Das Protokoll bietet ein Modell, um Mechanismen von Gefäßverletzungen und der anschließenden Entwicklung von Ödemen auf nicht-invasive Weise zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie die Verletzung im Laufe der Zeit ohne chirurgischen Eingriff live verfolgen können. Dies bietet Möglichkeiten, Behandlungen effizienter zu testen.
Es kann schwierig sein, zu lernen, wie man die richtige Schwanzvenierung durchführt und das Tier richtig auf der Plattform unterbringt. Für beide Techniken empfehle ich, geduldig zu sein und die Dinge langsam anzugehen. Fassen Sie zunächst vorsichtig das Glasfaserkabel an und verbinden Sie es mit der Lasersteuerbox und dem Laseradapter des Netzhautmikroskops, und schalten Sie dann die Lampenbox des Netzhautmikroskops ein.
Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie das Bildbearbeitungsprogramm. Legen Sie ein weißes Blatt Papier vor das Mikroskop-Okular und passen Sie den Weißabgleich an, indem Sie im Bildgebungsprogramm auf Einstellen klicken. Schalten Sie die Lasersteuerbox ein, indem Sie die Taste drehen und den Anweisungen auf dem Bildschirm der Lasersteuerbox folgen.
Um die Basislaserleistung zu überprüfen, stellen Sie die Lasersteuerbox auf 50 Milliwatt und 2.000 Millisekunden ein. Schalten Sie dann den Laser ein und legen Sie den Leistungsmesser vor das Okular. Drücken Sie das Fußschalterpedal, um den Laser zu aktivieren, mit dem Ziel, dass die Laserleistung 13 bis 15 Milliwatt beträgt.
Stellen Sie dann die experimentelle Laserleistung auf 100 Milliwatt und 1.000 Millisekunden ein und schalten Sie den Laser aus. Gießen Sie 300 Milliliter Wasser in ein 500-Milliliter-Becherglas und erwärmen Sie das Becherglas eine Minute lang in der Mikrowelle. Dann legen Sie eine Gaze in das warme Wasser.
Als nächstes legen Sie eine zwei Monate alte männliche Maus in eine Fessel. Drücken Sie die warme Gaze vorsichtig in den Mausschwanz und suchen Sie nach den erweiterten Venen. Injizieren Sie mit einer 26-Gauge-Nadel die entsprechende Menge Rosenbengalen entsprechend dem Gewicht des Tieres und üben Sie Druck auf die Injektionsstelle aus, um Hämatome oder Blutungen zu vermeiden, bevor Sie die Stelle abwischen.
Lösen Sie dann die Maus aus der Rückhalteeinrichtung und legen Sie sie wieder in den Käfig. Lassen Sie die Rose Bengal acht Minuten vor der Injektion von Anästhetika zirkulieren. Schalten Sie die beheizte Mausplattform ein.
Dann fügen Sie einen Tropfen Phenylephrin und Tropicamid in jedes Auge der Maus hinzu. Nach der Bestätigung der Anästhesie fügen Sie einen Tropfen Proparacainhydrochlorid pro Auge hinzu und fügen Sie dann Augensalbe zu beiden Augen hinzu. Als nächstes injizieren Sie 150 Mikroliter Carprofen subkutan zwischen die Ohren.
Legen Sie dann die Maus auf die Plattform und stellen Sie die Plattform ein, bis die Sicht auf den retinalen Fundus klar und fokussiert ist. Zählen Sie die Netzhautvenen und machen Sie ein Bild des Fundus. Als nächstes schalten Sie den Laser ein und zielen Sie auf eine Netzhautvene, die etwa 375 Mikrometer von der Sehscheibe entfernt ist.
Bestrahlen Sie das Gefäß, indem Sie den Fußschalter drücken und den Laserstrahl leicht bis zu 100 Mikrometer bewegen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal und bewegen Sie den Laserstrahl nach jedem Puls so, dass die Bestrahlung nicht auf eine Stelle fokussiert wird. Wiederholen Sie die Bestrahlung auf anderen großen Gefäßen, um zwei bis drei Verschlüsse zu erreichen.
Nachdem Sie die Gefäße bestrahlt haben, schalten Sie die Lampe aus und warten Sie 10 Minuten. Schalten Sie dann die Lampe wieder ein, zählen Sie die Anzahl der verschlossenen Venen und machen Sie ein Bild des Fundus. Nach der Bildaufnahme und der Kochsalzlösung fügen Sie Gleitmittel Augentropfen und Gelsalbe auf beide Augen hinzu.
Beobachten Sie, wie sich die Maus von der Narkose erholt, und bringen Sie sie erst dann mit anderen Tieren in den Käfig zurück, wenn sie sich vollständig erholt hat. Die Anzahl der Okklusionen, die unmittelbar nach der Laserbestrahlung erreicht wurden, unterschied sich nicht zwischen den Tieren, die 10 und 20 Minuten nach der Verabreichung von Rosenbengalen gelasert wurden. Die Anzahl der Verschlüsse, die bis zu einem Tag nach dem retinalen Venenverschluss auftraten, nahm bei Tieren, die 20 Minuten nach der Verabreichung von Rosenbengalen gelasert wurden, unabhängig vom Genotyp signifikant ab.
Ohne die experimentelle Leistung von 100 Milliwatt zu modifizieren, führte eine niedrige Basislaserleistung von 11,5 Milliwatt zu keinen Okklusionen. Im Gegensatz dazu führte eine Basislaserleistung von 13,5 Milliwatt zu erfolgreichen Okklusionen. Vier Haupttypen von Okklusionen treten nach der Laser-Photokoagulation auf: vollständig verschlossene Gefäße, teilweise verschlossene Gefäße, teilweise reperfundierte und vollständig reperfundierte Gefäße.
Das bestrahlte Gefäßsystem von Tamoxifen-induzierbaren Endothelzell-Casp9-Knockout-Mäusen verbrachte mehr Zeit in teilweise reperfundierten und teilweise verschlossenen Zuständen als das von C57 Black 6-Mäusen, die mehr Zeit in vollständig verschlossenen Zuständen verbrachten. Der Verschlusszustand der Gefäße ändert sich innerhalb der ersten 10 Minuten nach der Laser-Photokoagulation schnell und flammenförmige Blutungen werden 24 Stunden nach der Verletzung beobachtet. Nach einem Netzhautvenenverschluss traten verschiedene ophthalmologische Pathologien auf.
Das Ausmaß des Netzhautödems nach retinalem Venenverschluss kann bei den verletzten Augen mit optischen Kohärenztomographie-Bildern quantifiziert werden. Der Zustand der neuronalen Schichten kann auch bestimmt werden, indem die Desorganisation der inneren Schichten der Netzhaut beurteilt wird. Ein Beispiel für ein optisches Kohärenztomographiebild mit den entsprechenden Beschriftungen für jede Schicht ist hier dargestellt.
Die Messung der Basislaserleistung ist wichtig. Diese Anzeige hat einen großen Einfluss auf den Erfolg der Okklusionen und kann optimiert werden. Zusätzliche Methoden wie OCT, ERG und Optiger können durchgeführt werden.
Dies wird dazu beitragen, die Auswirkungen neurovaskulärer Verletzungen auf die neuronale Integrität der Netzhaut und die Funktion der Sehbahnen zu untersuchen. Diese Technik ebnet den Weg, um die molekularen Signalwege zu untersuchen, die neurovaskuläre Erkrankungen antreiben, und liefert durch die Verfolgung einzelner Tiere im Laufe der Zeit Daten, die leichter auf menschliche Krankheiten übertragen werden können.
