Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen optimierten experimentellen Ansatz zur Isolierung embryonalen Gewebes von wachtelnden und Hühnerembryonen zu präsentieren. Mit dieser Technik erhalten wir reines embryonales Gewebe, das in Genexpressionsstudien und funktionellen Assays verwendet werden kann. Gewebe aus Wachtel- und Hühnerembryonen werden durch Mikrochirurgie isoliert und unterliegen der in vitro enzymatischen Verdauung unter Beibehaltung ihrer biologischen Eigenschaften.
Nach der Isolierung können die dreidimensionalen konservierten Gewebe für die analyse der topografischen Genexpressionsmuster mit hoher Auflösung verwendet werden. Dieser Ansatz ist besonders nützlich für die Detaillierung der In-situ-Genexpression in embryonalen Gebieten, die sonst mit herkömmlichen Methoden nicht zugänglich sind. Darüber hinaus können Transkriptomanalyseansätze auch in isolierten Geweben angewendet werden, ohne dass genetische Marker erforderlich sind, während gleichzeitig eine gewebespezifische omische Analyse mit hohem Durchsatz durchgeführt wird.
Alternativ können die isolierten Gewebe beider Arten 48 Stunden lang in einem in vitro organotypischen Assay assoziiert werden. Dieser Ansatz ermöglicht es, Gewebewechselwirkungen zu untersuchen, da Wachtel- und Hühnerzellen durch unterschiedliche kerntechnische Merkmale und molekulare Marker diskriminiert werden können. Die Fähigkeit des Kulturgewebes, Organe zu bilden, kann durch ovo assay weiter getestet werden.
Diese Methode ist daher ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung komplexer Gewebeinteraktionen in Entwicklungsprozessen mit hochdynamischen räumlichen Modifikationen und kann auch dazu beitragen, das Potenzial bestimmter embryonaler Gebiete für die Bildung von Organen aufzuzeigen. Als Beispiel wird hierin die Bildung von Wachtelhuhn-chimärem Thymus aus isolierten embryonalen Geweben beschrieben. Erstens, das Endoderm des dritten und vierten Pharyngealbeutels, wird das prospektive thymische Rudiment aus der Rachenregion der Wachtelembryonen mit drei Tagen Entwicklung isoliert.
Dann wird dieses Gewebe mit einem Mesenchym assoziiert, das seine Entwicklung unterstützen kann, das Somatopleura-Mesoderm. Schließlich wird die heterospezifische Assoziation von Geweben in vitro und in ovo zu einem chimaherthymus kultiviert. Führen Sie alle Eimanipulationsverfahren unter sterilen Bedingungen mit einer horizontalen laminaren Durchflusshaube und sterilisierten Instrumenten und Materialien durch.
Befruchtete Wachteleier wurden mit nach oben gerichteter Luftkammer inkubiert. Um zu beginnen, entfernen Sie die Wachteleier aus dem Brutkasten. Bereiten Sie eine große Borosilikat-Glasschüssel mit kaltem PBS gefüllt.
Mit gebogener Schere ein kreisförmiges Loch in die Schale eines Wachtelei mit drei Tagen Inkubation tippen und schneiden. Machen Sie das Loch in der gegenüberliegenden Seite des Eis stumpf, und übertragen Sie das Eigelb auf die Schüssel mit kalten PBS. Entfernen Sie den Embryo aus dem Eigelb, indem Sie die Vitelline-Membran extern in extraembryonale Gefäße schneiden.
Mit Hilfe von dünnen Zangen, übertragen Sie den Embryo in eine kleine Schüssel mit kalten PBS gefüllt, dann bewegen Sie den Embryo auf eine Petrischale mit schwarzer Basis mit einem Abschäumer. Entfernen Sie den Pharyngealbereich, der den dritten und vierten Pharyngealbeutel enthält, wie in der vorherigen Jove SPA Ligation beschrieben. Dann übertragen Sie den dritten und vierten Rachenbogenbereich in ein Glas, das mit kaltem Pankreatin gefüllt ist und eine Stunde lang auf Eis zur enzymatischen Verdauung brüten.
Beachten Sie, dass die Inkubationszeit der enzymatischen Verdauung vom Entwicklungsstadium abhängt. Legen Sie die Glasschale unter das Stereomikroskop und isolieren Sie das Endoderm aus dem dritten und vierten Rachenbogenbereich, indem Sie zwei Mikroskalpell in einem Halter verwenden. Stellen Sie zunächst den Pharyngealbereich mit der Dorsalseite nach oben, der intern das Endoderm und das Ektoderm in der äußeren Oberfläche zeigt.
Beobachten Sie den Ektoderm, das Endoderm, das Mesenchym, das Herzrohr und den ventralen Teil des Neuralrohrs. Entfernen Sie das Neuralrohr und das Mesoderm, das an der dorsalen Oberfläche des pharyngealen Endoderms befestigt ist. Beobachten Sie das Endoderm des Rachens, den vierten und dritten Pharyngealbeutel und das Herzrohr.
Mit der dorsalen Seite nach oben, vorsichtig lösen und entfernen Sie das Mesenchym zwischen den Rachenbögen und setzen Sie die Pharyngealbeutel. Führen Sie dieses Verfahren auf der anderen Seite des Rachenbereichs aus. Entfernen Sie das Mesenchym, das am hintersten Teil des Endoderms befestigt ist, und beobachten Sie den vierten Pharyngealbeutel.
Mit hinteren Seiten nach oben, beobachten Sie sowohl links und rechts vierten Pharyngeal Beutel. Fahren Sie fort, indem Sie das Mesenchym entfernen, das am hintersten Teil des Endoderms und am zweiten Beutel befestigt ist. Entfernen Sie das Herzrohr und das Mesenchym, das die Innenbeutel umgibt.
Mit der ventralen Seite nach oben, beobachten Sie den Rachen Endoderm und die rechte Seite des zweiten Pharyngealbogens. In diesem Stadium sollte das Endoderm der Schilddrüsenrudiment sichtbar sein. Lösen Sie das Ektoderm des zweiten und dritten Pharyngealbogens und entfernen Sie vorsichtig das Mesenchym der Bögen.
Beobachten Sie die Entfernung des Mesenchym des zweiten Rachenbogens auf der rechten Seite. Beachten Sie die Lage des vierten und dritten Beutels und Schilddrüsenrudiment. Entfernen Sie die Überreste an mesenchymalen Zellen, die an den Pharyngealbeuteln befestigt sind.
Beobachten Sie den dritten und vierten Beutel der rechten Seite und den vierten Beutel von der linken Seite. Wiederholen Sie die Mesenchym-Ablösung der linken Seite. Beobachten Sie nun den dritten Beutel der linken Seite.
Beobachten Sie mesenchyme Ablösung des zweiten Bogens auf der linken Seite. Beachten Sie, dass alle Oberflächen und Lösungen während dieses Vorgangs kalt gehalten werden sollten. Wechseln Sie zu einer neuen kalten Pankreatin-Lösung und Schale im Falle einer langen Zeit, um das Gewebe zu sezieren.
Schließlich machen Sie einen transversalen Schnitt zwischen dem zweiten und dritten PharyngealBeutel, um die zweiten Beutel und die Schilddrüsenrudiment zu entfernen. An dieser Stelle besteht das isolierte Endoderm aus dem dritten und vierten Rachenbeutel und der hinteren Spitze des Rachens. Entfernen Sie die Überreste gelöst Mesenchym mit Hilfe von zwei Mikroskalpellen.
Übertragen Sie das isolierte Endoderm auf eine Glasschale, die mit kaltem fetalem Rinderserum gefüllt ist, und halten Sie es während der Herstellung des In-vitro-Assays auf Eis. Die Eier wurden in horizontaler Position platziert und die obere Seite für die Verwendung einer Holzkohle markiert. Um zu beginnen, entfernen Sie die Eier aus dem Brutkasten.
Mit einer gekrümmten Schere ein kleines Loch in der Schale öffnen, eine Nadel einsetzen und zwei Milliliter Albumin mit einer 10-Milliliter-Spritze ansaugen. Öffnen Sie ein kreisförmiges Loch im markierten Bereich der Schale und schneiden Sie die Vitelline-Membran extern zu den zusätzlichen embryonalen Gefäßen, während Sie den Embryo mit dünnen Zangen halten. Unter einem Stereomikroskop legen Sie den Embryo in eine Petrischale mit schwarzer Basis, die kalte SPBS enthält.
Verwenden Sie vier Insektenstifte, um den Embryo an der Unterseite der Platte zu halten. Platzieren Sie die Stifte in der extraembryonalen Region und bilden sie eine quadratische Form. Führen Sie zwei Schnitte zwischen den Soden 19 und 24 transversal zur Embryoachse durch und kreuzen Sie den Embryo.
Lassen Sie diesen Abschnitt los, indem Sie die randalen embryonalen Kanten schneiden. Beobachten Sie die seitliche Platte, das Neuralrohr und die Soden. Aspirieren und übertragen Sie das Gewebe auf eine Glasschale mit kaltem Pankreatin gefüllt.
30 Minuten auf Eis für die enzymatische Verdauung inkubieren. Isolieren Sie unter dem Stereomikroskop das Mesoderm aus den umgebenden Geweben mit zwei Mikroskalpellen in Haltern. Beobachten Sie das Somatopleura-Mesoderm, die Splanchnopleura, das Neuralrohr und das Ektoderm.
Entfernen Sie zunächst das Ektoderm an der Oberfläche. Beobachten Sie das somatopleura mesoderm, das vom Ektoderm getrennt ist. Dann lösen Sie vorsichtig die ventrally lokalisierten Splanchnopleura von der Somatopleura.
Beobachten Sie das rechte seitliche Mesoderm der Somatopleura. Lassen Sie es los, indem Sie es in einer parallelen Bewegung zum Neuralrohr schneiden. Beachten Sie, dass alle Oberflächen und Lösungen während dieses Vorgangs kalt gehalten werden sollten.
Wechseln Sie zu einer neuen kalten Pankreatin-Lösung und Schale im Falle einer langen Zeit, um das Gewebe zu sezieren. Beobachten Sie das linke laterale Mesoderm der Somatopleura, soes, Neuralrohr und Ektoderm. Wiederholen Sie die mesoderm-Veröffentlichung dieser Seite.
Machen Sie langsame Bewegungen mit dem Mikro-Skalpell. Die exponierten extrazellulären Matrixproteine sitzen durch Gewebe und Instrumente und verhindern Flüssigkeitsbewegungen. Schneiden Sie die Somatopleura vorsichtig in einer parallelen Bewegung zum Neuralrohr.
Übertragen Sie das isolierte Mesoderm auf eine Glasschale, die mit kaltem fetalem Rinderserum gefüllt ist, und halten Sie es während der Herstellung von In-vitro-Assays auf Eis. Legen Sie einen feinmaschigen Metallrost in eine Petrischale und füllen Sie es mit Kulturmedium. Entfernen Sie die übermäßigen Flüssigkeiten, um die mittlere Oberfläche mit der Oberseite des Rostes zu nivellieren.
Mit Hilfe von dünnen Zangen, tauchen Sie einen Membranfilter in das Kulturmedium und legen Sie ihn vorsichtig auf die Oberseite des Rostes, um eine Oberfläche in Kontakt mit ihr zu haben. Übertragen Sie unter dem Stereomikroskop das isolierte Endoderm von der Glasschale durch sanftes Gleiten mit Hilfe von Spachtel und dünnen Zangen auf den Membranfilter. Wiederholen Sie diesen Vorgang für das isolierte Mesoderm.
Mischen Sie mit Hilfe eines Mikroskalpells das Gewebe, um seine Assoziation zu maximieren. Stellen Sie das zugehörige Gewebe 48 Stunden lang vorsichtig in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad mit 5% CO2. Nach der Inkubationszeit transplantieren Sie das Kulturgewebe auf die Membran des Coriolan-Typs und lassen Sie es sich für weitere 10 Tage oval entwickeln, um die Organbildung wie zuvor beschrieben abzuschließen.
Hier ist die Netzmethode, die die Isolierung von aviären embryonalen Geweben in verschiedenen experimentellen Ansätzen verwendet werden kann. Als Beispiel wurde die Expression von Genen, von denen bekannt ist, dass sie an der Bildung der Pharyngealbeutel beteiligt sind, auch ein isoliertes Endoderm bewertet, das das zweite, dritte und vierte Pharyngealbeutel aus Hühnerembryonen am embryonalen Tag dreieinhalb durch ganze Mount-in-situ-Hybridisierung enthält. Die Expression von Sonic Hedgehog wurde im Endoderm des zentralen Rachens nachgewiesen und aus den Beuteln ausgeschlossen, während BMP7 im Endoderm des zweiten und dritten Pharyngealbeutels ausgedrückt und vom zentralen Rachen- und vierten Pharyngealbeutel ausgeschlossen wurde.
Isoliertes Gewebe kann auch 48 Stunden lang in vitro in vitro in vitro assoziiert werden, auf die Membran des Coriolan-Typs transplantiert werden und sich für weitere 10 Tage entwickeln. Explanten können durch konventionelle Histologie und Immunhistochemie analysiert werden. Einige repräsentative Ergebnisse der Assoziation von Wachtelendoderm aus dem dritten und vierten Pharyngealbeutel mit Huhn somatopleura mesoderm sind die folgenden-Grafts zeigten einen voll ausgebildeten chimären Thymus mit Wachtel abgeleiteten thymischen Epithelzellen positiv für QCPN und Huhn Lymphoidzellen.
Darüber hinaus zeigte Cytokeratin-positives thymisches Epithel normale morphologische Merkmale, die eine typische Retikulusarchitektur aufweisen. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie wachteln und Embryonalgewebe von Hühnern isolieren können, die in Genexpressionsstudien verwendet werden können und durch die Bildung von chimerischen Organen auch dazu beitragen können, die Komplexität der Organgenetik zu entschlüsseln.
