Name: measuring gene expression in bombarded barley aleurone layers with increased throughput
Uploaded: 2018-03-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
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Die Autoren danken Greyson Butler und Margaret Barrett für Hilfe bei der Durchführung der Experimente, Judy Stone für die Beratung über Korn Homogenisierung und Lynn Hannum für Beratung bei Fluorometry. Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (IOB 0443676), durch eine institutionelle Development Award (IDeA) aus dem National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health unter Grant-Nummer P20GM0103423 und durch Zuschüsse unterstützt. die Colby College Division der Naturwissenschaften.

1. Vorbereitung der Effektor und Reportergen konstruiert
<ol><li>Effektor-Konstrukte, die konstitutiven Promoter (z. B. Mais Ubiquitin, UBI) beschäftigen Laufwerk Ausdruck aus einem gewünschten offenen Leseraster zu bauen. Beispielsweise erstellen Sie ein Plasmid mit UBI::TaABF1 Antrieb stark konstitutive Ausdruck des TaABF15.</li>
	<li>Reporter-Konstrukte, die der Veranstalter enthalten, deren Aktivität gemessen werden, soll, zu bauen, platziert einen offenen Leserahmen, wie GUSvorgeschaltet. Beispielsweise erstellen Sie ein Plasmid mit HVA1::GUS zur Messung der Ausdruck aus der HVA1 Veranstalter2,5.</li>
	<li>Aufbau eines internen Kontrollsystems Konstrukt (z. B. UBI::Luciferase).</li>
	<li>Mit einer Kieselsäure verbindlichen Spalte Protokoll (siehe Tabelle der Materialien), aller erforderlichen Genkonstrukte qualitativ hochwertige Plasmid vorbereiten. Mit UV-Spektroskopie (siehe Tabelle der Materialien), sorgfältig messen die Konzentration der einzelnen Plasmid-Vorbereitung.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Gerstenkörner für die Bombardierung
<ol><li>Richten Sie eine Tabellenkalkulation (siehe Abbildung 1 für ein Beispiel) unter Angabe der Plasmide, die bombardiert werden, die entsprechenden Hormonbehandlungen und andere relevante Informationen für jede Behandlung, die Teil des Experiments werden.</li>
	<li>Ein Schneidebrett mit einer sterilen Rasierklinge abgeschnitten die Embryonen aus Körnern des Himalaya Gerste (40 für jede Behandlung in das Experiment einbezogen). Schließen Sie Körner aus, die verfärbten oder wesentlich kleiner als der Durchschnitt sind.</li>
	<li>Legen Sie die embryoless Körner in einer 50 mL-Tube. 40 mL Wasser und Fels für 10 Minuten hinzufügen.</li>
	<li>Gießen Sie das Wasser sorgfältig (um nicht zu verlieren Körner) und 40 mL 10 % Bleichmittel. Rock für 20 Minuten.</li>
	<li>Gießen Sie das Bleichmittel und geben Sie 40 mL sterilem Wasser hinzu. Rock für 5 Minuten. Wiederholen Sie diese steriles Wasser waschen noch viermal.</li>
	<li>40 mL Imbibing Lösung (20 mM Natrium Succinat, 20 mM-Kalzium-Chlorid, pH 5,0) zugeben und 40 μl der Stammlösung Chloramphenicol (10 mg/mL).</li>
	<li>Saugende Lösung (mit Chloramphenicol) aus der Tube in ein Vermiculit Platte übertragen (siehe Tabelle der Materialien). Übertragen Sie dann die Körner auf die Oberfläche des nassen Filterpapiers in Vermiculit Platte. Die Körner gleichmäßig verteilt. Gießen Sie in genügend saugende Lösung weiterhin die Körner teilweise (aber nicht vollständig) getaucht. Legen Sie den Deckel auf die Vermiculite-Platte.</li>
	<li>Inkubieren Sie die embryoless Körner bei 24 ° C für ca. 48 h mit Leuchtstoffbeleuchtung. Fügen Sie zusätzliche Imbibing Lösung als notwendig.</li>
	<li>Öffnen Sie eine 90 mm Kunststoff Petrischale und gießen Sie selbst und 20 mL in der umgekehrten Deckel 20 mL Imbibing Lösung in die Schüssel. Fügen Sie jeweils 20 μl von Chloramphenicol (10 mg/mL hinzu). Zwei Paare der feinen Spitze Zange durch Eintauchen in Alkohol zu sterilisieren.</li>
	<li>Legen Sie ein paar der embryoless Körner in den Deckel der Petrischale. Entfernen Sie mit der Pinzette, vorsichtig (transparent) Samenschale aus jedem Korn. Beschädigen Sie beim Entfernen der Samenschale von der glatten Seite des Getreides nicht die darunter liegenden Zellen (Aleuronschicht). Übertragen Sie das geschälte Korn auf der Petrischale mit saugende Lösung.</li>
	<li>Nach dem peeling die Samenschale aller Körner, kehren sie an die Vermiculite-Platte. 16-20 Stunden inkubieren Sie die geschälten embryoless Körner bei 24 ° C.</li>
	<li>Nur vor die Körner für die Bombardierung, entfernen Sie Oberflächenfeuchtigkeit durch Schütteln sie zwischen Filterpapiere in einer Petrischale.</li>
</ol>3. Vorbereitung der Plasmid-DNA für die Bombardierung
<ol><li>Beschriften Sie eine 1,5 mL-Tube für jede Behandlung, die in der Bombardierung Experiment aufgenommen werden. Hinzufügen jedes Rohr 2,5 µg von UBI::Luciferase interne Kontrolle Plasmid, 2,5 µg Plasmid ein GUS -Reporter und die gewünschte Menge (in der Regel 0,025 µg zu 2,5 µg) ein Effektor-Plasmid. Fügen Sie Wasser hinzu, um das Gesamtvolumen zu 5 µL zu bringen.</li>
	<li>Bereiten Sie 1,6 µm gold-Microcarriers (siehe Tabelle der Materialien) Protokolle6veröffentlicht.</li>
	<li>Fügen Sie für jede Behandlung 50 µL abgehängte Microcarriers in der 1,5 mL Tube mit Plasmid DNA hinzu. Mantel der Microcarriers mit Plasmid DNA gemäß des Herstellers Protokolle6.</li>
	<li>Im letzten Schritt wenn Plasmid-beschichtete Microcarriers werden in 48 µL 100 % Ethanol, Pipettieren 8 μL der abgehängten Microcarriers auf jede der fünf Macrocarriers und sie an der Luft lassen trocknen.</li>
</ol>(4) Teilchen-Bombardement von Embryoless Gerstenkörner
<ol><li>Richten Sie die Partikel Bombardement-Apparat (siehe Tabelle der Materialien)6.</li>
	<li>Eine Berstscheibe 1550 Psi in den Sicherungsring Deckel aufgelegt und es auf dem Instrument.</li>
	<li>Platzieren Sie ein Macrocarrier, enthält die gewünschte Plasmid-Kombination (zusammen mit einer Stopp-Bildschirm) in das Microcarrier Start Baugruppe. Fügen Sie die Assembly in den oberen Steckplatz der Bombardierung Kammer. Legen Sie den Abstand zwischen der Berstscheibe, Beibehaltung der GAP und der Macrocarrier Deckel im standard Abstand (6 mm), und legen Sie die anhalten-Screen-Unterstützung an der (standard) mittlere Position, so dass eine Macrocarrier-Reise-Entfernung von 11 mm (Abbildung 2A).</li>
	<li>8 embryoless Körner in einem engen radiale Muster (mit den dünneren enden nach innen zeigen) auf ein Filterpapier-Kreis, der sich flach auf den Deckel einer 90 mm Petrischale mit Klebeband ist zu vereinbaren (siehe Abb. 2 b).</li>
	<li>Legen Sie die Schale mit den Körnern in die Bombardierung Kammer, in einem Abstand von 6 cm vor dem Bildschirm anhalten.</li>
	<li>Evakuieren Sie die Bombardierung Kammer bis 95 kPa zu und dann bombardieren Sie die Probe.</li>
	<li>Übertragen Sie nach der Veröffentlichung des Vakuums bombardiert Körner auf einer beschrifteten 60 mm Petrischale mit 4 mL Imbibing Lösung enthält 1 mg/ml Chloramphenicol.</li>
	<li>Wiederholen Sie, bis alle die Bombardierungen durchgeführt wurden. 24 Stunden (auf einer schütteln Plattform bei 100 u/min) bei 24 ° C inkubieren.</li>
</ol>(5) Extraktion von löslichen Proteinen aus bombardiert Körner
<ol><li>Mit Pinzette, einer 60 mm Petrischale 8 bombardierten Körner entnehmen und sie auf einem Papiertuch trocken tupfen. Teilen Sie die Körner in zwei beschriftete 2,0 mL Röhrchen (4 Körner pro Röhre) jeweils 800 μl Schleifen Puffer (100 mM Na-Phosphat pH 7,2, 5 mM DVB-t, 10 µg/mL Leupeptin, 20 % Glycerin) und eine 5 mm Edelstahl Perle. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle bombardiert Körner.</li>
	<li>Setzen Sie die zwei Racks mit Wulst-Homogenisator (bis zu 48) 2,0 mL Röhrchen (siehe Tabelle der Materialien). Montieren Sie die Regale an den Homogenisator.</li>
	<li>Schütteln Sie die Proben bei 30 Hz, für 3 Minuten.</li>
	<li>Der Homogenisator entfernen Sie Homogenisatoren Racks und legen Sie sie auf dem Eis (5 min) die Proben wieder abkühlen lassen.</li>
	<li>Montieren Sie die Regale zurück auf den Homogenisator - in der entgegengesetzten Richtung. Die Proben wieder bei 30 Hz 3 Minuten schütteln.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Regale auf Eis, kühlen Schritte 5,3 bis 5,5. Dies wird auf insgesamt 12 Minuten schütteln addieren.</li>
	<li>Die Korn-Extrakte bei 16.000 x g bei 4 ° C für 10 Minuten zentrifugiert.</li>
	<li>
Sofort nach der Zentrifugation Dekantieren klares Überstände in einen zweiten Satz von Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie jedes Rohr eine schnelle Wirbel. Speichern Sie die Rohre auf dem Eis.</li>
	<li>Erholen Sie nach der Übertragung des Überstands, die Stahlkügelchen aus den Pellets gewaschen und wiederverwendet werden können.</li>
</ol>6. Messung der Luciferase Aktivität aus Korn-Extrakten
<ol><li>Für jedes Rohr von Korn-Extrakt, untersucht werden, bereiten ein 12 x 75 mm Test Glasrohr mit 200 μL der Luciferase Assay Mischung (45 mM Tris Sulfat pH 7,7, 15 mM MgCl2, 20 mM DVB-t, 1,5 mM EDTA, 1 mM Luciferin, 1 mM ATP).</li>
	<li>Der erste Test Tube 100 μL der ersten Getreide-Extrakt hinzufügen. Vortex: schnell, gut mischen. Sofort setzen Sie das Rohr in die Rohrhalter die Luminometer und schließen Sie die Tür. Wenn die Messung abgeschlossen ist, entfernen Sie das Rohr aus Luminometer – ließ die Tür offen für die Platzierung der nächsten Röhre.</li>
	<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Proben gemessen wurden.</li>
</ol>7. Messung des GUS-Aktivität aus Korn-Extrakten
<ol><li>Geben Sie 200 μL der GUS Testpuffer (50 mM Na-Phosphat pH 7,2, 2,5 mM 4-Methylumbelliferyl - D-Glucuronid, 10 mM DTT, 2 mM EDTA, 10 µg/mL Leupeptin, 20 % Methanol, 0,02 % Natriumazid) in jeweils einer 96-well-Platte.</li>
	<li>Platz 50 μL jeder Korn-Extrakt in das entsprechende gut. Mischen Sie mit der Spitze nach dem hinzufügen. Dichten Sie oben mit Film Abdichtung ab.</li>
	<li>20 Stunden inkubieren Sie der 96-well-Platte bei 37 ° C im Dunkeln.</li>
	<li>Die 96-well-Platte bei 4.000 x g bei 4 ° C für 10 Minuten Zentrifugieren und auf Eis legen.</li>
	<li>Geben Sie 250 μl 0,2 M Na2CO3 in jeder schwarz 96-well-Platte.</li>
	<li>Hinzufügen von 6,25 μL jeder zentrifugiert GUS-Assay-Mischung in das entsprechende gut (mit 0,2 M Na2CO3) des schwarzen 96 gut Platte. Mischen Sie mit der Spitze nach dem hinzufügen. Gehören Sie Brunnen mit 6,25 μL von 10 μm, 40 μm und 100 μm 4-Methylumbelliferone als Standards.</li>
	<li>Die schwarze Platte in eine Platte Fluorometer und lesen Sie die Fluoreszenz des Methylumbelliferone zu. Nehmen Sie die Messwerte bei einer Erregung Wellenlänge von 360 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm. Die Gewinn des Instruments so eingestellt, dass ein gut mit 6,25 μL 40 μM 4-Methylumbelliferone und 250 μl 0,2 M Na2CO3 eine Lesung von 1000 Fluoreszenz Einheiten gibt.</li>
</ol>8. die Datenanalyse
<ol><li>Geben Sie die Werte für die Luciferase und GUS Assays in eine Tabellenkalkulation. Ausschließen von der Betrachtung einer Probe mit einer Luciferase-Lesung von weniger als 20.000 relative Lumineszenz Einheiten s-1, da dies zeigt, dass die Genkonstrukte nicht erfolgreich auf die Aleuronschicht Zellen geliefert wurden.</li>
	<li>Für jedes erfolgreich bombardiert Korn Extrakt (als Vertreter einer Gruppe von vier embryoless Körner), den normalisierten GUS Ausdruck aus den GUS und Luciferase Rohdaten wie folgt zu berechnen: normalisiert GUS = [(Ausdruck der GUS - GUS leer) x (2.000.000)] / (Luciferase Ausdruck – Luciferase leer). Hinweis: Dies normalisiert sich die Menge der GUS-Aktivität, was in einem Bombardement beobachtet haben würde, die eine Luciferase-Lesung von 2.000.000 gab.</li>
	<li>Bericht der relativen Ebene der Ausdruck eines bestimmten Reporter-Konstrukts in Anwesenheit von Effektor Konstrukte oder Hormonbehandlungen von im Vergleich zu der Ebene des Ausdrucks in der Abwesenheit von Effektoren oder Hormone getestet.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chen, K., An, Y. Q. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+responses+to+gibberellin+and+abscisic+acid+in+barley+aleurone.">Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone.</a> J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).</li><li>Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gibberellin+response+complex+in+cereal+alpha-amylase+gene+promoters.">A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters.</a> Plant Cell. 4, 203-211 (1992).</li><li>Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Einführung der Effektor gen konstruiert über Teilchen-Bombardement, gefolgt von transienten Expression Reporter Konstrukte ist eine sinnvolle Strategie für die Rolle von bestimmten Akteuren in GA/ABA Signalisierung und das daraus resultierende Hormon reguliert gen sezieren Ausdruck. Allerdings sind die vorhandenen Protokolle für solche Experimente in Gerste Aleuronschicht Zellen2,3,4,5</su...

Die Aleuronschicht Gerste ist eine gut etablierte Modellsystem für das Studium der Hormon-regulierten Genexpression in Pflanzen1. Insbesondere werden eine Reihe von Genen, die für die Keimung oder frühe Sämling-Entwicklung durch Gibberellin (GA), aktiviert, während Gene zugeordnete Stressreaktionen durch Abscisic Säure (ABA) aktiviert werden. GA und ABA Signalwege sind miteinander verflochten, wie der Ausdruck einiger GA-aktivierten Gene von ABA und umgekehrt1gehemmt wird.
Eine sinnvolle Strategie für Verständnis, dass die Rolle von bestimmten Akteuren bei der Signalisierung GA/ABA wurde die Einführung der Effektor Genkonstrukte über Teilchen-Bombardement, gefolgt von transienten Expression Reporter Konstrukte, mit denen den daraus resultierende Effekt auf nachgeschalteten Genexpression bestimmt werden. Die Verwendung von Reporter-Gene wie GUS (β-Glucuronidase) oder Luciferase ermöglicht die sensible und quantitative Messung der Genexpression speziell innerhalb der Zellen, die die Effektor-Konstrukt erhalten haben. Zum Beispiel festgestellt die Einführung eines Effektor-Konstrukts Codierung der Transkriptionsfaktor TaABF15,6 , dass ABA-induzierten Genen wie HVA1 von TaABF1, beim GA-induzierten Genen wie Amy32b induziert werden werden unterdrückt. Teilchen-Bombardement als experimentelle Strategie wurde von mehreren Labors untersuchen verschiedene Aspekte des GA/ABA Signalisierung verwendet. Diese Arbeit führte zur Identifizierung der Promotor Elemente wichtig für die Aktivierung des GA-induzierte2 und ABA-induzierten Genen3und zur Entdeckung von Protein Kinasen4 und Transkription Faktoren5 , die Regeln der Expression dieser Gene.
Die vorhandenen Protokolle2,3,4,5,6 für Teilchen-Bombardement und Folgebewertung von transiente Genexpression sind sehr arbeitsintensiv, wie jede Gruppe von bombardiert kaum Getreide wird von Hand in einem Mörser und Stößel homogenisiert und die Enzym-Assays werden individuell durchgeführt. Diese Handschrift berichtet eine verbesserte Protokoll, das teilweise automatisiert und rationalisiert die Homogenisierung Schritt und der GUS assays um deutlich mehr Durchsatz ermöglichen eine größere Anzahl von Behandlungen im gleichen Experiment getestet werden bei schönem und/oder die Aufnahme von mehr Wiederholungen für jede Behandlung mehr statistisch solide Ergebnisse zu erzielen. Repräsentative Ergebnisse sind für den Ausdruck von HVA1 und Amy32b Reporter Konstrukte, reguliert durch den Transkriptionsfaktor TaABF1 sowie GA, ABA und andere regulatorische Moleküle dargestellt.

<table><tbody><tr><td>GeneElute HP plasmid Maxiprep kit</td><td>Sigma</td><td>NA0310-1KT</td><td></td></tr><tr><td>UV-vis spectrophotometer</td><td>Nanodrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Himalaya barley grains</td><td>/</td><td>/</td><td>A variety of hulless barley (store in the dark at 4&amp;deg; C)</td></tr><tr><td>sodium succinate</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td>Reagent for Imbibing Solution</td></tr><tr><td>calcium chloride (dihydrate)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Reagent for Imbibing Solution</td></tr><tr><td>Imbibing Solution</td><td>home made</td><td>/</td><td>20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use.</td></tr><tr><td>chloramphenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol.</td></tr><tr><td>vermiculite</td><td>Fisher</td><td>NC0430369</td><td>Used for vermiculite plates.</td></tr><tr><td>filter paper circles (90 mm)</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation</td></tr><tr><td>Vermiculite Plates</td><td>home made</td><td>/</td><td>Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave.</td></tr><tr><td>forceps (fine pointed)</td><td>Fisher</td><td>13-812-42</td><td>Used for removing seed coat from barley grains.</td></tr><tr><td>forceps (ultra fine point)</td><td>Fisher</td><td>12-000-122</td><td>Used for removing seed coat from barley grains.</td></tr><tr><td>gold microcarriers (1.6 &amp;mu;m)</td><td>BioRad</td><td>1652264</td><td></td></tr><tr><td>macrocarriers</td><td>BioRad</td><td>1652335</td><td></td></tr><tr><td>calcium chloride (dihydrate)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20&amp;deg; C.</td></tr><tr><td>spermidine</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td>Prepare a 100 mM stock solution and store 500 &amp;mu;L aliquots at -20&amp;deg; C (use within 2 months).</td></tr><tr><td>rupture discs (1550 psi)</td><td>BioRad</td><td>1652331</td><td></td></tr><tr><td>stopping screens</td><td>BioRad</td><td>1652336</td><td></td></tr><tr><td>macrocarrier holders</td><td>BioRad</td><td>1652322</td><td></td></tr><tr><td>Biolistic particle delivery system</td><td>BioRad</td><td>PDS-1000/He</td><td></td></tr><tr><td>sodium phosphate monobasic monohydrate</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2</td></tr><tr><td>sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma</td><td>S9763</td><td>Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2</td></tr><tr><td>1M sodium phosphate pH 7.2</td><td>home made</td><td>/</td><td>Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2.</td></tr><tr><td>dithiothrietol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>43819</td><td>Dissolve in water to 1 M. Store at -20&amp;deg; in 1 mL aliquots.</td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20&amp;deg; C.</td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Prepare a 50% solution in water.</td></tr><tr><td>Grinding Buffer</td><td>home made</td><td>/</td><td>Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 &amp;mu;L of 1 M DTT, 100 &amp;mu;L of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL.</td></tr><tr><td>stainlesss steel beads (5 mm)</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td>This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer.</td></tr><tr><td>bead homogenizer (TissueLyser)</td><td>Qiagen</td><td>85210</td><td></td></tr><tr><td>12mm x 75 mm glass test tubes</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>luciferin</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-100</td><td>Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20&amp;deg; C.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td>Prepare a 100 mM stock solution and store 250 &amp;mu;L aliquots at -20&amp;deg;&amp;nbsp;C.</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.</td></tr><tr><td>sulfuric acid</td><td>Sigma</td><td>258105</td><td>Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.</td></tr><tr><td>1M Tris sulfate pH 7.7</td><td>home made</td><td>/</td><td>Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid.</td></tr><tr><td>magnesium chloride</td><td>Sigma</td><td>M9397</td><td>Dissolve in water to 2 M.</td></tr><tr><td>Luciferase Assay Buffer (LAB)</td><td>home made</td><td>/</td><td>Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 &amp;mu;L of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 &amp;mu;L of 0.5 M EDTA. Add water to 50&amp;nbsp;mL.</td></tr><tr><td>Luciferase Assay Mixture</td><td>home made</td><td>/</td><td>Combine 15 mL of LAB, 800 &amp;mu;L of 25 mM luciferin, 200 &amp;mu;L of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20&amp;nbsp;mL) for 100 luciferase assays.</td></tr><tr><td>luminometer (Sirius)</td><td>Berthold</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>4-methylumbelliferyl-&amp;beta;-D-glucuronide (MUG)</td><td>Goldbio</td><td>MUG1</td><td>Dissolve in DMSO to 100 mM.</td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20&amp;deg; C.</td></tr><tr><td>96 well plates (standard)</td><td>Fisher</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>GUS assay buffer</td><td>home made</td><td>/</td><td>Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 &amp;mu;L of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 &amp;mu;L of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL.</td></tr><tr><td>TempPlate sealing film</td><td>USA Scientific</td><td>2921-1000</td><td></td></tr><tr><td>96 well plates (black)</td><td>Costar</td><td>3916</td><td></td></tr><tr><td>sodium carbonate</td><td>Sigma</td><td>S7795</td><td>Prepare a 200 mM solution in water.</td></tr><tr><td>4-methylumbelliferone</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td>Prepare a 100 &amp;mu;M solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20&amp;deg;&amp;nbsp;C.</td></tr><tr><td>microplate fluouresence reader</td><td>Bio-Tek</td><td>FLX-800</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring gene expression in bombarded barley aleurone layers with increased throughput

Die Aleuronschicht Gerstenkörner ist ein wichtiges Modellsystem für Hormon-regulierten Genexpression in Pflanzen. In Aleuronschicht Zellen Gene benötigt zur Keimung oder frühe Sämling-Entwicklung werden aktiviert, indem Gibberellin (GA), während Gene zugeordnete Stressreaktionen durch Abscisic Säure (ABA) aktiviert werden. Die Mechanismen der GA und ABA Signalisierung können abgefragt werden, durch die Einführung von Reporter Genkonstrukte in Aleuronschicht Zellen über Teilchen-Bombardement, mit den daraus resultierenden transiente Expression mit Enzym-Assays gemessen. Eine verbesserte Protokoll wird berichtet, dass teilweise automatisiert und rationalisiert das Korn Homogenisierung Schritt und die Enzym-Assays, wodurch deutlich mehr Durchsatz als bestehende Methoden. Homogenisierung der Getreide Proben erfolgt über eine automatisierte Gewebe-Homogenisator und GUS (β-Glucuronidase) Assays werden mit Hilfe einer 96-Well-Platte-System durchgeführt. Repräsentative Ergebnisse über das Protokoll legen nahe, dass Phospholipase D Tätigkeit eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der HVA1 Genexpression von ABA, durch den Transkriptionsfaktor TaABF1 spielen kann.

Die hier beschriebene Technik kann verwendet werden, jeder Test Genkonstrukt in Aleuronschicht Zellen der Gerstenkörner einzuführen. Dann kann die Ebene des Ausdrucks aus dem Test-gen bequem gemessen (Abbildung 2). Die höheren Durchsatz Protokoll hier beschriebenen stark erhöht die Effizienz der Samen Schleifen und Enzym-Assay-Schritte. Diese Methode wurde zur Beurteilung der Fähigkeit der Transkription Faktor TaABF15,<...

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Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Eine verbesserte Protokoll ist für die Messung der transiente Genexpression von Reporter Konstrukte in Gerste Aleuronschicht Zellen nach Bombardement Teilchen vorgestellt. Die Kombination von automatisierten Getreide mahlen mit 96-Well-Platte Enzym-Assays bietet hohen Durchsatz für das Verfahren.

Messung der Genexpression in bombardierten Gerste Aleuronschicht Schichten mit erhöhter Durchsatz

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

6.4K Aufrufe.  Colby College. Eine verbesserte Protokoll ist für die Messung der transiente Genexpression von Reporter Konstrukte in Gerste Aleuronschicht Zellen nach Bombardement Teilchen vorgestellt. Die Kombination von automatisierten Getreide mahlen mit 96-Well-Platte Enzym-Assays bietet hohen Durchsatz für das Verfahren.

Serie: Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the gene is regulated by the particular timing of one of many stimuli, signaling pathways or secondary effects. In order to capture the entire gene expression response to hypoxia in the yeast S. cerevisiae, RNA-seq analysis was used to monitor the mRNA levels of all genes at specific times after exposure to hypoxia. Hypoxia was established by growing cells in ~100% N2 gas. Importantly, unlike other hypoxic studies, ergosterol and unsaturated fatty acids were not added to the media because these metabolites affect gene expression. Time points were chosen in the range of 0 - 4 h after hypoxia because that period captures the major changes in gene expression. At each time point, mid-log hypoxic cells were quickly filtered and frozen, limiting exposure to O2 and concomitant changes in gene expression. Total RNA was extracted from cells and used to enrich for mRNA, which was then converted to cDNA. From this cDNA, multiplex libraries were created and eight or more samples were sequenced in one lane of a next-generation sequencer. A post-sequencing pipeline is described, which includes quality base trimming, read mapping and determining the number of reads per gene. DESeq2 within the R statistical environment was used to identify genes that change significantly at any one of the hypoxic time points. Analysis of three biological replicates revealed high reproducibility, genes of differing kinetics and a large number of expected O2-regulated genes. These methods can be used to study how the cells of various organisms respond to hypoxia over time and adapted to study gene expression during other cellular responses.

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Here, we present a protocol using RNA-seq to monitor mRNA levels over time during the hypoxic response of S. cerevisiae cells. This method can be adapted to analyze gene expression during any cellular response.

Messung der mRNA-Niveaus im Laufe der Zeit während der Hefe S. Cerevisiae hypoxischen Antwort

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Forschung

Genetik

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae Beschriftung mit 4-Thiouracil und Quantifizierung der metabolischen synthetisiert neu mRNA als Proxy für RNA-Polymerase II Aktivität

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Isolation of High Purity Tissues from Developing Barley Seeds

Understanding the mechanisms regulating the development of cereal seeds is essential for plant breeding and increasing yield. However, the analysis of cereal seeds is challenging owing to the minute size, the liquid character of some tissues, and the tight inter-tissue connections. Here, we demonstrate a detailed protocol for dissection of the embryo, endosperm, and seed maternal tissues at early, middle, and late stages of barley seed development. The protocol is based on a manual tissue dissection using fine-pointed tools and a binocular microscope, followed by ploidy analysis-based purity control. Seed maternal tissues and embryos are diploid, while the endosperm is triploid tissue. This allows the monitoring of sample purity using flow cytometry. Additional measurements revealed the high quality of RNA isolated from such samples and their usability for high-sensitivity analysis. In conclusion, this protocol describes how to practically dissect pure tissues from developing grains of cultivated barley and potentially also other cereals.

Here we present a protocol for high purity manual isolation and quality control of embryo, endosperm and seed maternal tissues during entire barley seed development.

Understanding the mechanisms regulating the development of cereal seeds is essential for plant breeding and increasing yield. However, the analysis of ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality RNA is often hindered by high starch and sugar content. These compounds can reduce both the yield and the quality of the extracted total RNA. The deterioration in quantity and quality of total RNA can subsequently have a significant impact on the downstream transcriptomic analyses, which may not accurately reflect the spatial and/or temporal variation in the gene expression profile of the samples being tested. In this protocol, we describe an optimized method for extraction of total RNA with sufficient quantity and quality to be used for whole transcriptome analysis of cereal grains. The described method is suitable for several downstream applications used for transcriptomic profiling of developing, germinating, and mature cereal seeds. The method of transcriptome profiling using a microarray platform is shown. This method is specifically designed for gene expression profiling of cereals with described genome sequences. The detailed procedure from microarray handling to final quality control is described. This includes cDNA synthesis, cRNA labelling, microarray hybridization, slide scanning, feature extraction, and data quality validation. The data generated by this method can be used to characterize the transcriptome of cereals during germination, in various stages of grain development, or at different biotic or abiotic stress conditions. The results presented here exemplify high-quality transcriptome data amenable for downstream bioinformatics analyses, such as the determination of differentially expressed genes (DEGs), characterisation of gene regulatory networks, and conducting transcriptome-wide association study (TWAS).

A method for transcriptome profiling of cereals is presented. The microarray-based gene expression profiling starts with the isolation of high-quality total RNA from cereal grains and continues with the generation of cDNA. After cRNA labelling and microarray hybridization, recommendations are given for signal detection and quality control.

Beschaffung hochwertiger Transkriptomdaten von Getreidesamen durch eine modifizierte Methode zur Genexpressionsprofilierung

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Biochemie

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Globale Genexpressionsanalyse Mit einem Zebrafisch Oligonukleotid-Microarray-Plattform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Biologie

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Robotik und Dynamic Image Analysis für Studies of Gene Expression in pflanzlichen Geweben

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a fluorescently tagged-protein of interest is transiently expressed in plant tissue following biolistic delivery of its encoding DNA construct. The intra- and intercellular distribution of the tagged protein is then analyzed by confocal microscopy. We describe this technology in detail, providing step-by-step protocols to assay and evaluate the extent of symplastic protein transport in three plant species, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana and N. tabacum (tobacco).

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Macromolecular trafficking between plant cells can be assessed by transiently expressing a fluorescently-tagged protein of interest and analyzing its intra- and intercellular distribution by confocal microscopy.

Ein Cell-to-cell Makromolekulare Transport Assay In Planta Verwendung Biolistic Bombardment

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

Hefestamm-Phänotypisierung mit Droplet-basierter RNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Biotechnik

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...