Unter mehreren vorhandenen Protokollen zur Gewebeaufbereitung für die Transmissionselektronenmikroskopie haben wir Methoden ausgewählt, die eine optimale strukturelle Konservierung und hochauflösende Mikrographen liefern, um die morphometrische Analyse der synaptischen Vesikonverteilung an präsynaptischen Klemmen durchzuführen. Die mit diesen Methoden erhaltenen kontrastreichen Bilder ermöglichen es, Parameter wie die Entfernung synaptischer Vesikel von der präsynaptischen Membrananzahl von Vesikeln, die an der präsynaptischen Membran und den Intervesikleabständen angedockt sind, zu quantifizieren. Alle diese Parameter sind bezeichnend für die synaptische Funktion.
Da Veränderungen in der räumlichen Organisation von synaptischen Vesikeln mit der Störung der synaptischen Funktion verbunden sein können, wurden diese Methoden verwendet, um die Auswirkungen von Vollnarkose auf die synaptische Entwicklung zu untersuchen. Diese Methoden könnten auch verwendet werden, um die Auswirkungen eines Medikaments oder einer Behandlung auf die detaillierte Morphologie von Synapsen zu untersuchen, um Einblicke in ihre Funktion zu geben. Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Osmiumtetroxid für die Postfixierung von Rattenhirnabschnitten, die zuvor mit Paraformaldehyd und Glutaraldehyd mittels vaskulärer Perfusion fixiert wurden.
Die Abschnitte werden nach der Behandlung mit Osmiumtetroxid starr. Daher erfordert die Gewebehandhabung von da an Aufmerksamkeit. Auch, vor dem Hinzufügen von Osmium, stellen Sie sicher, dass Ihre Abschnitte abgeflacht werden, da jede Falte wahrscheinlich zu Gewebefraktur führen wird.
Öffnen Sie eine Fünf-Milliliter-Glasampulle von 4%Osmium-Tetroxid und Wasser und lassen Sie es in eine braune Glasflasche fallen. Fügen Sie fünf Milliliter 0,2 Molphosphatpuffer hinzu und fügen Sie dann weitere 10 Milliliter 0,1 Molarphosphatpuffer hinzu, um eine endgültige Lösung von 1% zu erzielen. Verwenden Sie eine 20-Milliliter-Spritze mit einer langen Nadel, um das 1%osmiumtetroxid zu erstellen und dann das Osmiumtetroxid in ein braunes Glas mit Aluminiumfolie zu geben.
Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Probe entfaltet und abgeflacht wurde, fügen Sie 1%Osmiumtetroxid und 0,1 Molar PB in die Durchstechflasche der Probe ein. Inkubieren Sie die Probe in Osmiumtetroxid für eine Stunde bei Raumtemperatur. Extrahieren Sie das Osmiumtetroxid mit einem Mikropipet nach der Inkubation fertig ist, und spülen Sie die Abschnitte, wie im Protokoll beschrieben.
Um Uranylacetat zuzubereiten, legen Sie einen 200 Milliliter volumenmäßigen Glaskolben mit 100 Millilitern 70%Ethanol auf eine Rührplatte. Vier Gramm Uranylacetat in den Kolben geben, eine Aluminiumfolie umwickeln, um einen Ausfällungsversuch durch Licht zu verhindern und kontinuierlich umzurühren. Dehydrieren Sie die Abschnitte in 50%Ethanol.
Mit dem vorbereiteten 4%uranylacetat für eine Stunde und folgen mit serieller Dehydrierung und Spülung, wie im Manuskript beschrieben. Entfernen Sie den Spritzenkolben von einer 60-Milliliter-Spritze und verkappen Sie ihn mit einer Sicherheitsnadel. Positionieren Sie die Spritze mit der offenen Seite nach oben und fügen Sie jede Zutat des Harzes nacheinander hinzu.
Beenden Sie, indem Sie 525 Mikroliter DMP30 mit einer Pipette hinzufügen. Das Verschieben des Kolbens der Pipette sehr langsam als DMP ist sehr zäh. Legen Sie den Kolben wieder in die Spritze.
Invertieren Sie die Spritze ein paar Mal, um den Inhalt zu mischen. Die Farbe ändert sich von gelb zu gelb. Evakuieren Sie die Luft in der Spritze.
Dann legen Sie es auf eine Wippe mit kontinuierlichem Schütteln für mindestens 30 Minuten. Fügen Sie ein Volumen Epoxidharz und ein Volumen Aceton zu einer Szintillationsdurchstechflasche hinzu und schütteln Sie sie zum Mischen. Tragen Sie dieses eine auf ein Harz auf Aceton-Mischung auf dem Gewebeabschnitt nach der letzten Acetonspülung bedeckt, um Acetonverdunstung zu vermeiden.
Die Ein-zu-eins-Mischung aus Harz und Aceton nach zwei bis vier Stunden entfernen und vier Stunden lang durch Vollharz ersetzen. Legen Sie alle Harzabfälle in einen Sammelbehälter unter die Haube, um sie zu polymerisieren und später zu entsorgen. Zwei rechteckige Stücke aus klarer Polychlortrifluorethylenfolie schneiden und mit 70% Ethanol abwischen.
Schneiden Sie sie so, dass sich auf jeder Seite des Abschnitts mindestens 1,5 Zentimeter gewebefreier Kunststoff befinden, um sicherzustellen, dass sie die gleiche Breite haben, aber die Höhe des Blattes oben etwa 2/3 des unteren Blattes beträgt. Neigen Sie die Durchstechflasche langsam und verwenden Sie einen feinen Kamelpinsel und einen flexiblen Mikrospachtel, um die Probe sehr sanft von unten zu heben. Dann bewegen Sie vorsichtig den Abschnitt entlang der Durchstechflasche Wände und übertragen auf das untere PCTFE-Blatt.
Überschüssiges Harz mit einem Mikrospachtel entfernen und die Probe vorsichtig mit dem Deckblatt bedecken. Schieben Sie alle eingeschlossenen Luftblasen vorsichtig heraus, ohne direkten Druck auf den Gewebebereich auszuüben und das überschüssige Harz auszulöschen. Verwenden Sie einen lösungsmittelbeständigen Stift, um die Platten zu beschriften und in einen Ofen bei 60 Grad Celsius für zwei bis drei Tage zu polymerisieren.
Ziehen Sie die sandwichierten PCTFE-Blätter vorsichtig auseinander, um sie zu öffnen. Verwenden Sie einen lösungsmittelbeständigen Stift, um die Seite des Blattes zu markieren, die den haftenden Abschnitt enthält, der es in der Nähe des Gewebes markiert. Verwenden Sie einen Scheibenstanz, um eine Kreisprobe des Abschnitts zu erhalten, um sicherzustellen, dass die Stiftmarke Teil des gestanzten Gewebes ist.
Die Stiftmarke leuchtet, wenn Licht auf die Probe scheint. Legen Sie die Kappe einer Einbettungskapsel seite nach oben auf einen Kapselhalter. Legen Sie einen Tropfen Harz auf die Kappe und legen Sie die gestanzte Scheibe in die Kappe ein, wobei der Gewebeabschnitt nach oben gerichtet ist.
Legen Sie eine Kapsel mit einer sanften Korkenzieherbewegung in die Kappe ein. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um ein bedrucktes, zwei Zentimeter langes Stück Papieretikett in die Kapsel zu rollen und zu senken, um sicherzustellen, dass es an die Krümmung der Seitenwände der Kapsel passt. Gießen Sie das Einbettharz in die Kapsel, füllen Sie bis zum Rand der Kapsel und verwenden Sie einen spitzen Holzstab, um die Gewebeprobe nach unten zu schieben.
Die Kapsel für die Polymerisation zwei bis drei Tage in den Ofen bei 60 Grad Celsius stellen. Und dann weiter mit Schnitt und Färbung, wie im Protokoll beschrieben. Elektronenmikroskopie der zufriedenstellenden Erhaltung der neuronalen Zellstruktur zeigt geschichtete Zellmembranen ohne Brüche.
Das Zytoplasma ist schließlich granular und ohne leere Räume. Mitochondrien sind weder geschwollen noch geschrumpft mit einer konservierten äußeren Doppelmembran und intakten inneren Cristae. Eine optimale Erhaltung der neuronalen Ultrastruktur und feine morphologische Details ist unerlässlich, um synaptische Vesikel zu visualisieren und deren Abstand zur präsynaptischen Membran zu messen.
Synaptische Vesikel sollten von einer ununterbrochenen Einzelmembran getrennt und gefüttert werden. Um die morphometrische Analyse der synaptischen Vesikelverteilung zu erleichtern, sollten präsynaptische und postsynaptische Membranen parallel in ihrer Kontinuität erhalten bleiben. Elektronenmikroskopie der mangelhaften Konservierung der Gewebestruktur zeigt die Verzerrung und den Bruch neuronaler Zellmembranen und das Vorhandensein deutlich vergrößerter extrazellulärer Räume.
Mitochondrien scheinen verdeint und haben geschwollene Cristae. In einem anderen Beispiel für die Mangelhafte Gewebestrukturkonservierung gab es große weiße Leerräume innerhalb des Zytoplasmas anstelle einer fein körnigen zytoplasmatischen Substanz mit vergrößerten extrazellulären Räumen. Eine künstliche Membran wie alle wahrscheinlich resultiert aus der Mobilisierung von Lipiden während der Fixierung mit Glutaraldehyd.
Bei der Arbeit junge Hirngewebe verwenden 1 Molar PhosphatPuffer als Lösungsmittel für alle Ihre Lösung, so dass Sie Tonizität so nah wie möglich an der des neugeborenen Rattengehirn halten und artefactual Gewebe Schrumpfung und oder Schwellung minimieren. Die mit diesen Methoden erhaltenen Mikrographen können verwendet werden, um die detaillierte Morphologie und die dimensionalen strukturellen Beziehungen einer Reihe von zellulären Komponenten außer synaptischen Vesikeln zu untersuchen. Zum Beispiel Mitochondrien, Golgi-Apparat und Kernchromatin.
Mehrere Schritte in diesem Protokoll erfordern Chemikalien, die giftig sein können. Arbeiten Sie immer unter einer Dunstabzugshaube und tragen Sie persönliche Schutzausrüstung beim Umgang mit Aldehyden, Osmium, Uran und Bleiverbindungen.
