Die Autoren danken Linnea Tankred und Diana Rydholm für Tierhaltung.

BALB/c Maus Welpen beiderlei Geschlechts wurden gemäß der Erklärung für den Einsatz von Tieren in ophtalmologischen und Vision Research verwendet, und die Protokolle wurden von Stockholms Ausschuss für ethische Animal Research genehmigt. Mäuse waren untergebracht in Würfen, zusammen mit der stillenden Mutter mit 12 h-Tag/Nacht-Zyklus, freien Zugang zu Futter und Wasser, und täglich überwacht.
Hinweis: Für den chirurgischen Eingriff wurden Mäuse mit flüchtigen Isoflurane Narkose gehalten. Okuläre Salben sind bei okulären Eingriffen abgeraten, da diese Behandlungen und verwendeten Substanzen stören könnte. Bei Bedarf kann zur Vermeidung von trocken-Auge, ein Tropfen sterile normale Kochsalzlösung angewendet werden. Obwohl vorderen Punktionen zur Selbstheilung, wurde darauf im vorderen Punktionen geachtet, Sterilität mit chirurgischen Instrumenten. Postoperative Behandlung inklusive subkutan, Hydratation mit normalen Kochsalzlösung und Analgesie mit okulärer topische Verabreichung von Tetracaine Hydrochlorid. Die Welpen durften sternalen liegen auf ein Heizkissen wiederherstellen, bevor Sie an die stillende Mutter in einem sauberen Käfig zurück. Würfe wurden gehalten, mit der gleichen stillenden Mutter, Stress zu vermeiden.
(1) Anästhesie
<ol><li>Bereiten Sie die Narkose Induktion Kammer Isoflurane Narkose zu verwalten und sicherstellen, dass eine kleine Maus Maske auch gekoppelt ist. Hinweis: Führen Sie alle Tierversuche in Übereinstimmung mit allen geltenden ethischen Genehmigungen.</li>
	<li>Vorausfüllen Sie Induktion Kammer mit 3-4 % flüchtige Isofluran in atmosphärischer Luft. Hinweis: Verschiedene betäubende Stoffe außer Isofluran können, nach ethischen Genehmigungen verwendet werden. Volatilere Anästhetikums Verfahren sollte auf einer belüfteten Bank oder Dunst Haube durchgeführt werden.</li>
	<li>Legen Sie eine postnatale (P) 12,5-Tag-alte BALB/c Maus Welpe in der Induktion-Kammer. Bestätigen Sie, dass das Anästhesie-Gerät bereit, Isofluran zur Induktion Kammer zu liefern. Hinweis: Maus Welpen sind zerbrechlich und am besten behandelt durch das Genick. Halten Sie die Welpen zusammen mit der stillenden Mutter, Stress zu vermeiden oder einen Wurf.</li>
	<li>Lassen Sie die Pup, vollständig betäubt werden.</li>
	<li>Sanft, abholen der Maus Welpe durch das Genick. Hinweis: Halten Sie die Induktion Kammer geschlossen an allen Zeiten für sicheren und stabilen Induktion.</li>
	<li>Übertragen Sie die Maus auf die Nager Maske. Achten Sie darauf, die Narkose Strömung aus der Induktion Kammer die Maske wechseln beim Bewegen der Maus.</li>
	<li>Führen Sie eine Zehe Prise Anästhesie zu bestätigen.</li>
</ol>2. Verfahren nach chirurgischen Stereoskop Punktion
<ol><li>Positionieren Sie den Mauszeiger im seitlichen liegen Stellung. Bestätigen Sie, dass die Maske gut aufgestellt ist, so ist die Maus Auge in das Blickfeld der Stereoskop.</li>
	<li>Drehen Sie sanft den Maus-Kopf, das Auge in Richtung das Stereoskop nach oben. Hinweis: Klare Fokussierung des Auges sollte unter das Stereoskop erreicht werden. Für die Positionierung, empfiehlt eine Vergrößerung von 16 X, während 40 X verwendet werden soll, um den chirurgischen Eingriff durchzuführen. Wenn ethische Genehmigungen es erlauben, kann trimmen die Spitze der Schnurrhaare erleichtern die Visualisierung des Auges.</li>
	<li>Ragen Sie mit kleinen binden Pinzette, sorgfältig die Pup Auge indem Abwärtsdruck auf die Augenlider dorsalen und ventralen für das Auge.</li>
	<li>Halten Sie eine sanfte, aber feste der Welpe Auge Deckel, mit kleinen Zangen. Hinweis: Es wird empfohlen, zur Durchführung des Auge-Vorsprungs und Deckel mit der nichtdominanten Hand halten, als die dominante Hand die Punktion durchführen sollte.</li>
	<li>Verwenden Sie das Stereoskop um die Hornhaut Limbus zu finden. Albino BALB/c Limbus kann leicht durch die kreisförmige vaskulären Plexus posterior der Hornhaut identifiziert werden.</li>
	<li>Führen Sie mit einer 0,25 mm Durchmesser (30 G) abgeschrägte Nadel eine kleinen vorderen Punktion, in der Nähe der hinteren limbisches maximal der Uvea. Verwenden Sie nur die Spitze der Nadel, und nicht mehr als die Hälfte die Abschrägung (entspricht 0,5 mm), Punktion der Uvea. Wenn richtig ausgeführt, die vorderen Stiche sind selbstdichtend, dennoch intraokulare Injektion Studie Stoffe kann durch die gleichen Einstichwunde verabreicht werden. Hinweis: Wenn mit Maus augenfällige Anatomie erfahren, wird die vorderen Punktion zwischen dem Ziliarkörper und Ora Serrata ausgeführt. Vorsicht ist geboten bei der Durchführung der vorderen Punktion zur Brechung der Linse zu vermeiden.</li>
	<li>Führen Sie die zweiten vorderen Punktion in der gegenüberliegenden Seite des Auges von der ersten Einstichstelle. Optimieren Sie die Entfernung und Position von den Pannen; Betrachten Sie 12 und 06:00 Einstiche mit 12:00 wird als dorsal wie möglich.</li>
	<li>Wiederholen Sie die vorderen Löcher alle vier Tage bis P24.5. Überwachen Sie vor jedem aufeinanderfolgenden vorderen Punktion Tier Status besonderes Augenmerk auf Anwesenheit von traumatische Katarakt aufgrund Objektiv Schäden während des vorderen Punktion oder offensichtliche verminderten Augeninnendruck. Ziel ist es für die Ausführung von wiederholten Einstiche an den gleichen Positionen als frühere Einstiche für optimale Effekte.</li>
</ol>(3) nicht-invasive in Vivo Überwachung
<ol><li>Betäuben Sie vor der Punktion oder Injektionen täglich experimentelle die Maus wie oben durchgeführt.</li>
	<li>Ragen Sie mit der Maus im seitlichen liegen Position sanft das Auge.</li>
	<li>Konzentrieren Sie sich auf Iris Gefäßsystem mit chirurgischen Stereoskop.</li>
	<li>Nehmen Sie ein Bild von der Iris Gefäßsystem mit einer Kamera ausgestattet, um die chirurgische Stereoskop. Hinweis: Obwohl nicht notwendig, induzierende Meiose Iris Fläche pro Tier zu normalisieren kann. Auswahl einen Meiose-induzierende Agent ethische Genehmigungen berücksichtigen. Sorgfältige Fokus des Gefäßsystems Iris werden Quantitative Analyse weiter erleichtern. Eine Größe von 40 X wird empfohlen.</li>
</ol>4. postoperative Pflege
<ol><li>BALB/c-Welpen aus der Nager Maske entfernen und sanft auf ein Heizkissen mit einer chirurgischen Matte Schichten übertragen.</li>
	<li>Ein Tropfen von 1 % Tetracaine Lösung auf durchlöcherten Augen anwenden. Hinweis: Andere schmerzstillenden Lösungen können, nach ethischen Genehmigungen verwendet werden.</li>
	<li>Das Tier mit einer subkutanen Injektion von 200 µL sterile normale Kochsalzlösung-Hydrat.</li>
	<li>Der Welpe die stillende Mutter in einem sauberen Maus Käfig zurück.</li>
	<li>Die Recovery-Prozess zu überwachen. Der Welpe sollte in der Lage, deambulate und zurück zu dem Wurf.</li>
</ol>5. Auge Enukleation
<ol><li>Das Tier durch zervikale Dislokation einschläfern. Führen Sie Enukleation und Dissektion unter ein Stereoskop zur besseren Visualisierung des Verfahrens. Hinweis: Verschiedene Euthanasie Verfahren können verwendet werden. Es wird empfohlen, sich strikt an ethischen Genehmigungen.</li>
	<li>Auseinanderziehen der Augenlider, die Exposition des Auges zu verbessern.</li>
	<li>Machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 0,5 cm) in der Nähe der Augenwinkel die Augenlider mit gebogenen Bonn Auge Schere.</li>
	<li>Mithilfe des exponierten Periorbitalregion Raumes Mikro binden Zange hinter (unter) der ganzen Welt im Orbit einfügen.</li>
	<li>Schnappen Sie sich das Gewebe rund um das Auge und ziehen Sie es vorsichtig nach oben. Vermeiden Sie festhalten an den Augapfel zu, verwenden Sie das umliegende Gewebe näher an die Augenhöhle.</li>
	<li>Legen Sie die gebogene Bonn Auge Schere hinter des Augapfels im Orbit.</li>
	<li>Geschnitten Sie durch das umliegende Gewebe, bis das Auge aus der Steckdose freigegeben wird. Hinweis: Diese Dissektion Technik unterhält Auge Anatomie und anschließende Analyse profitiert.</li>
	<li>Fahren Sie mit der Entfernung des überflüssigen Gewebes aus dem Auge. Das Entfernen des überflüssigen Gewebes kann nach der Fixierung, durchgeführt werden, falls gewünscht. Hinweis: BALB/c Mäuse Melanin mangelhaft, daher sind dagegen erhöhen wird ein dunkler Hintergrund empfohlen, Dissektion zu erleichtern.</li>
	<li>Kurz spülen das gesamte Auge in einer Petrischale mit sterilem Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) gefüllt.</li>
	<li>Übertragen Sie das Auge auf eine 2 mL-Röhrchen mit 1,5 mL 4 % gepuffert Formalin-Lösung.</li>
	<li>Befestigen Sie das Auge für 6 h bei Raumtemperatur. Hinweis: Fixierung verleiht die Steifigkeit des Gewebes und erleichtert die Dissektion der Iris. Zeit sollte getestet und für unterschiedliche Anwendungen angepasst werden.</li>
</ol>6. Iris Dissektion Verfahren unter Stereoskop
<ol><li>Entfernen Sie die Fixativ Lösung aus dem Rohr mit einer 1,5 mL Kunststoff Pasteurpipette (oder ähnlich), und spülen Sie das Auge dreimal mit frischen PBS.</li>
	<li>Legen Sie das feste Auge in eine trockene Oberfläche (Dissektion Stand) mit der Vorderkammer nach oben.</li>
	<li>Führen Sie mit einer abgeschrägten 30 G Nadel nach dem Limbus Einstiegspunkt.</li>
	<li>Sie den vorderen Augenabschnitt mit kleinen binden Zange halten, legen Sie ein Tipp Clayman-Vannas geraden Schere in die zuvor entstandene Öffnung. Hinweis: Es wird empfohlen, die Zange mit der nichtdominanten Hand, und die Schere mit der dominanten zu kontrollieren.</li>
	<li>Beim Drehen des Auges mit der Kopplung Zange schneiden um den Limbus, die hintere Segment des Auges zu entfernen. Hinweis: Teilweise Kürzungen durchführen wird damit die innere Spitze der Schere weiter in das Gewebe und erheblich erleichtert den Prozess.</li>
	<li>Positionieren Sie den vorderen Augenabschnitt nach unten, Freilegung der Linse.</li>
	<li>Nehmen Sie das Objektiv vorsichtig mit kleinen Zangen greifen und nach oben ziehen. Hinweis: Eine abgeschrägte Nadel kann zu punktieren und ziehen die Linse verwendet werden.</li>
	<li>Positionieren Sie den vorderen Augenabschnitt mit der Hornhaut nach unten und der Schnitt senkrecht auf das Sichtfeld.</li>
	<li>Greifen Sie sanft das Gewebe nach der Ziliarkörper mit der kleinen binden Zange.</li>
	<li>Fahren Sie mit der geraden Schere Clayman-Vannas mit trim nur anterior der Ziliarkörper die trabekuläre Geflecht zu entfernen und die Iris zu isolieren. Bestätigen Sie, dass die trabekuläre Geflecht entfernt ist; die Iris sollte innerhalb der Hornhaut bewegen.</li>
	<li>Übertragen Sie die vordere Augenmuschel vorsichtig mit der kleinen binden Zange, hält die Hornhaut zu einer 96-Well-Platte mit 200 µL PBS</li>
	<li>Halten Sie die Hornhaut in den Brunnen und sezieren Sie die Iris durch Spülen mit PBS mit einer Pipette zu. Hinweis: Wenn der Iris bleibt Anhänger an der Hornhaut, einige trabekuläre Geflecht Gegenwart und die Abschrägung einer 30 G-Nadel könnte einsetzbar, verdrängen die Iris zu helfen.</li>
	<li>Entfernen der Hornhaut von 96-Well mit der kleinen binden Zange, und halten die isolierte Iris in den Brunnen zur weiteren Analyse.</li>
	<li>Freischwebende Iris Proben bei 4 ° c lagern Hinweis: Trotz fixiert, wird langfristige Lagerung der Iris frei schwebenden Proben nicht empfohlen.</li>
</ol>7. mögliche experimentelle auslesen
<ol><li>Um die Blutgefäße in die seziert Iris sichtbar zu machen, verwenden Sie frei schwebenden ganze-Mount immunhistochemische Färbung Methoden für Marker wie Thrombozyten Endothelzellen Adhäsionsmolekül (PECAM)-1 oder Isolectin B4. Alternativ können Sie Ganzkörper-Perfusion mit vaskulären Färbung, wie Leuchtstofflampen beschriftet hochmolekularen Dextrans.</li>
	<li>Verwenden Sie in Vivo nicht-invasive Bilder in Silico Wohnung-Montage und volle Iris Gefäßsystem mit entsprechenden Bildbearbeitungssoftware zu quantifizieren. Hinweis: Gefäßsystem kann quantifiziert werden, sowohl in Vivo und in Vitro, mit Densitometrie oder Gefäßsystem Analyse Software9.</li>
	<li>Verarbeiten des ganze Augapfels für Nukleinsäuren und Protein-Extraktion, gefolgt von PCR oder Immunoblotting Methoden, molekulare Analyse der punktierten Augen durchführen. Hinweis: Molekulare Analyse der Gewebe erfolgt am besten mit nicht feste Gewebe, aber Dissektion nicht feste Iris ist sehr anspruchsvoll und die Nutzung des gesamten Auges hat statistisch signifikante Ergebnisse in früheren Studien8gerendert.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll ist eine neuartige Methode zur Induktion von Iris vaskuläre Reaktion durch vorderen Punktion vorgestellt. Die Punktion Wunde heilende Mechanismen auslöst und fördert die vaskuläre Reaktionen in der Iris10,11. Dies ist im Einvernehmen mit okulärer Pathologien wie PDR und NVG, wo verschärfter angiogenen Antworten von der Netzhaut im hinteren Bereich des Auges in den klinischen Zustand des Rubeosis Iridis, eine verstärkte Vaskularisierung der...

Iris, zusammen mit dem Ziliarkörper und der Aderhaut, umfasst die Uvea, die die meisten vaskularisierte Gewebe des Auges ist. Iris Gefäßsystem ist unerlässlich bei der Aufrechterhaltung der Homöostase in der Vorderkammer des Auges. Als Folge der reichlich Anastomosen Verbindungen zwischen Arterien und Venen bieten Iris Blutgefäße Nähr- und Sauerstoffversorgung nicht nur um die Iris selbst, sondern auf das gesamte vordere Segment des Auges1.
Die Bildung neuer Blutgefäße oder Angiogenese aus bereits vorhandenen ist grundlegend in physiologischen Prozessen, wie Entwicklung und Wundheilung2. Angiogenese ist durch eine Vielzahl von kanonischen Faktoren, wie z. B. vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und Plasminogen-Aktivator-Inhibitor (PAI), sowie mehrere Entzündungsfaktoren fein reguliert, und ein Ungleichgewicht dieser Faktoren kann zu pathologischen führen Angiogenese-3.
In den Augen verursacht Neovaskularisation Anblick lebensbedrohliche Krankheiten wie proliferative diabetische Retinopathie (PDR) und neovaskulären Glaukoms (NVG). Bei diesen okulären Erkrankungen die fokale Neovaskularisation liegt häufig in retinalen Gewebe, doch das Ungleichgewicht bei entzündlichen und angiogenen Faktoren in den hinteren und vorderen okulären Kammern des Auges wurde mit Rubeosis Iridis, die klinische Bezeichnung für Iris pathologischen Neoangiogenese4. Diese Erkrankungen zeigen die Fähigkeit der Erwachsenen Iris Angiogenese zu unterziehen. Bei Mäusen okuläre Gefäßsystem ist nach der Geburt unreif und Reifung nach der Geburt weiter. Diese Besonderheit der Entwicklung wird im Mausmodell der Sauerstoff-induzierte Retinopathie, ein Modell ausgenutzt, die den klinischen Zustand des Retinopathy der Frühreife5eng imitiert. Darüber hinaus Angiogenese und Entzündungen spielen eine Schlüsselrolle bei der Wundheilung Mechanismen6und Wundheilung selbst Angiogenese Modelle7zugeordnet wurde.
In dieser Studie beschreiben wir ein Modell der Iris Punktion-induzierte Neovaskularisation. In der Nähe die äußere Grenze des Limbus, induzieren die Iris Neovaskularisation durch das Auslösen der Wundheilungssystem vorderen Einstiche erfolgt. Durch die Transparenz der Hornhaut, Iris Gefäßsystem kann leicht in Vivo durch nicht-invasive Methoden analysiert. Punktierte Augen präsentieren eine Erhöhung des vaskulären Bettes in der Iris, die was einer Steigerung von Plasminogen aktivieren und Entzündungsmarker8zugeordnet wurde. Das vorgestellte Modell hat großes Potential als ein neues Instrument zur Angiogenese und screening-angiogenen Verbindungen zu studieren und ermöglicht direkte in Vivo Visualisierung der angiogenen Prozesse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bonn eye scissors</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>23060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clayman-Vannas curved scissors</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>E3383 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clayman-Vannas straight scissors</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>E3383 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective adapter for camera</td>
			<td>Handcrafted</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Or any system that allows adapting a camera to the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad 100-110 watts</td>
			<td>Non Applicable</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Available in pet/veterinarian stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic 30g beveled needle</td>
			<td>KDM GmBH germany</td>
			<td>911914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iphone 4S</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Non Applicable</td>
			<td>Or other high resolution image acquistion device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>KDG 9623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson tying forceps</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>E1815 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tying forceps</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>63140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minims tetracaine hydrochloride</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1 % (w/v) Eye Drops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral-buffered formalin</td>
			<td>Bioreagens</td>
			<td>0018-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal saline solution</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>210352</td>
			<td>0.9 % (w/v) NaCl in injectable water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Balanced and buffered PBS pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 10 cm</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 3 cm</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe Seal Tube 2.0 mL</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>72.685.200</td>
			<td>Or any eppendorf style tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC plate 96-well</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette 3.5 mL</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>86.1171</td>
			<td>Or any other Pasteur pipette style</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Univentor 400 anesthesia unit</td>
			<td>Univentor Limited</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Or equivalent flow regulator with induction chamber and mask for volatile anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild M650 surgical microscope</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Or other surgical or magnifying stereoscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

puncture-induced iris neovascularization as a mouse model of rubeosis iridis

Wir beschreiben ein Modell der Iris Punktion-induzierte Neovaskularisation als ein allgemeines Modell für nicht-invasive Evaluation der Angiogenese. Das Modell ist auch relevant für die Zielgruppenadressierung neovaskulären Glaukom, eine Sicht lebensbedrohliche Komplikation der diabetischen Retinopathie. Diese Methode beruht auf der Induktion von Iris vaskuläre Antwort von einer Reihe von selbstdichtend vorderen Pannen an Mäusen BALB/c und nutzt die Vorteile der postpartalen Reifung der Maus okuläre Gefäßsystem. Maus Welpen durchlaufen vorderen Punktionen von postnatale Tag 12,5, wenn die Welpen bis postnatale Tag 24,5 natürlich ihre Augen öffnen. Durch die Transparenz der Hornhaut kann Iris Gefäßsystem leicht Zeitreise durch nicht-invasive in-Vivo -Methoden analysiert werden. Darüber hinaus kann die halbtransparente Iris von BALB/c Mäusen Flatmounted für genaue Immunohistologic Analyse mit minimale unspezifische Hintergrundfärbung sein. In diesem Modell Angiogenese ist hauptsächlich durch die entzündliche und Plasminogen aktivieren Systeme. Die Punktion-induzierte Modell ist das erste, Iris Neovaskularisation bei kleinen Nagern zu induzieren und hat den Vorteil, dass direkte nicht-invasive in Vivo Analyse des Prozesses zur Angiogenese. Darüber hinaus das Modell angiogenen modulierender Substanzen, kombinierbar mit die highlights sein Potenzials in der Studie der Angiogenese mit einer in-Vivo -Perspektive.

Albino BALB/c Maus Welpen am P12.5 vorderen Löcher, jeden vierten Tag wiederholt ausgesetzt waren (experimentelle Tag 0, 4, 8, 12), bis P24.5. Am P27.5 Mäuse wurden eingeschläfert und Iris sorgfältig seziert (experimentelle 15.Tag). Maus Augen wurden mit einer Kamera angeschlossen an eine chirurgische Stereoskop vor jeder Punktion Serie in experimentellen täglich fotografiert, nicht-invasive Beurteilung der Iris vaskuläre Antwort zu bewerten. Vorderen Einstiche induzieren eine vasku...

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Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

Iris Neovaskularisation, eine häufige Komplikation der ischämischen Netzhauterkrankung kann zu Anblick-bedrohlichen neovaskulären Glaukoms führen. Hier beschreiben wir eine murinen Protokoll zur Induktion experimentelle Iris Neovaskularisation, die für nicht-invasive Beurteilung der Angiogenese-modulierender Substanzen verwendet werden kann.

Punktion-induzierte Iris Neovaskularisation als einem Mausmodell der Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

puncture-induced-iris-neovascularization-as-mouse-model-rubeosis

Research

JoVE Journal

Medicine

8.7K Aufrufe.  Karolinska Institutet. Iris Neovaskularisation, eine häufige Komplikation der ischämischen Netzhauterkrankung kann zu Anblick-bedrohlichen neovaskulären Glaukoms führen. Hier beschreiben wir eine murinen Protokoll zur Induktion experimentelle Iris Neovaskularisation, die für nicht-invasive Beurteilung der Angiogenese-modulierender Substanzen verwendet werden kann.

Serie: Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Einem Mausmodell der In Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Forschung

Medizin

Mouse Complete Stasis Model of Inferior Vena Cava Thrombosis

Venous thromboembolism (VTE) includes both deep vein thrombosis (DVT) and pulmonary embolism (PE). In the United States (U.S.), the high morbidity and mortality rates make VTE a serious health concern 1-2. After heart disease and stroke, VTE is the third most common vascular disease 3. In the U.S. alone, there is an estimated 900,000 people affected each year, with 300,000 deaths occurring annually 3. A reliable in vivo animal model to study the mechanisms of this disease is necessary.
The advantages of using the mouse complete stasis model of inferior vena cava thrombosis are several. The mouse model allows for the administration of very small volumes of limited availability test agents, reducing costs dramatically. Most promising is the potential for mice with gene knockouts that allow specific inflammatory and coagulation factor functions to be delineated. Current molecular assays allow for the quantitation of vein wall, thrombus, whole blood, and plasma for assays. However, a major concern involving this model is the operative size constraints and the friability of the vessels. Also, due to the small IVC sample weight (mean 0.005 grams) it is necessary to increase animal numbers for accurate statistical analysis for tissue, thrombus, and blood assays such as real-time polymerase chain reaction (RT-PCR), western blot, enzyme-linked immunosorbent (ELISA), zymography, vein wall and thrombus cellular analysis, and whole blood and plasma assays 4-8.
The major disadvantage with the stasis model is that the lack of blood flow inhibits the maximal effect of administered systemic therapeutic agents on the thrombus and vein wall.

The mouse complete stasis model of inferior vena cava thrombosis yields quantifiable amounts of vein wall tissue and thrombus. It has proven useful for evaluating interactions between the vein wall and the occlusive thrombus and in assessing the progression from acute to chronic inflammation.

Maus Komplette Stasis Model of Inferior Vena Cava Thrombose

Venous thromboembolism (VTE) includes both deep vein thrombosis (DVT) and pulmonary embolism (PE).  In the United States (U.S.), the high morbidity and ...

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the low-molecular-weight-heparin (LMWH), enoxaparin. There are also urgent clinical situations where it would be important if this could be determined rapidly. The present assay is designed to accomplish this. We only assayed human blood samples that were spiked with known concentrations of enoxaparin. The essential feature of the present assay is the quantification of the efficacy of enoxaparin in a patient's blood sample by degrading it to complete inactivity with heparinase. Two blood samples were drawn into Vacutainer tubes (Becton-Dickenson; Franklin Lakes, NJ) that were spiked with enoxaparin; one sample was digested with heparinase for 5 min at 37 &deg;C, the other sample represented the patient's baseline anticoagulated status. The percent shortening of clotting time in the heparinase-treated sample, as compared to the baseline state, yielded the anticoagulant contribution of enoxaparin. We used the portable, battery operated Hemochron 801 apparatus for measurements of clotting times (International Technidyne Corp., Edison, NJ). The apparatus has 2 thermostatically controlled (37 &deg;C) assay tube wells. We conducted the assays in two types of assay cartridges that are available from the manufacturer of the instrument. One cartridge was modified to increase its sensitivity. We removed the kaolin from the FTK-ACT cartridge by extensive rinsing with distilled water, leaving only the glass surface of the tube, and perhaps the detection magnet, as activators. We called this our minimally activated assay (MAA). The use of a minimally activated assay has been studied by us and others. 2-4 The second cartridge that was studied was an activated partial thromboplastin time (aPTT) assay (A104). This was used as supplied from the manufacturer. The thermostated wells of the instrument were used for both the heparinase digestion and coagulation assays. The assay can be completed within 10 min. The MAA assay showed robust changes in clotting time after heparinase digestion of enoxaparin over a typical clinical concentration range. At 0.2 anti-Xa I.U. of enoxaparin per ml of blood sample, heparinase digestion caused an average decrease of 9.8% (20.4 sec) in clotting time; at 1.0 I.U. per ml of enoxaparin there was a 41.4% decrease (148.8 sec). This report only presents the experimental application of the assay; its value in a clinical setting must still be established.

Demonstration of a rapid quantitative assay of the inhibition of blood coagulation by the low-molecular-weight-heparin, enoxaparin. The contribution of enoxaparin is assessed by removing its influence through digestion with heparinase. A fuller description of the assay is detailed in our published paper.1 The assay still requires clinical confirmation.

Schnelle Point-of-Care-Test von Enoxaparin Gerinnungshemmer Wirksamkeit im Vollblut

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

Animal models of human disease are necessary in order to rigorously study stages of disease progression and associated mechanisms, and ultimately, as pre-clinical models to test interventions. In these methods, we describe a technique in which lipopolysaccharide (LPS) is injected into the lactating mouse mammary gland via the nipple, effectively modeling mastitis, or inflammation, of the gland. This simulated infection results in increased nuclear factor kappa B (NF-&kappa;B) signaling, as visualized through bioluminescent imaging of an NF-&kappa;B luciferase reporter mouse1.
Our ultimate goal in developing these methods was to study the inflammation associated with mastitis in the lactating gland, which often includes redness, swelling, and immune cell infiltration2,3. Therefore, we were keenly aware that incision or any type of wounding of the skin, the nipple, or the gland in order to introduce the LPS could not be utilized in our methods since the approach would likely confound the read-out of inflammation. We also desired a straight-forward method that did not require specially made hand-drawn pipettes or the use of micromanipulators to hold these specialized tools in place. Thus, we determined to use a commercially available insulin syringe and to inject the agent into the mammary duct of an intact nipple. This method was successful and allowed us to study the inflammation associated with LPS injection without any additional effects overlaid by the process of injection. In addition, this method also utilized an NF-&kappa;B luciferase reporter transgenic mouse and bioluminescent imaging technology to visually and quantitatively show increased NF-&kappa;B signaling within the LPS-injected gland4.
These methods are of interest to researchers of many disciplines who wish to model disease within the lactating mammary gland, as ultimately, the technique described here could be utilized for injection of a number of substances, and is not limited to only LPS.

Described here is a technique in which lipopolysaccharide is injected into the lactating mouse mammary gland via the nipple to simulate mastitis, a condition commonly caused by bacterial infection. Lipopolysaccharide injection results in increased nuclear factor kappa B (NF-&kappa;B) signaling, visualized through bioluminescent imaging of an NF-&kappa;B luciferase reporter mouse.

Intraduktale Injektion von LPS als Maus-Modell der Mastitis: Signaling Visualisierte über einen NF-kappaB Reporter Transgene

Animal models of human disease are necessary in order to rigorously study stages of disease progression and associated mechanisms, and ultimately, as ...

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for personalized medicine after stratification, explaining the current interest in developing a reproducible and low-cost xenotransplant model for this disease. The chick chorioallantoic membrane is a natural immunodeficient host capable of sustaining grafted tissues and cells without species-specific restrictions. In addition, it is easily accessed, manipulated and imaged using optical and fluorescence stereomicroscopy. Histology further allows detailed analysis of heterotypic cellular interactions.
This protocol describes in detail the in ovo grafting of the chorioallantoic membrane with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines (Saos-2 and SW1353). The chick survival rates are up to 75%. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior. For localized grafting of single cell suspensions, ECM gel provides significant advantages over inert containment materials. The Ki67 proliferation index is related to the distance of the cells from the surface of the CAM and the duration of application on the CAM, the latter determining a time frame for the addition of therapeutic products.

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

The in ovo chorioallantoic membrane (CAM) is grafted with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior.

Die<em&gt; In ovo</em&gt; CAM-Assay als Xenograftmodel für Sarkom

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the cornea, which can be caused by trauma, keratoplasty or infectious disease, breaks down the so called &lsquo;angiogenic privilege' of the cornea and forms the basis of multiple visual pathologies that may even lead to blindness. Although there are several treatment options available, the fundamental medical need presented by corneal neovascular pathologies remains unmet. In order to develop safe, effective, and targeted therapies, a reliable model of corneal NV and pharmacological intervention is required. Here, we describe an alkali-burn injury corneal neovascularization model in the mouse. This protocol provides a method for the application of a controlled alkali-burn injury to the cornea, administration of a pharmacological compound of interest, and visualization of the result. This method could prove instrumental for studying the mechanisms and opportunities for intervention in corneal NV and other neovascular disorders.

Neovascularization (NV) of the cornea can complicate multiple visual pathologies. Utilizing a controlled, alkali-burn injury model, a quantifiable level of corneal NV can be produced for mechanistic study of corneal NV and evaluation of potential therapies for neovascular disorders.

Eine Alkali-brennen Verletzungsmodell der Hornhaut Neovaskularisation bei der Maus

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch&#8217;s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD. 
First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects. 
The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.
Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Ein Mausmodell für Laser-induzierten CNV

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) ...

Tachycardia-Induced Cardiomyopathy As a Chronic Heart Failure Model in Swine

A stable and reliable model of chronic heart failure is required for many experiments to understand hemodynamics or to test effects of new treatment methods. Here, we present such a model by tachycardia-induced cardiomyopathy, which can be produced by rapid cardiac pacing in swine.
A single pacing lead is introduced transvenously into fully anaesthetized healthy swine, to the apex of the right ventricle, and fixated. Its other end is then tunneled dorsally to the paravertebral region. There, it is connected to an in-house modified heart pacemaker unit that is then implanted in a subcutaneous pocket. 
After 4 - 8 weeks of rapid ventricular pacing at rates of 200 - 240 beats/min, physical examination revealed signs of severe heart failure - tachypnea, spontaneous sinus tachycardia, and fatigue. Echocardiography and X-ray showed dilation of all heart chambers, effusions, and severe systolic dysfunction. These findings correspond well to decompensated dilated cardiomyopathy and are also preserved after the cessation of pacing.
This model of tachycardia-induced cardiomyopathy can be used for studying the pathophysiology of progressive chronic heart failure, especially hemodynamic changes caused by new treatment modalities like mechanical circulatory supports. This methodology is easy to perform and the results are robust and reproducible.

Here, we present a protocol to produce tachycardia-induced cardiomyopathy in swine. This model represents a potent way to study the hemodynamics of progressive chronic heart failure and the effects of applied treatment.

Tachykardie-induzierten Kardiomyopathie als Vorbild chronischer Herzinsuffizienz bei Schweinen

A stable and reliable model of chronic heart failure is required for many experiments to understand hemodynamics or to test effects of new treatment ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Messung der isometrischen Kontraktilität der Maus mesenterialen Arterie mit Draht Myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Punktion-induzierte Iris Neovaskularisation als einem Mausmodell der Rubeosis Iridis

Zusammenfassung

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