Diese Forschung demonstriert einen neuartigen Ansatz zur Untersuchung von Blinddarmkrebstherapeutika und Pathobiologie in einem präklinischen Umfeld. Diese Methoden könnten auf breiterer Basis auf die Untersuchung anderer Malignome anwendbar sein. Blinddarmkrebs ist aufgrund seiner geringen Inzidenz in Abwesenheit eines Blinddarms bei Mäusen zur Krankheitsmodellierung schwer zu untersuchen.
Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Zellinteraktionen innerhalb der Tumormikroumgebung. Diese Methode kann angewendet werden, um die Biologie verschiedener Krebsarten zu untersuchen, die dazu neigen, in das Omentum zu metastasieren, wie z. B. Darm- und Eierstockkrebs. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Transport- und Kulturmedien.
Nach der Ankunft des Gewebes wird das Tumorgewebe des Pseudomyxoma peritonei in 35 vollständige DMEM-Gewebe mit Schalen mit einem Durchmesser von sechs Zentimetern überführt. Entfernen Sie nicht nur verflüssigten Schleim oder stark schleimige Geweberegionen, sondern auch Gewebe, das sich nur schwer mit einem Skalpell schneiden lässt. Tumorgewebeknötchen grob in einen Würfel Zentimeter kleinere Stücke schneiden.
Für die Agarosepräparation und Gewebeeinbettung wird am selben Tag eine 5%ige Lösung der niedrigschmelzenden Agarose in PBS ohne fötales Kälberserum oder FBS hergestellt, wenn das Gewebe eintrifft. Geben Sie die flüssige 5%ige Agarose-Lösung in die sechs Zentimeter großen Schalen mit zwei bis drei kleineren Tumorproben, bis sie die Probe bedeckt. Legen Sie die eingebetteten Taschentücher für 30 Minuten in einen Kühlschrank bei vier Grad Celsius.
Demontieren Sie die Gewebeproben auf dem Vibratom, nehmen Sie die erstarrte Schnecke aus dem Kühlschrank und schneiden Sie die Agarosewürfel mit einem Skalpell etwas größer als die Breite des Gewebes. Tragen Sie Sekundenkleber auf die Vibratomstufe auf und legen Sie den Agarosewürfel zum Fixieren vorsichtig ein bis zwei Minuten lang auf den Sekundenkleber. Befestigen Sie die Klinge am Vibratom und stellen Sie die Dicke des Gewebeabschnitts auf etwa 150 bis 250 Mikrometer ein, um eine optimale nachgeschaltete Bildgebung zu gewährleisten.
Um die Gewebeschnitte zu kultivieren, bereiten Sie eine durchlässige Einlegeplatte vor, indem Sie zwei Milliliter des vollständigen DMEM-Mediums oberhalb der permeablen Membran und drei Milliliter unterhalb der permeablen Membran hinzufügen. Heben Sie anschließend die Gewebescheiben mit einem dünnen Pinsel vorsichtig aus der Schneidkammer des Vibratoms und legen Sie zwei bis vier Scheiben in durchlässige Kulturschalen mit komplettem DMEM. Kultivieren Sie die Scheiben bis zu sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid.
Während des Medienaustauschs fügen Sie alle 24 Stunden Bortezomib als Kontrollen für die Zelltötung und testbare Chemotherapien 5-Fluorouracil oder 5-FU zu den Nährmedien hinzu, um eine pharmakologische Intervention durchzuführen. Legen Sie Tumorschnitte für die konfokale Bildgebungsanalyse in eine einzelne Vertiefung einer 12-Well-Schale, die PBS mit 1 % FBS enthält. Für Kalzium-Bildgebungsexperimente werden die Scheiben anstelle von PBS in einer extrazellulären Kalziumlösung inkubiert.
Färben Sie Proben mit bildgebenden Farbstoffen, um die Lebensfähigkeit von Gewebeschnitten zu bestimmen. Nach Zugabe des Viabilitätsfarbstoffs 10 Minuten bis eine Stunde inkubieren. Übertragen Sie die Scheiben nach der Inkubation in eine Petrischale mit optisch klarem Glasboden, die PBS mit 1 % FBS enthält, um sie für die Bildgebung auf einem konfokalen Bildgebungsgerät zu verwenden.
Schneiden Sie ein kleines Stück vom Ende einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze ab, um die Öffnung zu erweitern und eine kräftige mechanische Dissoziation durch Pipettieren zu ermöglichen. Inkubieren Sie die Scheiben bei 37 Grad Celsius unter Drehung für fünf bis 15 Minuten in einem Milliliter Verdauungspuffer, wobei das Gewebe während der Inkubation zwei- bis dreimal durch mechanische Dissoziation stark aufgebrochen wird. Sobald das Gewebe verdaut ist, übertragen Sie das aufgebrochene Gewebe mit Verdauungsmedien auf einen 70-Mikrometer-Filter, der auf einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen platziert ist.
Größere Stücke mit einer sterilen Pinzette oder einer Pipette entnehmen. Zerdrücken Sie mit dem stumpfen Ende einer Fünf-Milliliter-Plastikspritze alle größeren, nicht dissoziierten Scheiben und waschen Sie sie mit vier Millilitern PBS, das 2 % FBS enthält. Nehmen Sie den dissoziierten Zellüberstand und zentrifugieren Sie ihn fünf bis 10 Minuten lang bei 300 G.
Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit einem Milliliter PBS, das 2 % FBS enthält. Um die Probe für die Durchflusszytometrie vorzubereiten, fügen Sie den Blockierungspuffer mit 50 Mikrolitern humanem FC-Block hinzu und inkubieren Sie ihn 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Führen Sie eine extrazelluläre Färbung mit den entsprechenden Antikörpern in 50 Mikrolitern PBS mit 2 % FBS durch.
Aliquotieren Sie fünf Milliliter Komplettmedien für Kontroll- und Behandlungsbedingungen. Auf die zwei bis vier Scheiben, die auf die durchlässigen Schalen gelegt werden, werden die Medien aus den Aliquoten der Kontrollbehandlung und die zusätzlichen Kombinationstherapien hinzugefügt, die für die nachgeschaltete Viabilitäts- und Lebendtotanalyse verwendet werden sollen. Lassen Sie die Gewebeschnitte zwei bis fünf Tage lang in einer Kultur, die vollständiges DMEM enthält, und wechseln Sie dabei alle zwei Tage das Medium sowie Bortezomib und 5-FU.
Für die lumineszierende Viabilitätsanalyse geben Sie 500 Mikroliter PBS in eine 12-Well-Schale und übertragen die nacheinander aufeinander abgestimmten Gewebescheiben mit einem Pinsel oder einer Ein-Milliliter-Pipette in die PBS-Lösung. Entfernen Sie das PBS aus den Scheiben. Fügen Sie 500 Mikroliter der lumineszierenden Viabilitätslösung pro Bedingung hinzu und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang mit einer langsamen Drehung auf dem Schüttler bei Raumtemperatur, bevor Sie die Lumineszenz mit einem Lumineszenzplattenleser ablesen.
Die Muzinfärbung in Gewebeschnitten wurde mittels periodischer Säureverschiebungsfärbung und muzinspezifischer Antikörper visualisiert. Die Inkubation in Calcein AM und Propidiumiodid bestimmte die Gesundheit und Lebensfähigkeit. Die Zellkerne überlappten die Zellen, die sich während der Kultur vermehrten.
Diese Ergebnisse wurden quantifiziert, um die Anzahl der proliferierenden Zellen innerhalb des Tumorschnitts zu bestimmen. Die Scheiben inkubierten CD11b PE konjugierten Antikörper und Fluo-4 AM markierten die lokalen Immunzellen in CTU. Pseudofarbenskalierte Bilder, die den intrazellulären Kalziumspiegel zeigten, ermöglichten die Visualisierung unterschiedlicher Konzentrationen von intrazellulärem Kalzium.
Die Spontanaktivität vor, während und nach der interzellulären Kalziumantwort innerhalb der hervorgehobenen CD11b-positiven Immunzelle wird hier gezeigt. Die rohen Spuren von Kalziumantworten in der CD11b-Immunzelle, zusammen mit anderen responsiven und nicht-responsiven Zellen, wurden quantifiziert. Repräsentative Ergebnisse der Immuntypisierung einer Patiententumorprobe mit Pseudomyxoma peritonei sind hier dargestellt.
Die Quantifizierung des Tumorimmunprofils zeigte, dass die Spenderprobe 337 hohe Konzentrationen von M2-Makrophagen aufweist, was darauf hindeutet, dass die Verwendung von aus Pseudomyxoma peritonei gewonnenen Gewebeschnitten die Abfrage der einzigartigen zellulären Spenderlandschaft der Patiententumorproben ermöglichte. Die Pharmakotypisierung und die nachgelagerte Analyse von Gewebeschnitten aus humanem Gewebe des Pseudomyxoma peritonei zeigten die Abtötung von Zellen in Tumorschnitten, was durch Zytotoxizitätsanalysen und konfokale Tunnelbildgebung bestätigt wurde. Als Reaktion auf das Zytostatikum Bortezomib und 5-Fluorouracil.
Die Lumineszenz-Viabilitätsanalyse wurde mit sequenziell abgestimmten Schichten durchgeführt. Die erfolgreiche Herstellung von Schnitten aus muzinösen Tumoren erfordert eine sorgfältige Präparation und Entfernung von zellulären und azellulären Gewebebestandteilen wie Fett und dichtem Bauchwandgewebe. Diese Technik kann die Modellierung von Interaktionen zwischen Krebszellen und mehreren Zelltypen in der Tumormikroumgebung ermöglichen, wie z. B. Interaktionen zwischen Fett-, Gefäß- und Immunzellen.
