Diese Meldung kann helfen, wichtige Fragen in Immunophenotypisierung in Murine-Modellen zu beantworten, wie Marker verwendet, um verschiedene Immunitätslinien und Alterungsstrategien zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass der Marker und die Alterungs-Stategies, wenn Dieimmunonotypisierung, auf eine Vielzahl von murinen Modellen angewendet werden können. Überwachen Sie das Körpergewicht von C57 Black 6 Mäusen mit einem Gleichgewicht.
Überwachen Sie auch das Tumorvolumen von Tumor-verschiedenen Spendermäusen durch Kalibermessung. Nach der Euthanasie des Tieres in einer Biohazard-Haube nach Protokoll, sterilisieren Sie die Haut um den Tumor mit Iodophor Tupfer. Nach der chirurgischen Entfernung des Tumors, wie im Textprotokoll beschrieben, legen Sie den Tumor in eine Petrischale mit 20 Milliliter PBS, die auf 4 Grad Celsius vorgekühlt wurde.
Wenn es verunreinigendes Blut gibt, übertragen Sie den Tumor in eine andere Petrischale und waschen Sie den Tumor mit PBS. Den Tumor halbieren. Entfernen Sie zusätzliche Haut, Gefäße, Verkalkung und Nekrose.
Wählen Sie nur intakte Tumorstücke und legen Sie sie in ein steriles 50 Milliliter Zentrifugenrohr. Fügen Sie 20 Milliliter PBS hinzu, bevor Sie das Rohr in einen separaten Tierraum für Pharmakologie-Studien transportieren. Um sich auf die orthotopische Implantation vorzubereiten, fixieren Sie eine voll anästhesische Maus auf einem Experimentierbrett in der rechten seitlichen Position.
Desinfizieren Sie die Haut um die Milz mit Idod und deiodiieren Sie dann mit 75% Ethylalkohol. Finden Sie den Medianpunkt der Milz und machen Sie einen 1 Zentimeter vertikalen Schnitt am Bauch, um die Milz freizulegen. Ziehen Sie vorsichtig einen Teil des Bauchspeicheldrüsengewebes unter der Milz mit einer flachen Zehenpinzette heraus.
Und Sutro-Maus homograft Tumorstück von der C-Maus auf die Bauchspeicheldrüse der Empfängermaus durch 9-O bsorbable chirurgische Naht. Schließen Sie den Bauch mit einer 6-O Seidennaht mit Doppelnaht. Erreichen Sie Homöostase durch Kompression.
Nach Beendigung der Tumorimplantation, halten Sie das Tier in einem warmen Käfig, solange keine Blutungen oder Tumorgewebe Leckagen auftreten. Überwachen Sie das Tier, bis sie genügend Bewusstsein zurückgewinnen, um die Brustbesinnung aufrechtzuerhalten. Bringen Sie das Tier nach vollständiger Genesung von der Anästhesie in den Tierraum zurück.
Überwachen Sie die Tumor-Mäuse, indem Sie den Bauch in der Nähe der Milz palepating und wählen Sie die Mäuse mit orthotopischen Tumoren. Für jeden Tumor eine C-Röhre mit Tumorverdauungspuffer vorbereiten. Verwenden Sie 3 Milliliter Verdauungspuffer für Tumorfragmente unter 0,8 Gramm, um sicherzustellen, dass der Tumor vollständig verdaut ist.
Kennzeichnen Sie den Tumor mit dem Studiencode, Tumor, Maus-ID, Behandlungsgruppe und Tumorgewicht. Sammeln Sie den Tumor von der Maus. Waschen Sie den Tumor in kalten PBS und reinigen Sie das Amtuum andenten Gewebe.
Stellen Sie den Tumor in Verdauungsmedien in einen Brunnen einer sterilen 6-Well-Platte. Halten Sie den Tumor an Ort und Stelle mit steriler Pinzette oder Zange und schneiden Sie mit einem Skalpell. Schneiden Sie den Tumor gut genug, um in kleinere Stücke zu brechen.
Legen Sie nun die Tumorstücke wieder in das C-Rohr und verwenden Sie den restlichen Verdauungspuffer, um die Platte zu waschen. Übertragen Sie die Flüssigkeit in die C-Röhre und legen Sie sie bis zur Verdauung auf Eis. Schalten Sie dann den Dissoziator mit Heizungen ein.
Legen Sie die Tumordissoziation C-Rohr kopfüber in die Hülse der freien Position. Passen Sie den Status der Rohrposition von Frei auf Ausgewählt an. Wählen Sie ein Dissoziationsprogramm folgen durch die Auswahl des erforderlichen Ordners, in dem die Liste des Programms angezeigt wird.
Nach Beendigung des Programms nehmen Sie C-Rohr aus dem Dissoziator und drehen Sie kurz, um die Probe zu palettieren. Nun setzen Sie die Proben wieder auf und legen Sie sie in ein Zellsieb über einem 50 Milliliter-Rohr. Waschen Sie die Zelle durch das Zellsieb mit 10 Milliliter Waschpuffer, um eine Einzelzellsuspension zu bieten.
Nach dem Zentrifugieren des Rohres bei 300 G für 5 Minuten den Überstand entsorgen und die Zellen mit 5 Milliliter Waschpuffer wieder aufhängen. Zählen Sie lebensfähige Zellen und passen Sie die Zellkonzentration auf 1 Million Zellen pro Tube oder pro Probe an. Führen Sie Immunpanel-Design, Immunostaining und Fluoreszenz minus eine Steuerung als Detail im Textprotokoll durch.
Bereiten Sie UltraComp Perlen vor, während sich die Strömungsinstrumente aufwärmen, indem Sie sie vor dem Gebrauch gründlich wirbeln. Beschriften Sie ein separates 12 x 75-Millimeter-Probenröhrchen für jeden fluorchromen konjugierten Antikörper. Fügen Sie 100 Mikroliter Färbung Puffer zu jedem Rohr folgen durch einen vollen Tropfen der Perlen.
Fügen Sie Antikörper hinzu, und führen Sie das Färbeverfahren wie im Textprotokoll beschrieben durch. Dann 0,5 Milliliter Färbepuffer zu jedem Perlenpellet hinzufügen und über Wirbel vollständig wieder aufhängen. Legen Sie nun die PmT-Spannung der Durchflusszytometrie pro Zielgewebe für das gegebene Experiment fest.
Führen Sie die Probe durch die Probe durch die Flow-Zytometrie zur Datenerfassung, indem Sie die Singlet-Perlenpopulation pro Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung gewinnen. Legen Sie die Durchflussrate um 200 bis 300 Ereignisse pro Sekunde fest. Legen Sie die entsprechende Kompensation für einen bestimmten Fluorescein-FITC-Konjugationsantikörper mithilfe eines FL1-gegen-FL1-Punktdiagramms fest.
Platzieren Sie ein Quadrantentor, so dass sich die negativen Perlen innerhalb des unteren linken Quadranten und die positiven Perlen innerhalb des oberen oder unteren rechten Quadranten befinden. Passen Sie die Kompensationswerte an, bis die mittlere Fluoresceinintensität jeder Population ungefähr gleich ist. Wiederholen Sie diese Schritte für alle Rohre.
Fahren Sie nun mit dem Erwerb tatsächlicher Fleckenproben fort. Führen Sie den Vergütungs-Assistenten aus, und speichern Sie die Einstellung mit dem Format:datum, experiment und Ihren Initialen. Orthotopische Implantation des pankreasischen duktodalen Adenokarzinoms führte zu einem schnellen Tumorwachstum ähnlich dem bei subkutaner Implantation.
Repräsentative Hämatoxylin- und Eosin-Färbungsbilder werden gezeigt und zeigen ein ähnliches Wachstum von subkutanen und orthotopischen Implantaten. Einigermaßen hohe lebensfähige Zellerträge wurden aus der Tumorprobe beider Arten der Implantation erhalten. Die repräsentative FACS-Splat zeigt lebensfähige Zellen aus Tumoren, die von den abgestorbenen Zellen und Zellablagerungen getrennt sind.
Hier gezeigt, ist ein Tumor infiltriert einen Immunprofilvergleich der Haupt- und Zählerzellpopulation mehrerer wichtiger Teilmengen von Tumorimmunzellen. Gezeigt werden subkutane versus orthotopische Homograft von Bauchspeicheldrüsenkrebs. Die Daten zeigen deutlich, dass der Tumor die Infiltration von Immunzellen im Vergleich zur Bauchspeicheldrüse gesunder Mäuse deutlich erhöht hat.
Darüber hinaus wurden verschiedene Prozentsätze von Tumor infiltrierenden Immunzell-Untergruppen in orthotopischen versus subkutanen Homograften gefunden. Beispielsweise gibt es im orthotopischen als in subkutanen Zellen deutlich mehr B-Zellen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, alle zugehörigen Materialien und Reagenzien im Voraus vorzubereiten.
Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie FACS-Analysen für murine Modelle durchführen.
