Dieser Assay ermöglicht es dem Schüler, bestimmte Moleküle in vielen Entwicklungsprozessen zu betrachten, wie z.B. Zelldifferenzierung und Morphogenese, indem die Perlen in verschiedene Embryoregionen implantiert werden. Dieses Protokoll kann auf alle experimentellen Tiermodelle, Zellkulturen, organotypischen Modelle, einschließlich Organoide, angewendet werden. Darüber hinaus ist es ein hilfreiches pädagogisches Werkzeug, um den Schülern grundlegende Entwicklungsbiologie beizubringen.
Das Verfahren wird Alexandra Gonzales-Gonzales, eine Studentin des Labors, demonstrieren. Um zu beginnen, brüten Sie die befruchteten weißen Livorner-Hühnereier vertikal mit der spitzen Seite nach unten in einem befeuchteten Inkubator bei 38 Grad Celsius und 70% relativer Luftfeuchtigkeit. Sobald sie die 28. Stufe erreicht haben, so Hamburger und Hamilton, entfernen Sie die Eier aus dem Inkubator, tauschen Sie sie mit 70% Ethanol aus und lassen Sie sie an der Luft trocknen.
Desinfizieren Sie dann den Arbeitsbereich, die Mikroskope und Instrumente mit 70% Ethanol. Als nächstes kerzen Sie die Eier, um Blutgefäße zu identifizieren und den Embryo zu lokalisieren. Verwerfen Sie Eier, die keinen Embryo haben.
Öffnen Sie mit dem Ende einer nicht gezahnten Pinzette ein Fenster, indem Sie auf das stumpfe Ende eines Eies tippen, und entfernen Sie einen um einen Quadratzentimeter großen Schalenabschnitt. Dann geben Sie das Ei in einen Karton oder Plastikhalter und legen Sie es unter das Stereomikroskop. Entfernen Sie mit einer feinen chirurgischen Pinzette jedes kleine Stück Eierschale, das den Embryo berühren könnte, und entfernen Sie die Luftmembran, indem Sie es durchstechen und herausziehen.
Als nächstes reißen Sie mit einer feinen chirurgischen Pinzette den Fruchtsack leicht und achten Sie darauf, das Gefäßsystem der Chorioallantousmembran nicht zu beschädigen. Setzen Sie die Embryonen in-ovo ein, um festzustellen, ob sie sich im gewünschten Stadium befinden. Für die Affi-Gel-Heparin-Perlenzubereitung schneiden Sie einen quadratischen Parafilmabschnitt so ab, dass er in eine 45-Millimeter-Petrischale passt.
Nachdem Sie den Parafilm über den Boden der Petrischale gelegt haben, drücken Sie mit dem Ende der nicht gezähnten Pinzette jeden Scheitelpunkt und fixieren Sie ihn am Boden der Schale. Als nächstes übertragen Sie die Perlen mit einer Pipette oder einem Spatel in ein Mikrozentrifugenröhrchen und waschen sie zweimal mit PBS, indem Sie sie absetzen lassen und den Überstand pipettieren lassen. Übertragen Sie dann mit einer Mikropipette 40 bis 50 Perlen in die Mitte der mit Parafilm bedeckten Petrischale.
Wählen Sie unter einem Mikroskop 30 Affi-Gel- oder Heparin-Perlen mit einem Durchmesser von 100 Mikrometern aus. Bewerten Sie die Perlen mit einer dritten Ziffer eines 28-stufigen Embryos als Referenz. Die Perle muss kleiner als die Zwischenziffer sein.
Nachdem Sie das überschüssige PBS, das die ausgewählten Perlen umgibt, vorsichtig entfernt haben, tränken Sie sie in zwei bis fünf Mikrolitern der Behandlungslösung. Inkubieren Sie die Perlen in der Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Um zu verhindern, dass die Perlen austrocknen, pipettieren Sie während der Inkubation ein paar Tropfen PBS oder Wasser um die Perlen, um die lokale Atmosphäre zu befeuchten, und bedecken Sie die Schale mit Parafilm, um die Verdunstung zu verlangsamen.
Gießen Sie AG1X2 Perlenzubereitung. Verwenden Sie den Spatel, um die Perlen in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen und fügen Sie 50 Mikroliter der Behandlungslösung in der gewünschten Endkonzentration hinzu. Nachdem Sie die Röhrchen mit Folie umwickelt haben, um sie vor Licht zu schützen, inkubieren Sie die Perlen 20 Minuten lang bei langsamem Schütteln.
Nach der Inkubation entfernen Sie mit einer Pipette so viel von der Behandlungslösung wie möglich in Fleck mit 0,2% in Wasser gelöstem Phenolrot für zwei Minuten mit leichtem Rühren in einem Wirbel. Entfernen Sie nach dem Färben den Farbstoff und waschen Sie die Perlen zweimal in PBS, um den Restfarbstoff zu entfernen. Als nächstes bringen Sie mit einer Mikropipettenspitze 40 bis 50 AG1X2-Perlen in die Mitte der mit Paraform bedeckten Petrischale und tränken die Perlen in fünf Mikrolitern PBS.
Wählen Sie dann unter einem Mikroskop etwa 30 Perlen mit einem Durchmesser von 100 Mikrometern aus. Tauchen Sie die ausgewählten Perlen in die experimentelle Lösung mit ein paar Tropfen PBS oder Wasser um die Perlen herum, um die lokale Atmosphäre zu befeuchten. Decken Sie die Schale mit Parafilm ab, um die Verdunstung zu verlangsamen.
Bevor Sie die Embryonen manipulieren, ordnen Sie zwei Stereomikroskope nebeneinander auf einer Tischplatte an. Erstellen Sie dann mit einer nicht gezahnten Pinzette ein Fenster in den verbleibenden Eiern. Als nächstes reißen Sie unter dem Mikroskop die Fruchtmembran in der Nähe der rechten Hinterextremität mit feinen chirurgischen Pinzetten.
Halten Sie den Embryo mit einer feinen Pinzette an der Fruchtschleimhaut fest, um die rechte Hintergliedmaße freizulegen. Machen Sie dann mit einer feinen Wolframnadel ein Loch, das in der Entfernung zentriert istfast der dritten Ziffer des Hintergliedmaßes. Ohne den Embryo und die freigelegte Hinterbein freizusetzen, nehmen Sie eine behandelte Perle aus dem anderen Mikroskop mit einer der Spitzen der Pinzette.
Die Pinzette muss offen sein, damit eine Perle an ihrer Spitze haften kann. Übertragen Sie die Perle in den Kükenembryo in der Nähe des Hintergliedmaßes und positionieren Sie sie oben auf dem Zwischenloch. Üben Sie Druck auf die Perle aus, indem Sie die Pinzette schließen, bis sie in das Loch eintritt.
Lassen Sie dann den Embryo los, versiegeln Sie das Eierschalenfenster mit Klebeband und bringen Sie die Eier in den Inkubator zurück, bis sie das erforderliche Stadium erreicht haben. Um die Wirksamkeit des Assays zu gewährleisten, muss die Perle konsistent und präzise an der richtigen Stelle platziert werden. In dieser Studie wurde die durchnässte Perle in der disistfast der dritten Ziffer unter dem apikalen ektodermalen Kamm platziert.
Die Embryonen können mit Ozeanblau und Alizarinrot gefärbt werden, um die Bildung von Skelettelementen nachzuweisen und die Auswirkungen auf die Zelldifferenzierung zu bewerten. Dieser Assay eignet sich auch gut zur Beurteilung des Zelltods mit neutraler Rot- und Genregulation und zum Kauf einer C2-Hybridisierung. Der Hauptvorteil dieses experimentellen Werkzeugs besteht darin, die Zeit und den Ort der getränkten Perlen zu kontrollieren.
Die Kombination der Kernpositionierung mit präzisem Entwicklungstiming bietet enorme Möglichkeiten, Zelldifferenzierungsprozesse zu untersuchen.
