Name: optimizing the use of a liquid handling robot to conduct a high throughput forward chemical genetics screen of arabidopsis thaliana
Uploaded: 2018-04-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Ringraziamo Jozsef cicogna, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue e Andrea Sanchez per la discussione costruttiva e critica. Dr. Sharyn Perry per le fotografie fenotipiche. Questo materiale si basa su lavori sostenuta dalla National Science Foundation sotto cooperativa contratto n. 1355438.

1. creazione di una libreria di diluizione
<ol><li>Etichetta 625 piastre di diluizione biblioteca a mano, garantendo che essi corrispondono alla loro piastra corrispondente dalla biblioteca chimica. Inoltre, connettersi in flusso e out tubi di flusso per il multicanale suggerimento lavaggio automatizzato Labware posizionatore (ALP) passando attraverso l'unità di Console per il serbatoio da 5 galloni (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Accedere al computer e accendere la pompa di lavaggio attraverso la connessione del Controller del dispositivo per il multicanale suggerimento Wash ALP al fine di far circolare l'acqua. Questo si spegne automaticamente alla fine del protocollo.</li>
	<li>Carico, a mano, il 10 di Stacker fissato al carosello Stacker, nel seguente ordine in Alberghi A - D (Figura 4, Stacker); una scatola di AP96 P20 puntali in camera 1, quattro V 96 pozzetti-piastre di fondo in camere a 2-5 con le due piastre superiore contenenti concentrazioni d'archivio dalla libreria di ordinato e le due piastre inferiore vuoto (Figura 5, impilatore). Inoltre, caricare una scatola di AP96 P20 puntali in camera 6 e quattro 96 pozzetti V-piastre inferiori nelle camere: 7-9 con le due piastre superiore contenenti concentrazioni d'archivio della biblioteca ordinata e le due piastre inferiore vuoto (Figura 5, impilatore).</li>
	<li>Istituire, a mano, il ponte con un serbatoio di acqua 300 mL su P3, un 300 mL 70% EtOH bagno il P7, suggerimento Loader ALP (TL1) e multicanale suggerimento Wash ALP (TW1) (Figura 4, Deck e Figura 5, ponte).</li>
	<li>Utilizzando il software operativo, presentare AP96 P20 puntali da 10 Stacker e spostarli all'Alpe Loader Tip. Nota: 1.5 tramite 1.12 tutte sono fatte con il liquido gestione software operativo del robot; Vedi Tabella materiali.</li>
	<li>Presentiamo 2 camera da Hotel A e separare tutti i quattro 96 pozzetti V-fondo piastre sul ponte, mettendo sul fondo due su P4 e P8 e le prime due su P5 e P9 (Figura 4).</li>
	<li>Caricare AP96 P20 puntali con il caricatore di punta ALP sulla testa con 96 canali a 200 µ l. 90 µ l del serbatoio di acqua di 300 mL di aspirare e dispensare al v 96-Well-piastra di diluizione inferiore su P4. Ripetere questo passaggio per la piastra su P8.</li>
	<li>Mescolare la piastra libreria chimica su P5 ripetutamente aspirazione e il dosaggio 15 µ l tre volte. Inoltre, aspirare 10 µ l dalla cassa della libreria chimica su P5 e Pipettare 10 µ l nella piastra diluizione su P4.</li>
	<li>Mescolare le soluzioni della piastra sul P4 da ripetutamente aspirazione e il dosaggio 50 µ l di un totale di tre volte. Una volta miscelato, pulire le punte di pipetta P20 AP96 di aspirazione e il dosaggio di 70 µ l di 70% EtOH da P7, poi lavarli in multicanale suggerimento Wash Alpe di aspirazione e il dosaggio di un 110% del volume di acqua quattro volte.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 1.8-1.9 per la seconda coppia di piastre su P8 e P9. Al momento di creare il secondo V 96-Well-piastra inferiore diluizione, stack le piastre nel seguente ordine dal basso verso l'alto: P4, P5, P8 e P9. Quindi, posizionare la risma un vuoto statico ALP; P1, P2, P6, P10, P11, P12 o P13.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 1.6-1.10 5 camera in Hotel A è vuoto. Ripetere il passaggio 1.5 su raggiungendo la camera 6, spostando nuovo AP96 P20 puntali all'Alpe Loader Tip e mettendo i puntali per pipette usate AP96 P20 su un vuoto statico ALP.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 1.6-1.10 9 camera di Hotel A è vuoto. Tuttavia, al fine di procedere all'Hotel B, le piastre e suggerimenti sul ponte devono essere ricaricati in a Hotel.</li>
	<li>A mano, ri-riempire il serbatoio di acqua di 300 mL. Questo passaggio è cruciale, e il programma del computer può incorporare una pausa dettagliare questo messaggio, che richiede l'utente a premere 'continua', prima di eseguire il passaggio successivo.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 1.5-1.13 per i rimanenti Hotel, garantendo un serbatoio dell'acqua pieno 300 mL ogni volta prima di procedere all'hotel successivo.</li>
</ol>2. aggiunta di miscela di Media-semi per piastre di Screening
<ol><li>Fare ½ Murashige e Skoog (MS) Media con 0,1% Agar con l'aggiunta di 4,3 g MS Salts, 0,50 g MES, 1,0 g Agar a 1 L DI H2O. regolare il pH a 5.7 però l'aggiunta di 5 M di idrossido di potassio durante il monitoraggio con una sonda di pH.</li>
	<li>Sterilizzare i semi agitando in 1% candeggina e SDS tra 15 e 30 min e poi lavare 4 volte con un volume uguale di acqua mediante centrifugazione. Una volta che i semi sono sterili, metterli a 4 ° C da 24 ore a 7 giorni per vernilization. Il centro di risorse biologiche di Arabidopsis descrive ulteriori metodi di sterilizzazione, vernilization e crescita22.</li>
	<li>Aggiungere i semi ai media a mano ad una densità di 0,1 g/100 mL. Questa densità si traduce in una media di 3-10 semi per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.</li>
	<li>Luogo, a mano, quattro 96 pozzetti piatto-piastre di fondo in camere 1 e 2 di Hotel A (Figura 6, A Hotel). Inserire una casella di AP96 P250 puntali sull'Alpe Loader Tip, un serbatoio 300ml riempito con la miscela di semi di media creata nei passaggi da 2.1-2.3 in P3 e un serbatoio 300 mL riempita con 70% EtOH sul P7 (Figura 4, Deck e Figura 6 Ponte). Nota: 2.5 tramite 2.8 sono fatto con il software operativo.</li>
	<li>Presentare le camere 1 e 2 in Hotel A e separare le pile di quattro piastre. Posizionare una piastra su ciascuna delle Alpi vuoto statico (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 e P12). Caricare AP96 P250 puntali sulla testa con 96 canali a 200 µ l.</li>
	<li>90 µ l dal serbatoio 300ml media-seme su P3 di aspirare e dispensare nel primo appartamento di 96 pozzetti-piastra inferiore. Ripetere questo processo fino a quando tutte le otto tavole contengono la miscela di semi di media.</li>
	<li>Pulizia delle punte di pipetta P250 AP96 di aspirazione e il dosaggio di 70 µ l dal serbatoio 300 mL riempito con 70% EtOH sul P7. Lavare le punte in multicanale suggerimento lavare Alpe di aspirazione e il dosaggio di un 110% del volume di acqua quattro volte, scaricare le punte presso TL1 e raccogliere i piatti a mano.</li>
</ol>3. aggiunta di piccole molecole per piastre di Screening
<ol><li>Carico, a mano, una scatola di AP96 P250 puntali in 1 camera di Hotel A, due V 96 pozzetti-piastre inferiori del libreria di diluizione in camere da 2, 4, 6 e 8 e due 96 ben piatto-Screening piastre inferiori in camere 3, 5, 7 e 9 (Figura 4 Fascicolatore e Figura 7, un Hotel). Inoltre, collegare i tubi flessibili da e verso l'Alpe di Wash suggerimento multicanale per il serbatoio da 5 galloni. Nota: 3.2 al 3.10 sono fatto con il software operativo.</li>
	<li>Configurare il mazzo per contenere un serbatoio di lavaggio 300 mL 70% EtOH presso P7; il serbatoio di media-seme può essere lasciato sul ponte a P3 (Figura 4, Deck e Figura 7, ponte). Inoltre, accendere l'unità di Console tramite connessione del dispositivo Controller per far circolare l'acqua attraverso l'Alpe Wash suggerimento multicanale. Questo si spegne automaticamente alla fine del protocollo.</li>
	<li>Presentiamo la scatola di Tip pipetta AP96 P250 da Hotel A e spostarlo all'Alpe Loader Tip.</li>
	<li>Presentare il V 96 pozzetti-piastre di diluizione biblioteca inferiori da 2 camera di Hotel al ponte e posto uno statico ALP P4 e uno su P8. Presentare il piatto di 96 pozzetti-piastre di Screening di fondo da camera 3 di Hotel al ponte e posizionare uno statico ALP P5 e uno su P9.</li>
	<li>Caricare AP96 P250 puntali con il caricatore di punta ALP sulla testa con 96 canali a 200 µ l.</li>
	<li>Mescolare il V 96-Well-piastra di diluizione inferiore su P4 di aspirazione e il dosaggio 50 µ l tre volte. In seguito, aspirare 10 µ l da questo piatto e versare nel piatto 96-Well-piastra di Screening inferiore su P5.</li>
	<li>Mescolare le soluzioni nella piastra a P5 di aspirazione e il dosaggio 50 µ l tre volte. Pulire le punte di pipetta AP96 P250 con etanolo di aspirazione e il dosaggio di 70 µ l di 70% EtOH dal serbatoio a P7 e poi lavare i suggerimenti in multicanale suggerimento Wash Alpe di aspirazione e il dosaggio di un 110% del volume di acqua quattro volte.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 3.5 e 3.6 per il secondo V 96-Well-piastra di fondo diluizione biblioteca (P8) e 96 pozzetti piatto-piastra inferiore Screening (P9).</li>
	<li>Stack due 96 pozzetti V-piastre di diluizione biblioteca inferiori insieme e le due piastre di fondo Screening 96 pozzetti piatto insieme. Spostare le piastre statico Alpi P1, P2, P6, P10, P11, P12 o P13.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 3.4-3.9 tre volte, l'aggiunta di prodotti chimici diluiti allo screening piatti un totale di otto volte. Infine, controllare il numero di semi in ciascun pozzetto delle piastre di screening attraverso visual conformazione e integrare tali pozzetti con meno di tre semi per ulteriori seme vernalizzato e sterilizzato.</li>
</ol>4. incubazione e visualizzazione delle piastre di Screening
<ol><li>Incubare le piastre a 96 pozzetti a fondo piatto di Screening per quattro giorni in una camera climatica a 22 ° C su un ciclo luce/buio di 16/8 in un contenitore di prova di essiccazione. Visualizzare le piastre da 96 pozzetti a fondo piatto Vagli sotto un microscopio per dissezione. Registrare tutti i fenotipi aberranti per ulteriori indagini.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Blackwell, H. E., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+approaches+to+plant+biology.">Chemical genetic approaches to plant biology.</a> Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).</li><li>Dejonghe, W., Russinova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+chemical+genetics:+From+phenotype-based+screens+to+synthetic+biology.">Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology.</a> Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).</li><li>McCourt, P., Desveaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+chemical+genetics.">Plant chemical genetics.</a> New Phytol. 185 (1), 15-26 (2010).</li><li>Lumba, S., Cutler, S., McCourt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+nuclear+hormone+receptors:+A+role+for+small+molecules+in+protein-protein+interactions.">Plant nuclear hormone receptors: A role for small molecules in protein-protein interactions.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 445-469 (2010).</li><li>Hicks, G. R., Raikhel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+plant+chemical+biology.">Opportunities and challenges in plant chemical biology.</a> Nat Chem Biol. 5 (5), 268-272 (2009).</li><li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+root+cap+in+root+branching+revealed+by+the+non-auxin+probe+naxillin.">A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin.</a> Nat Chem Biol. 8 (9), 798-805 (2012).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>Serrano, M., Kombrink, E., Meesters, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+designing+chemical+screening+strategies+in+plant+biology.">Considerations for designing chemical screening strategies in plant biology.</a> Front Plant Sci. 6, 131 (2015).</li><li>Yoshitani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structure-based+strategy+for+discovery+of+small+ligands+binding+to+functionally+unknown+proteins:+Combination+of+in+silico+screening+and+surface+plasmon+resonance+measurements.">A structure-based strategy for discovery of small ligands binding to functionally unknown proteins: Combination of in silico screening and surface plasmon resonance measurements.</a> Proteomics. 5 (6), 1472-1480 (2005).</li><li>Macarron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+high-throughput+screening+in+biomedical+research.">Impact of high-throughput screening in biomedical research.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).</li><li>DeBolt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morlin,+an+inhibitor+of+cortical+microtubule+dynamics+and+cellulose+synthase+movement.">Morlin, an inhibitor of cortical microtubule dynamics and cellulose synthase movement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5854-5859 (2007).</li><li>Christian, M., Hannah, W. B., Luthen, H., Jones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+auxins+by+a+chemical+genomics+approach.">Identification of auxins by a chemical genomics approach.</a> J Exp Bot. 59 (10), 2757-2767 (2008).</li><li>Drakakaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clusters+of+bioactive+compounds+target+dynamic+endomembrane+networks+in+vivo.">Clusters of bioactive compounds target dynamic endomembrane networks in vivo.</a> PNAS. 108 (43), 17850-17855 (2011).</li><li>Armstrong, J. I., Yuan, S., Dale, J. M., Tanner, V. N., Theologis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+inhibitors+of+auxin+transcriptional+activation+by+means+of+chemical+genetics+in+Arabidopsis.">Identification of inhibitors of auxin transcriptional activation by means of chemical genetics in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14978-14983 (2004).</li><li>Brown, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+with+differential+effects+on+the+PTS1+and+PTS2+peroxisome+matrix+import+pathways.">A small molecule with differential effects on the PTS1 and PTS2 peroxisome matrix import pathways.</a> Plant J. 65 (6), 980-990 (2011).</li><li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+inhibition+of+a+subset+of+Arabidopsis+thaliana+GSK3-like+kinases+activates+brassinosteroid+signaling.">Chemical inhibition of a subset of Arabidopsis thaliana GSK3-like kinases activates brassinosteroid signaling.</a> Chem Biol. 16 (6), 594-604 (2009).</li><li>Arkin, M. R., Tang, Y., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions:+progressing+toward+the+reality.">Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing toward the reality.</a> Chem Biol. 21 (9), 1102-1114 (2014).</li><li>St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+chemical+genetics+in+yeast+for+discovery+of+chemical+probes+targeting+metabolism.">Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism.</a> Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).</li><li>Vassilev, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+activation+of+the+p53+pathway+by+small-molecule+antagonists+of+MDM2.">In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2.</a> Science. 303 (5659), 844-848 (2004).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+interrogation+of+natural+variation+uncovers+a+molecule+that+is+glycoactivated.">Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated.</a> Nat Chem Biol. 3 (11), 716-721 (2007).</li><li>Walsh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+field+of+chemical+genetics:+Potential+applications+for+pesticide+discovery.">The emerging field of chemical genetics: Potential applications for pesticide discovery.</a> Pest Manag Sci. 63 (12), 1165-1171 (2007).</li><li>. Seed Handling Available from: <a target="_blank" href="https://abrc.osu.edu/seed-handling">https://abrc.osu.edu/seed-handling</a> (2013)</li><li>Knoth, C., Salus, M. S., Girke, T., Eulgem, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthetic+elicitor+3,5-dichloroanthranilic+acid+induces+NPR1-dependent+and+NPR1-independent+mechanisms+of+disease+resistance+in+Arabidopsis.">The synthetic elicitor 3,5-dichloroanthranilic acid induces NPR1-dependent and NPR1-independent mechanisms of disease resistance in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 150 (1), 333-347 (2009).</li><li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+96-well+Plate+based+iPSC+culture+and+production+using+a+robotic+liquid+handling+system.">Scalable 96-well Plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system.</a> J Vis Exp. , (2015).</li><li>Daniszewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+cell+culture+systems+and+their+applications+to+human+pluripotent+stem+cell+studies.">Automated cell culture systems and their applications to human pluripotent stem cell studies.</a> SLAS Technol. , (2017).</li><li>Popa-Burke, I., Russell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound+precipitation+in+high-concentration+DMSO+solutions.">Compound precipitation in high-concentration DMSO solutions.</a> J Biomol Screen. 19 (9), 1302-1308 (2014).</li><li>Partridge, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+high-throughput+system+for+phenotypic+screening+of+chemical+libraries+on+C.+elegans+and+parasitic+nematodes.">An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2017).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Questo protocollo è progettato per aiutare i ricercatori nella realizzazione di uno schermo in avanti genetica chimica su Arabidopsis. Forniamo risultati rappresentativi da uno schermo di 50.000 composti (Figura 2 e Figura 3), uno dei più grandi schermi avanti genetica chimica eseguita su Arabidopsis ad oggi9,13,23. L'utilizzo di un robot di manipolazione dei liquidi permesso più efficiente diluizione biblioteca e generazione della libreria di screening, migliorando la velocità e l'efficienza dell'identificazione di nuovi composti. Aumentando la capacità di schermo in una natura di alta velocità di trasmissione è stata accompagnata da diminuzione del lavoro per conto del ricercatore. Questa tecnica è stata progettata per essere utilizzato con piastre da 96 pozzetti, che possono ospitare piccoli semi o piante visibili sotto un microscopio per dissezione. Utilizzando piastre con pozzetti più grandi per adattarsi più grandi semi richiederebbe modifiche alla velocità effettiva e al design.
Ulteriori limitazioni di questa tecnica includono la difficoltà di utilizzo di questo pezzo di equipaggiamento con tecniche asettiche; Tuttavia, non abbiamo incontrato alte percentuali di contaminazione dovuto ½ MS media privo di saccarosio. Uno potrebbe aggirare qualsiasi problema di contaminazione inserendo il robot in una camera sterile, permettendo per condizioni sterili e coltura delle cellule, o utilizzando un robot di manipolazione dei liquidi con una camera sterile24,25. Un'altra limitazione è formato di punta e l'aspirazione di seme. Un puntale piccolo come il P20 AP96 sarebbe intasare con semi; Pertanto, un puntale più grande deve essere utilizzato per la semina e la soluzione di miscelazione.
Fasi critiche all'interno di questo protocollo includono l'etichettatura attenta di tutte le piastre nella diluizione libreria e biblioteca di screening, siano l'orientamento corretto insieme con ordine corretto quando si alimenta il robot. Chiara etichettatura e dall'elaborazione sistematica è semplice e può superare questo problema. Un altro passo fondamentale è garantire che l'attrezzatura giusta sia nella posizione corretta prima di iniziare l'esperimento, sia entro i 10 di Stacker e sul ponte. Se l'apparecchiatura non è correttamente posizionato sul ponte, il 96-canale 200 µ l testa potrebbe crashare, danneggiando lo strumento e che richiedono manutenzione. Un altro passo fondamentale è garantire che la corretta quantità di liquido è collocata all'interno dei serbatoi di 300 mL e che tale importo è inserito correttamente nel software. Se i numeri non corrispondono, le punte non raggiungerà il liquido e di aspirazione non si verificherà.
Inoltre è necessario adottare misure per assicurare che i risultati ottenuti siano accurati. Un errore che abbiamo notato durante lo sviluppo del protocollo è stato collegato per suggerimento di vita. Dopo successivo carico e scarico, le punte perdono la capacità di aspirare e dispensare con precisione. È quindi imperativo che ogni set di 96 punte viene utilizzato un massimo di quattro volte. Inoltre è importante cambiare l'acqua di lavaggio regolarmente, per evitare il potenziale per i prodotti chimici inavvertitamente aggiunta a piastre di screening. Infine, alcune sostanze chimiche hanno la tendenza a precipitare fuori soluzione26. Per garantire che ogni prodotto chimico viene aggiunto alla concentrazione corretta, miscelazione passaggi sono incorporate in diluizione e protocollo di screening. Mescolare potrebbe comportare in basse quantità di sostanze chimiche viene aggiunto da libreria a libreria, stimolante interpretazione del potenziale chimico indotto fenotipi.
Utilizzando le piastre corrette per ogni parte del protocollo è anche molto importante. Piastre di fondo V sono progettate per assicurare che i piccoli volumi di liquido possono essere aspirati e sono raccomandati per l'uso nella creazione della libreria di diluizione. Tuttavia, queste piastre non sono adatte per la parte di proiezione del protocollo, poiché loro riflessione della luce porta alla visualizzazione difficile dei fenotipi. Al fine di osservare i fenotipi di 3-4 giorno vecchi piantine, lo schermo deve avvenire nelle piastre di fondo piatto.
Dopo avere create le piastre di screening, la visualizzazione è richiesto. piastre a 96 pozzetti a fondo piatto permettono la facile visualizzazione sotto microscopi di dissezione. È imperativo che le piastre sono memorizzate in contenitori a prova di essiccazione per ridurre l'evaporazione dei media. Un'alternativa alla visualizzazione microscopica è utilizzando uno scanner ad alta risoluzione. Immagini prodotte ad alta risoluzione rivelano la maggior parte dei fenotipi osservati in questa schermata e forniscono un archivio dei risultati che può essere rivisitato in futuro. Una volta che la visualizzazione è completa, e la biblioteca di vostra scelta proiettato, questo metodo potrebbe quindi essere eseguito su diversi organismi o con un'altra libreria chimica. Modifiche all'apparecchiatura potrebbero consentire per coltura sterile, permettendo ventures nei regni di cellule staminali, funghi, insetti e piante piccole2,18,25,27.

Negli ultimi 20 anni i ricercatori nel campo della biologia vegetale hanno compiuto grandi progressi utilizzando approcci di genetica chimica, sia avanti e indietro, migliorando la nostra comprensione della biosintesi della parete cellulare, il citoscheletro, la biosintesi dell'ormone e di segnalazione, gravitropismo, patogenesi, biosintesi delle purine ed endomembrane traffico1,2,3,4,5. L'impiego di tecniche di genetica chimica in avanti permettendo l'identificazione di fenotipi di interesse e permette ai ricercatori di capire i fondamenti genotipici di particolari processi. Al contrario, genetica chimica inversa Cerca prodotti chimici che interagiscono con un pre-determinata proteina bersaglio6. Arabidopsis è stato all'avanguardia di queste scoperte in biologia vegetale, perché il suo genoma è piccolo, mappato e annotati. Ha un tempo di generazione breve, e sono presenti più righe di mutante/reporter disponibili per facilitare l'identificazione di macchinari subcellulare aberrante7.
Ci sono due principali colli di bottiglia che rallentano i progressi degli schermi genetici chimici in avanti, l'iniziale processo di screening e determinare l'obiettivo del composto di interesse8. Un aiuto importante nell'aumentare la velocità di selezione piccola molecola è l'uso di apparecchiatura automatizzata9e automazione. Robot di manipolazione dei liquidi sono un ottimo strumento per la gestione delle grandi biblioteche di piccole molecole e hanno contribuito a guidare il progresso nelle scienze biologiche10. Il protocollo qui presentato è stato progettato per alleviare il collo di bottiglia associato con il processo di screening, che consentano l'identificazione di piccole molecole bioattive a ritmo veloce. Questa tecnica riduce il carico di lavoro e il tempo per conto dell'operatore, anche diminuendo il costo economico per il ricercatore di principio.
Finora, le librerie più chimiche analizzate hanno tenuto tra 10.000 e 20.000 composti, alcuni con oltre 150.000 ed alcuni con minor come 709,11,12,13,14, 15 , 16. il protocollo introdotto nel presente documento è stato implementato su una libreria piccola molecola di 50.000 composti (Vedi Tabella materiali), uno della più grande genetica chimica avanti schermi condotti su Arabidopsis fino ad oggi. Questo protocollo si adatta con l'attuale tendenza verso una maggiore efficienza e velocità per quanto riguarda la genetica chimica in avanti, soprattutto per quanto riguarda erbicida scoperta, scoperta di insetticida, fungicida scoprire, drug discovery e biologia del cancro17 ,18,19,20,21. Anche se qui implementato con Arabidopsis, questo protocollo, potrebbe facilmente essere adattato alle colture cellulari, spore e potenzialmente anche gli insetti in mezzo liquido all'interno di 96, 384- o 1536 pozzetti. Grazie alle sue piccole dimensioni, Arabidopsis è favorevole alla proiezione a 96 pozzetti. Tuttavia, distribuendo uniformemente tra pozzi è una sfida. Mano il seeding è accurata, ma ad alta intensità di manodopera, e anche se ci sono dispositivi progettati per erogare semi in piastre da 96 pozzetti, essi sono costosi da acquistare. Qui, ci mostrano come questo passaggio può essere aggirato con solo una piccola perdita in precisione.
L'obiettivo generale di questo metodo era per fare lo screening di una grande biblioteca chimica contro Arabidopsis più gestibile, senza compromettere la precisione, tramite l'utilizzo di un robot di manipolazione dei liquidi. L'utilizzo di questo metodo migliora l'efficienza del ricercatore di diminuire il tempo necessario per completare la gestione di serie di diluizione iniziale e schermate successive fenotipiche, consentendo una visualizzazione rapida dei campioni sotto un microscopio per dissezione e rapida identificazione di nuove piccole molecole bioattive. Figura 1 illustra i risultati chiave di questo protocollo in 4 passi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig1.jpg"> Figura 1: flusso di lavoro complessivo dello schermo in avanti genetica chimica. Una panoramica del protocollo per essere descritto con qualche dettaglio per ciascuno dei 4 passaggi chiave. 1: ricevendo la biblioteca chimica, 2: rendere la libreria di diluizione, 3: rendendo le piastre di Screening e 4: incubazione e visualizzare le piastre di Screening. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Keyboard</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Used for protocol design and operating the Biomek FX</td></tr><tr><td>Mouse</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Used for protocol design and operating the Biomek FX</td></tr><tr><td>Computer Screen</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Used for protocol design and operating the Biomek FX</td></tr><tr><td>Computer</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Used for protocol design and operating the Biomek FX</td></tr><tr><td>DIVERSet Diverse Screening Library</td><td>ChemBridge</td><td>N/A</td><td>Chemical library</td></tr><tr><td>Biomek Software</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>Runs and designs the Biomek FX</td></tr><tr><td>Device Controller</td><td>Beckman Coulter</td><td>719366</td><td>Operates the water pump/tip washing station</td></tr><tr><td>Stacker Carousel Pendent</td><td>Beckman Coulter</td><td>148240</td><td>Manual operation of Biomek Stacker Carousel</td></tr><tr><td>Biomek Stacker Carousel</td><td>Beckman Coulter</td><td>148520</td><td>Rotary unit that houses all FX Stacker 10&#039;s</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Elevator unit that houses components for screen</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Elevator unit that houses components for screen</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Elevator unit that houses components for screen</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Elevator unit that houses components for screen</td></tr><tr><td>Biomek FX</td><td>Beckman Coulter</td><td>https://www.beckman.com/liquid-handlers</td><td>Robot that performs the desired operations</td></tr><tr><td>Accuframe</td><td>Artisan Technology Group</td><td>76853-4</td><td>Frames arm to place components corretly</td></tr><tr><td>Framing Fixture</td><td>Beckman Coulter</td><td>719415</td><td>Centers arm in the Accuframe</td></tr><tr><td>Multichannel Tip Wash ALP</td><td>Beckman Coulter</td><td>719662</td><td>Washes the tips after the ethanol bath</td></tr><tr><td>Tip Loader ALP</td><td>Beckman Coulter</td><td>719356</td><td>Pneumatically loads tips onto the arm</td></tr><tr><td>Air Compressor</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Provides air for pneumatic tip loading</td></tr><tr><td>MasterFlex Console Drive</td><td>Cole-Parmer</td><td>77200-65</td><td>Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer</td></tr><tr><td>Air Hose</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Provides air from air compressor to Tip Loader</td></tr><tr><td>Water Hose</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer</td></tr><tr><td>Static ALP&#039;s</td><td>Beckman Coulter</td><td>Comes with Biomek FX</td><td>Supports equipment for the Screen</td></tr><tr><td>5 Gallon Reserviour</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Recirculates the dirty water from cleaning the tips</td></tr><tr><td>Grippers</td><td>Beckman Coulter</td><td>Comes with Biomek FX</td><td>Grabs and moves the equipment to the correct places</td></tr><tr><td>96-Channel 200 &amp;micro;L Head</td><td>Beckman Coulter</td><td>Comes with Biomek FX</td><td>Holds the 96 tips used within the screen</td></tr><tr><td>AP96 P200 Pipette Tips</td><td>Beckman Coulter</td><td>717251</td><td>Used to make the screening library</td></tr><tr><td>96 Well Flat Bottom Plate</td><td>Costar</td><td>9018</td><td>Aids in visulization of screen</td></tr><tr><td>96 Well V-Bottom Plate</td><td>Costar</td><td>3897</td><td>Aids in storing of dilution library</td></tr><tr><td>AlumaSeal 96 Sealing Film</td><td>MedSci</td><td>F-96-100</td><td>Seals for storage both the chemicle library and dilution library</td></tr><tr><td>Plastic ziplock sandwich bags</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Used to ensure a humid environment for screen</td></tr><tr><td>AP96 P20 Pipette Tips</td><td>Beckman Coulter</td><td>717254</td><td>Used in the dilution library creation</td></tr><tr><td>Growth Chamber</td><td>Percival</td><td>AR36L3</td><td>Germinates seeds for phenotypic visulization</td></tr><tr><td>Spatula</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly</td></tr><tr><td>Toothpick</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Pushes seeds from spatula to wells</td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal Salt Mixture</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>M524</td><td>Add to MS media mixture</td></tr><tr><td>MES Free Acid Monohydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19483580</td><td>Added to MS media to decrease pH</td></tr><tr><td>Agar Powder</td><td>Alfa Aesar</td><td>9002-18-0</td><td>Increases thickness of media to support seed suspension</td></tr><tr><td>5M KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484016</td><td>Increases pH to adequate levels</td></tr><tr><td>1L Media Storage Bottle</td><td>Corning</td><td>1395-1L</td><td>Holds enough media for a screen</td></tr><tr><td>Polypropylene Centrifuge Tubes</td><td>Corning</td><td>431470</td><td>Sterilizes seeds prior to vernilization</td></tr><tr><td>pH Probe</td><td>Davis Instruments</td><td>YX-58825-26</td><td>Used for making media</td></tr><tr><td>ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987836</td><td>Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX</td></tr><tr><td>Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide</td><td>Beckman Coulter</td><td>609862-AA</td><td>Aids in setting up the Stacker Carousel</td></tr><tr><td>Biomek FX and FX&lt;sup&gt;P&lt;/sup&gt; Laboratory Automation Workstations Users Manual</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987834</td><td>Used to frame the Multichannel Pod</td></tr><tr><td>Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN B32335AB</td><td>Used to aid in setting up the Biomek FX</td></tr><tr><td>Biomek Software User&#039;s Manual</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987835</td><td>Used to set up and understand the Software</td></tr></tbody></table>

optimizing the use of a liquid handling robot to conduct a high throughput forward chemical genetics screen of arabidopsis thaliana

Genetica chimica sempre più è stata impiegata per decodificare tratti in piante che possono essere recalcitranti alla tradizionale genetica a causa della ridondanza genica o letalità. Tuttavia, la probabilità di una piccola molecola sintetica essendo bioactive è bassa; di conseguenza, migliaia di molecole dovrà essere testati al fine di trovare quelli di interesse. Gestione robotica sistemi sono progettati per gestire un numero elevato di campioni, aumentando la velocità con cui una biblioteca chimica può essere proiettata oltre a minimizzare/standardizzazione errore di liquidi. Per ottenere una schermata di alto-rendimento avanti genetica chimica di una biblioteca di 50.000 piccole molecole su Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocolli usando un liquido multicanale banco manipolazione robot sono stati sviluppati che richiedono minima coinvolgimento tecnico. Con questi protocolli, 3.271 piccole molecole sono state scoperte che ha causato alterazioni fenotipiche visibile. 1.563 composti indotto brevi radici, 1.148 composti alterate colorazione, 383 composti causati radice dei capelli e altre, non categorizzata, alterazioni e germinazione 177 composti hanno inibiti.

La capacità di esattamente ed efficientemente caratterizzare fenotipi basati sull'aggiunta di piccole molecole alle concentrazioni sotto un microscopio per dissezione di screening è l'obiettivo finale di questo metodo di inoltro genetica chimica su Arabidopsis. I fenotipi osservati quando tutti i 50.000 composti erano stati proiettati era vari e può essere suddiviso in diverse classi distinte (Figura 2). Figura 3A -F raffigura esempi di fenotipi che sono stati osservati a basso ingrandimento sotto un microscopio per dissezione. Alcuni fenotipi fornito risultati inconcludenti (Figura 3, H). Questi hanno dovuto essere riprovati alle concentrazioni più basse per garantire che il prodotto chimico non ha fornito un fenotipo differente ad una dose più bassa.
Scarsi risultati possono verificarsi per molti motivi. Uno è tariffe poveri germinazione dei semi. Ciò può causare una lamiera schermante prevalentemente esporre nessuna germinazione o fenotipi germinazione incompleta (Figura 3, H), che può essere fuorviante. Per ovviare a questo, pre-test per tassi di germinazione per tutti i semi utilizzati. Una volta tassi di germinazione sono stati stabiliti e sono superiori al 95% per Arabidopsis, vernalizzazione di seme prima della aggiunta chimica è un passo fondamentale garantire la germinazione simultanea. Mancanza di germinazione simultanea può portare a falsi positivi in phenotyping. Oltre a questo, scarsi risultati possono sorgere se media è consentita per evaporare durante l'incubazione. Questa mancanza di idratazione impedisce la germinazione di semi e può essere evitata attraverso l'uso di contenitori a prova di essiccazione. Inoltre, soluzioni di DMSO e media sono nelle due colonne esterne di ogni piatto, garantendo la corretta micro climi e tassi di germinazione sono ottenuti.
Risultati sperimentali soddisfacenti si ottengono quando i tassi di germinazione sono > 95%, semi sono vernalizzati prima dell'aggiunta in piastre a 96 pozzetti a fondo piatto, garantendo germinazione simultanea, e media non evapora durante l'incubazione. Idealmente, i prodotti chimici sarebbero stati testati ad una concentrazione che consente tutti i semi di germinare e fenotipi per essere valutati con precisione (Figura 3A-F). La maggior parte delle piantine trattamenti prodotte con fenotipi che erano visivamente indistinguibili dai controlli finti con nessun fenotipi morfologici (Figura 3A), con la maggior parte dei fenotipi aberranti composto sbiancato e gravemente radici stentate (Figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig2v2.jpg"> Figura 2: I fenotipi più comuni osservati e la proporzione di ogni fenotipo osservato. A) un totale di 3.271 piccole molecole sono stati trovati per essere bioattivi a 100 µM dopo quattro giorni di incubazione. Il colore indica la gravità del fenotipo (nero = più severa, bianco = meno grave). Il più comunemente osservato fenotipo riferiscono alla morfologia della radice, con più di 1.500 composti che inducono le radici stentate di varia gravità. Colorazione è stato influenzato anche comunemente i composti in questa libreria, con 1.148 piantine registrate come sbiancato interamente o parzialmente scolorito. Appena sotto 400 composti prodotto distintivo dei capelli di radice fenotipi – sia stentati o entrambi stentata e dai colori vivaci. Infine, la germinazione ha risentito poco meno di 200 composti. In questi casi, semi di germinazione non è stata completata o non hanno ancora cominciato a germinare. B) le piantine che esibiscono le anomalie nella morfologia della radice, o essendo stentate o gravemente stentate, costituivano quasi la metà di tutte le piantine fenotipico aberrante. Il più grande gruppo successivo era quelli che ha provocato piantine sbiancati o scolorite. Fenotipi che hanno appartenuto alla radice dei capelli anomalie che inoltre si compone una parte considerevole mentre l'inibizione della germinazione, nessuna germinazione o la germinazione incompleta, si è verificato solo in una piccola percentuale di tutti i composti bioattivi. Infine, c'erano una serie di fenotipi che si è verificato a tale bassa frequenza, sono stati raggruppati nella categoria 'altra', di cui un esempio è stata la produzione di mucillagine verde, visto nella Figura 3. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig2v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig3.jpg"> Figura 3: immagini di rappresentante fenotipi osservati durante la schermata di avanzamento genetica chimica. Nessuna anormalità morfologiche visibili (A), radice di peli radicali marroni (B), arresto della crescita della radice (C), gravemente stentata (D), sbiancato (E), verde mucillagine (F), incompleta germinazione (G) e non germinazione (H). <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig4.jpg"> Figura 4: Panoramica del fascicolatore 10 e deck istituito prima dell'inizio del protocollo. Il carosello di Stacker è composto di quattro Stacker 10 (Alberghi A - D) che ogni ospitare dieci camere. Il ponte ospita una varietà delle Alpi: il caricatore di punta, la navetta di Stacker, il lavaggio multicanale Tip e 13 Alpi statico. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig5.jpg"> Figura 5: Deck impostare richiesto per la creazione di una libreria di diluizione ed impilatore 10. I quattro Stacker 10 vengono caricati con scatole di AP96 P20 puntali in camere 1 e 6 di Hotel A - D e pile di quattro V 96 pozzetti-piastre di fondo in camere 7-9 2-5 e camere di Hotel A - D. Il layout del ponte è costituito da due serbatoi di 300 mL su statico Alpi P3 e P7. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig6.jpg"> Figura 6: impilatore 10 e Deck impostati per aggiunta di miscela di Media-semi di Screening piastre. Il 10 di Stacker è caricato con quattro 96 pozzetti piatto-piastre di fondo in camere 1 e 2 di A. Hotel Il layout del ponte è costituito da due serbatoi di 300 mL su statico Alpi P3 e P7 e una scatola di AP96 P250 puntali su TL1. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig7.jpg"> Figura 7: impilatore 10 e Deck impostati per l'aggiunta di piccole molecole per Screening piastre. Il 10 di Stacker è caricato con una scatola di AP96 P250 puntali in camera 1, una pila di due 96 pozzetti V-diluizione inferiore piastre in camere di 2, 4, 6 e 8 e una pila di due 96 pozzetti piatto-piastre inferiori riempito con la miscela di semi di media in 3 camere , 5, 7 e 9. Il layout del ponte è costituito da due serbatoi di 300 mL su statico Alpi P3 e P7. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Ottimizzare l'utilizzo di un Robot di manipolazione liquido per condurre un alto Throughput avanti chimica genetica schermo di Arabidopsis thaliana

Una schermata di throughput elevato di piccole molecole sintetiche è stato condotto su specie modello, Arabidopsis thaliana. Questo protocollo, sviluppato per un robot di manipolazione dei liquidi, aumenta la velocità degli schermi genetica chimica avanti, accelerando la scoperta di nuove molecole piccole che riguardano la fisiologia vegetale.

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

optimizing-use-liquid-handling-robot-to-conduct-high-throughput

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

6.6K Views.  University of Kentucky. Una schermata di throughput elevato di piccole molecole sintetiche è stato condotto su specie modello, Arabidopsis thaliana. Questo protocollo, sviluppato per un robot di manipolazione dei liquidi, aumenta la velocità degli schermi genetica chimica avanti, accelerando la scoperta di nuove molecole piccole che riguardano la fisiologia vegetale.

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A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

Una piattaforma robotica per high-throughput Protoplast Isolamento e Trasformazione

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Ricerca

Genetica

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

High-throughput robotizzata Assisted Isolamento di sensibile alla temperatura letale Mutants in<em&gt; Reinhardtii Chlamydomonas</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Un metodo semplice per High Throughput Screening chimico in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Biochimica

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatizzato robot Liquid Handling Assembly di dispositivi modulari del DNA

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Bioingegneria

Screening ad alto rendimento per la cristallizzazione delle proteine

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into an ordered lattice amenable to diffraction remains challenging. The crystallization of biomolecules is largely experimentally defined, and this process can be labor-intensive and prohibitive to researchers at resource-limited institutions. At the National High-Throughput Crystallization (HTX) Center, highly reproducible methods have been implemented to facilitate crystal growth, including an automated high-throughput 1,536-well microbatch-under-oil plate setup designed to sample a wide breadth of crystallization parameters. Plates are monitored using state-of-the-art imaging modalities over the course of 6 weeks to provide insight into crystal growth, as well as to accurately distinguish valuable crystal hits. Furthermore, the implementation of a trained artificial intelligence scoring algorithm for identifying crystal hits, coupled with an open-source, user-friendly interface for viewing experimental images, streamlines the process of analyzing crystal growth images. Here, the key procedures and instrumentation are described for the preparation of the cocktails and crystallization plates, imaging the plates, and identifying hits in a way that ensures reproducibility and increases the likelihood of successful crystallization.

Autore in primo piano: Screening ad alto rendimento per ottenere crystal hits per la cristallografia proteica  

This protocol details high-throughput crystallization screening, ranging from the 1,536 microassay plate preparation to the end of a 6 week experimental time window. Details are included about the sample setup, the imaging obtained, and how users can perform analyses using an artificial intelligence-enabled graphical user interface to quickly and efficiently identify macromolecular crystallization conditions.

Screening ad alta produttività per ottenere colpi cristallini per la cristallografia proteica

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of bioprocess conditions. One important aspect is the improvement of cultivation medium to provide an optimal environment for microbial formation of the product of interest. It is well accepted that the media composition can dramatically influence overall bioprocess performance. Nutrition medium optimization is known to improve recombinant protein production with microbial systems and thus, this is a rewarding step in bioprocess development. However, very often standard media recipes are taken from literature, since tailor-made design of the cultivation medium is a tedious task that demands microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, fast product analytics, as well as support by lab robotics to enable reliability in liquid handling steps. Furthermore, advanced mathematical methods are required for rationally analyzing measurement data and efficiently designing parallel experiments such as to achieve optimal information content.
The generic nature of the presented protocol allows for easy adaption to different lab equipment, other expression hosts, and target proteins of interest, as well as further bioprocess parameters. Moreover, other optimization objectives like protein production rate, specific yield, or product quality can be chosen to fit the scope of other optimization studies. The applied Kriging Toolbox (KriKit) is a general tool for Design of Experiments (DOE) that contributes to improved holistic bioprocess optimization. It also supports multi-objective optimization which can be important in optimizing both upstream and downstream processes.

This manuscript describes a generic approach for tailor-made design of microbial cultivation media. This is enabled by an iterative workflow combining Kriging-based experimental design and microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, which is supported by lab robotics to increase reliability and speed in liquid handling media preparation.

Protocollo generico per l'ottimizzazione della produzione di proteine eterologhe utilizzando tecnologia automatizzata di Microbioreactor

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A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel production 1. Chemical methods to modify or degrade cellulose typically require strong acids and high temperatures. As such, enzymatic methods have become prominent in the bioconversion process. While the identification of active cellulases from bacterial and fungal isolates has been somewhat effective, the vast majority of microbes in nature resist laboratory cultivation. Environmental genomic, also known as metagenomic, screening approaches have great promise in bridging the cultivation gap in the search for novel bioconversion enzymes. Metagenomic screening approaches have successfully recovered novel cellulases from environments as varied as soils 2, buffalo rumen 3 and the termite hind-gut 4 using carboxymethylcellulose (CMC) agar plates stained with congo red dye (based on the method of Teather and Wood 5). However, the CMC method is limited in throughput, is not quantitative and manifests a low signal to noise ratio 6. Other methods have been reported 7,8 but each use an agar plate-based assay, which is undesirable for high-throughput screening of large insert genomic libraries. Here we present a solution-based screen for cellulase activity using a chromogenic dinitrophenol (DNP)-cellobioside substrate 9. Our library was cloned into the pCC1 copy control fosmid to increase assay sensitivity through copy number induction 10. The method uses one-pot chemistry in 384-well microplates with the final readout provided as an absorbance measurement. This readout is quantitative, sensitive and automated with a throughput of up to 100X 384-well plates per day using a liquid handler and plate reader with attached stacking system.

This protocol describes a high throughput screen for cellulolytic activity from a metagenomic library expressed in Escherichia coli. The screen is solution based and highly automated, and uses one-pot chemistry in 384 well microplates with the final readout as an absorbance measurement.

Una schermata di High Throughput per Biomining attività Cellulase da librerie metagenomiche

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

Biologia

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

Quantitative e automatica High-throughput Genome-wide Schermi RNAi in C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

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