In letzter Zeit ist die Rolle der zerebralen Pericyten in neurologischen Störungen und Gehirnfunktion offensichtlich geworden. Daher ist die Entwicklung einer zuverlässigen Kulturmethode für diese Zellen unerlässlich. Unser Protokoll zur Extraktion von murinen zerebralen Pericyten stellt ein zuverlässiges Werkzeug für In-vitro-Studien und für die Bereitstellung von Pericyten mit hoher Reinheit und Zellausbeute dar.
Demonstrieren das Verfahren mit Anupriya Mehra wird Lucie Dehouck, eine Technikerin aus meinem Labor. Beginnen Sie, indem Sie das Gehirn von einem spezifischen pathogen-freien vier bis sechs Wochen alten männlichen C57BL/6 Maus auf einem sterilen trockenen fusselfreien Tuch und mit gebogenen Spitzenzange, um das Kleinhirn, Striatum und okzipitalen Nerven zu entfernen. Verwenden Sie einen Wattestäbchen, um alle sichtbaren Hirnhähnen zu entfernen und das Hirngewebe auf den Kopf zu stellen.
Öffnen Sie die Lappen mit leichten Nachteilen nach außen und entfernen Sie alle sichtbaren Blutgefäße. Dann legen Sie das Meninges-freie Hirngewebe in eine 100-Millimeter-Petrischale mit 15 Milliliter kaltem Waschpuffer B.To homogenisieren das Gewebe, übertragen Sie die Hirnprobe in ein Dounce-Gewebeschleifer-Mörtelrohr und fügen Sie drei bis vier Milliliter Waschpuffer B in die Röhre. Verwenden Sie einen lockeren Stößel, um das Gewebe 55 Mal zu zerkleinern, dann spülen Sie den Stößel mit Waschpuffer B und Hacken der Gewebeschlämme mit einem engen Stößel 25 Mal.
Am Ende der Homogenisierung, ebenso aliquot die Gülle zwischen zwei 50 Milliliter Röhren und fügen Sie 1,5 mal das Volumen der kalten 30%rinder Serum albumin dextran. Dann die Rohre kräftig schütteln, um die Gülle zu mischen. Um die Gefäßfraktion zu isolieren, sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und übertragen Sie die Überstande in zwei neue Röhren.
Das Pellet im Waschpuffer B auf Eis aufbewahren. Die Pellets in drei Milliliterkaltem Waschpuffer B auf Eis wieder aufhängen. Zentrifugieren Sie die geernteten Überräube und wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
Entsorgen Sie die Überräube und setzen Sie die Pellets in drei Milliliter Waschpuffer B.Dann bündeln Sie die resuspendierten Pellets und bringen Sie das Endvolumen der gepoolten Zellsuspension auf 10 Milliliter mit frischem Kaltwaschpuffer B. Trennen Sie die Zellen mit einer 10-Millimeter-Pipette sechsmal, bis keine verbleibenden Klumpen von Pellets sichtbar sind, und verwenden Sie eine Vakuumfilter-Baugruppe und ein Nylon-Mesh-Sieb, um die Zellsuspension zu filtern. Legen Sie das Sieb in eine Petrischale und löschen Sie das Netz mit frischem Waschpuffer B und Kratzen, um kapillare zu bergen. Führen Sie dann eine zweite Filtration mit einem frischen Filter durch.
Teilen Sie das Filtrat gleichmäßig zwischen zwei Röhren auf und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Nach dem Wegwerfen der Überwärte die Pellets in einem einzigen Rohr mit vorgewärmten Waschpuffer B mit Enzymen bündeln und vorgewärmte Collagenase/Dispase in das Rohr geben. Legen Sie die Röhre in ein schütteltisches Wasserbad für genau 33 Minuten bei 37 Grad Celsius, bevor Sie die Reaktion mit 30 Milliliter kaltwaschenden Puffer B.Collect die Zellen durch Zentrifugation stoppen und den Überstand vorsichtig entsorgen.
Das Pellet im Waschpuffer B sechsmal schnell, aber sorgfältig wieder aussetzen und die Suspension wieder zentrieren. Nach dem Wegwerfen des Überstandes das Pellet in 18 Millilitern komplettem DMEM-Medium wieder aufsetzen und zwei Milliliter Zellsuspension in kompletter DMEM in neun Brunnen von drei Matrigel-beschichteten Sechs-Brunnen-Platten säen. Legen Sie die Zellkulturen 24 Stunden lang in einen sterilen 37 Grad Celsius 5%Kohlendioxid-Inkubator, bevor Sie die Trümmer von jedem Brunnen sorgfältig entfernen und frische DMEM-Medien hinzufügen.
Nach 48 Stunden, ändern Sie das Medium in jedem Brunnen alle 48 Stunden. Am tagachten bis zehnten Tag, wenn die Zellen 100% Konfluenz erreichen, durchgehen die Zellen in Pericytkultur medium auf neue gelatinebeschichtete Sechs-Brunnen-Platten und geben die Zellen für weitere sechs bis sieben Tage mit Überwachung an den Zellkultur-Inkubator zurück. Dann teilen Sie die Zellen wieder an Tag 17 in Pericytmedium in neue Gelatine beschichtete Platten.
Von Durchgang Null bis Durchgang zwei gibt es spezifische morphologische Merkmale, durch die die Endothelzellen und die anschließende allmähliche Zunahme der Pericyten identifiziert werden können. In einer Passage Null Kultur, längliche Endothelzellen aus Mikrogefäßen entwickeln sind in Hülle und Fülle. Diese Fülle wird nach Durchgang eins reduziert und fehlt nach Durchgang zwei.
Im Gegenteil, Pericyten erscheinen als seltene vierseitige Zellen in frühen Kulturen und werden durch Durchgang zwei reichlich vorhanden. Die Bewertung der Expression von NG2, CD146 und PDGFR Beta kann verwendet werden, um die Reinheit der Pericytkultur durch quantitative PCR, Immunzytochemie und Western Blot zu bewerten. Die Enzymverdauung ist ein entscheidender Schritt für den Erfolg des Protokolls.
Achten Sie darauf, die Enzymkonzentrationen und inkubationszeit streng zu überwachen.
