen-Redundanz oder Letalität möglicherweise eingesetzt. Allerdings ist die Wahrscheinlichkeit eines synthetischen kleinen Moleküls als bioaktive gering; Daher müssen Tausende von Molekülen getestet werden, um diejenigen von Interesse finden. Liquid handling Roboter Systeme sind entworfen, um große Anzahl von Proben, die Erhöhung der Geschwindigkeit, mit der eine chemische Bibliothek untersucht werden kann, zusätzlich minimieren/Standardisierung Fehler, zu behandeln. Erreichung einen Hochdurchsatz-vorwärts Chemische Genetik-Bildschirm aus einer Bibliothek von 50.000 kleine Moleküle auf Arabidopsis Thaliana (Arabidopsis), Protokolle mit einer Benchtop-Mehrkanal-Flüssigkeit handling-Roboter entwickelt, die minimale erfordern Techniker-Beteiligung. Mit diesen Protokollen wurden 3.271 kleine Moleküle entdeckt, dass sichtbare phänotypische Veränderungen verursacht. 1.563 Verbindungen induziert kurze Wurzeln, 1.148 Verbindungen verändert Färbung, 383 Verbindungen verursacht Wurzelhaare und andere, nicht kategorisiert, Änderungen und 177 Verbindungen gehemmt Keimung.

Die Fähigkeit, genau und effizient charakterisieren Phänotypen basierend auf die Zugabe von kleinen Molekülen bei screening-Konzentrationen unter dem sezierenden Mikroskop ist das Endziel dieser Methode der vorwärts Chemische Genetik auf Arabidopsis. Die Phänotypen beobachtet, wenn alle 50.000 Verbindungen gezeigt hatte war vielfältig und kann in mehrere unterschiedliche Klassen (Abbildung 2) aufgeteilt werden. Abbildung 3A...

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Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Optimierung der Nutzung eines Liquid Handling Roboters, einen hohen Durchsatz nach vorn Chemische Genetik Bildschirm von Arabidopsis Thaliana durchzuführen

Ein hoher Durchsatz-Bildschirm synthetische kleiner Moleküle wurde auf der Modell-Pflanzenart Arabidopsis Thalianadurchgeführt. Dieses Protokoll, entwickelt für eine liquid Handling-Roboter, erhöht die Geschwindigkeit des vorwärts Chemische Genetik Bildschirme, die Entdeckung der neuartigen kleine Moleküle, die Auswirkungen auf die Physiologie der Pflanzen zu beschleunigen.

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

optimizing-use-liquid-handling-robot-to-conduct-high-throughput

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

6.7K Aufrufe.  University of Kentucky. Ein hoher Durchsatz-Bildschirm synthetische kleiner Moleküle wurde auf der Modell-Pflanzenart Arabidopsis Thalianadurchgeführt. Dieses Protokoll, entwickelt für eine liquid Handling-Roboter, erhöht die Geschwindigkeit des vorwärts Chemische Genetik Bildschirme, die Entdeckung der neuartigen kleine Moleküle, die Auswirkungen auf die Physiologie der Pflanzen zu beschleunigen.

Serie: Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Forschung

Genetik

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Biochemie

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Skalierbare High Throughput Auswahl aus Phagen-Antikörperbibliotheken angezeigt Synthetische

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Immunologie und Infektion

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatisierte Roboter Liquid Handling Versammlung Modular DNA-Geräte

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Biotechnik

Hochdurchsatz-Screening für die Proteinkristallisation

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into an ordered lattice amenable to diffraction remains challenging. The crystallization of biomolecules is largely experimentally defined, and this process can be labor-intensive and prohibitive to researchers at resource-limited institutions. At the National High-Throughput Crystallization (HTX) Center, highly reproducible methods have been implemented to facilitate crystal growth, including an automated high-throughput 1,536-well microbatch-under-oil plate setup designed to sample a wide breadth of crystallization parameters. Plates are monitored using state-of-the-art imaging modalities over the course of 6 weeks to provide insight into crystal growth, as well as to accurately distinguish valuable crystal hits. Furthermore, the implementation of a trained artificial intelligence scoring algorithm for identifying crystal hits, coupled with an open-source, user-friendly interface for viewing experimental images, streamlines the process of analyzing crystal growth images. Here, the key procedures and instrumentation are described for the preparation of the cocktails and crystallization plates, imaging the plates, and identifying hits in a way that ensures reproducibility and increases the likelihood of successful crystallization.

Autor im Rampenlicht: Hochdurchsatz-Screening zur Gewinnung von Kristalltreffern für die Proteinkristallographie  

This protocol details high-throughput crystallization screening, ranging from the 1,536 microassay plate preparation to the end of a 6 week experimental time window. Details are included about the sample setup, the imaging obtained, and how users can perform analyses using an artificial intelligence-enabled graphical user interface to quickly and efficiently identify macromolecular crystallization conditions.

Hochdurchsatz-Screening zur Gewinnung von Kristalltreffern für die Proteinkristallographie

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of bioprocess conditions. One important aspect is the improvement of cultivation medium to provide an optimal environment for microbial formation of the product of interest. It is well accepted that the media composition can dramatically influence overall bioprocess performance. Nutrition medium optimization is known to improve recombinant protein production with microbial systems and thus, this is a rewarding step in bioprocess development. However, very often standard media recipes are taken from literature, since tailor-made design of the cultivation medium is a tedious task that demands microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, fast product analytics, as well as support by lab robotics to enable reliability in liquid handling steps. Furthermore, advanced mathematical methods are required for rationally analyzing measurement data and efficiently designing parallel experiments such as to achieve optimal information content.
The generic nature of the presented protocol allows for easy adaption to different lab equipment, other expression hosts, and target proteins of interest, as well as further bioprocess parameters. Moreover, other optimization objectives like protein production rate, specific yield, or product quality can be chosen to fit the scope of other optimization studies. The applied Kriging Toolbox (KriKit) is a general tool for Design of Experiments (DOE) that contributes to improved holistic bioprocess optimization. It also supports multi-objective optimization which can be important in optimizing both upstream and downstream processes.

This manuscript describes a generic approach for tailor-made design of microbial cultivation media. This is enabled by an iterative workflow combining Kriging-based experimental design and microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, which is supported by lab robotics to increase reliability and speed in liquid handling media preparation.

Generischen Protokoll zur Optimierung der heterologen Proteinproduktion mit automatisierten Microbioreactor Technologie

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine ​​Venom Produziert in Applied<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Biologie

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Optimierung der Nutzung eines Liquid Handling Roboters, einen hohen Durchsatz nach vorn Chemische Genetik Bildschirm von Arabidopsis Thaliana durchzuführen

Zusammenfassung

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Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Skalierbare High Throughput Auswahl aus Phagen-Antikörperbibliotheken angezeigt Synthetische

Automatisierte Roboter Liquid Handling Versammlung Modular DNA-Geräte

Hochdurchsatz-Screening zur Gewinnung von Kristalltreffern für die Proteinkristallographie

Hochdurchsatz-Screening zur Gewinnung von Kristalltreffern für die Proteinkristallographie

Generischen Protokoll zur Optimierung der heterologen Proteinproduktion mit automatisierten Microbioreactor Technologie

Hochdurchsatz-Screening zur Gewinnung von Kristalltreffern für die Proteinkristallographie

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine Venom Produziert in Applied

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

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Hochdurchsatz-Screening zur Gewinnung von Kristalltreffern für die Proteinkristallographie

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Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine Venom Produziert in Applied