Name: decellularization and recellularization methodology for human saphenous veins
Uploaded: 2018-07-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
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Wir möchten danken Professor Anders Jeppsson für Hilfe bei der Bereitstellung von Blutgefäßen in den Experimenten verwendet. Diese Studie wurde finanziert durch die LUA ALF Zuschuss an SSH.

Das Gewebe verwendet, und das Protokoll dieses Papiers folgt die ethischen Richtlinien der Universität Göteborg.
(1) Gewebe Zubereitung und Lagerung
<ol><li>Schneiden Sie das umgebende Gewebe aus der abgerufenen stammvenen mit chirurgischen Pinzetten und Scheren. Hinweis: Die stammvenen wird von der unteren Extremität des Menschen von Gefäßchirurgen durchschnitten. Die stammvenen verwendet in diesem Papier ist ein unbenutzten Teil nach Bypass-Operation.</li>
	<li>Um auslaufen zu verhindern während der Perfusion, verbinden Sie die Seitentrieben an ihren Enden mit Nahtmaterial und Zange.</li>
	<li>Halten Sie die Vene in einem 50 mL-Tube mit 40 mL der Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS). Waschen Sie die Vene durch eine Änderung PBS 2 - 3 Mal um überschüssiges Blut zu entfernen. Speichern Sie die Vene durch das Einfrieren bei-80 ° C.</li>
</ol>2. Vorbereitung des Decellularization-Setups und Recellularization Bioreaktor
Hinweis: Mit Schere, Schnitt die Silizium-Rohre, wie in Tabelle 1dargestellt.
<ol><li>
Decellularization Setup 1 (für Triton x-100-Perfusion und waschen)
	<ol>
<li>Bis 2 L Kammer (Kunststoffwanne), kleben Sie alle drei Stücke von Rohr A wie in Figur 1Adargestellt. Hinweis: Kleben Sie einen Schlauch an einer Wand, wo der Boden der Kammer (Waschmittel Eingang) berührt, und die anderen zwei Röhren an der gegenüberliegenden Wand mit einem Abstand von ca. 5-10 cm dazwischen abhängig von der Länge der Vene. Mindestens 5 cm dieser Röhren sollten auch dem Kammerboden (Vene der Einlass und Auslass) mit Klebeband befestigt.</li>
		<li>Über die männlichen und weiblichen Luer-Anschlüsse in Reihe anschließen das Waschmittel Einlass Röhre zu Röhre B gefolgt von Rohr F, Rohr C und schließlich an die Vene. Ort der Röhre F in die Kassette von der peristaltischen Pumpe ich.</li>
		<li>Nehmen Sie ein anderes Rohr C und verbinden Sie ein Ende der Vene Outlet. Legen Sie das andere Ende in das Glas mit der Grundablass Schlauch, das 45 cm über der Kammer (Waschmittel Outlet) befindet, und kleben Sie es sichern. Nehmen Sie Rohr G und schieben Sie ein Ende in der schlauchauslauf das Glasgefäß und stecken Sie das andere Ende in die Vene Kammer. Hinweis: Die Bilder der vollständigen Setup (rote Pfeile), Kammer und Fließrichtung (weisse Pfeile) sind in Abbildung 1Agezeigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Decellularization Setup 2 (für TnBP Perfusion)
	<ol>
<li>Nehmen Sie eine 1 L-Glas, und platzieren Sie ein Ende des Rohres C (Waschmittel Einlass) in das Glas, bis das Rohr das Glas Boden berührt.</li>
		<li>Schließen Sie das andere Ende an Rohr F gefolgt von Rohr C. Ort das andere Ende des Schlauches C in das Glas bis halbe Tiefe (Ader Eingang). Setzen Sie die Kassette der peristaltischen Pumpe Rohr F ich.</li>
		<li>Rohr D und schreiben ein Ende in das Gefäß (Vene Steckdose) bis halbe Tiefe und das andere Ende in das Glasgefäß mit dem unteren Schlauch 45 cm Höhe aus der Vene Einlass (Waschmittel Steckdose). Um zu sichern, kleben Sie das Waschmittel Einlass und Auslass Röhren.</li>
		<li>1 L-Glas auf einen Magnetrührer und halten Sie den Magneten in der Flasche.</li>
		<li>Nehmen Sie Rohr G und schieben Sie ein Ende auf der schlauchauslauf das Glasgefäß und stecken Sie das andere Ende in 1 L Glas. Hinweis: Das Bild des kompletten Setups (rote Pfeile), Kammer und Strömung Richtung (weisse Pfeile) ist in Abbildung 1 bgezeigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Decellularization Setup 3 (für DNase Perfusion)
	<ol>
<li>Eine 250-mL-Glasflasche und schreiben Sie beide Enden des Schlauches C. Ort der mittlere Bereich des Rohres in die Kassette der peristaltischen Pumpe II. Hinweis: Ein Ende der Röhre ist die Lösung-Bucht und das andere Ende des Schlauches ist an die Vene Einlass. Die Vene Steckdose frei in Lösung bleibt.</li>
		<li>Legen Sie das ganze Setup inklusive Pumpe bei 37 ° C. Das Bild des vollständigen Setup und Fließrichtung wird in Abbildung 1dargestellt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recellularization Bioreaktor
	<ol>
<li>Halten Sie bereit alle Teile wie in Abbildung 2Agezeigt.</li>
		<li>Wie in Abbildung 2 bgezeigt, nehmen Sie die 4-Port-Kappe und legen Sie in jedem Hafen, Rohr H (Ader Steckdose) tube ich (Medien-Eingang) und Rohr J (Ader Eingang). Stecken Sie das andere Ende des Schlauches H in der 4th Anschluss (Medienunternehmen). Hinweis: Der Blick auf die 4-Port-Kappe von oben ist in Abbildung 2gezeigt. Schneiden Sie für einfache Einfügung von Rohren die Kanten zu einer scharfen Spitze mit einer Schere.</li>
		<li>Biegen Sie das andere Ende des Schlauches J in U-Form und binden Sie es mit einer Naht. Schließen Sie die reduzierenden Stecker an den inneren Enden der Röhren H & J.</li>
		<li>Legen Sie die 60 mL-Tube mit flachem Boden in der 250 mL Glasflasche und platzieren Sie die obige gemachte Setup in das Rohr wie in Abb. 2Ddargestellt. Wie in Abbildung 2Edargestellt, schließen Sie Schläuche K, E und K in Reihe an. Schließen Sie ein K, die Vene Einlass und ein weiteres Rohr K an die Medien. Hinweis: Die schematische Darstellung des Setup und Fließrichtung ist in Abbildung 2Fgesehen.</li>
		<li>Den Bioreaktor durch Autoklavieren zu sterilisieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Vorbereitung der Lösungen
<ol><li>Lösung 1 (10 X Wasser): bis 1 L von Reinstwasser, fügen Sie 2 g Natriumazid und 18,6 g der Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA). Rühren Sie, bis die Salze gelöst sind.</li>
	<li>Lösung 2 (1 X Wasser): nehmen Sie 100 mL der Lösung 1 und 900 mL Reinstwasser.</li>
	<li>Lösung 3 (5 x Triton x-100): 950 mL Reinstwasser, hinzufügen, 50 mL von Triton x-100, 1 g Natriumazid und 9,3 g EDTA. Rühren Sie, bis aufgelöst.</li>
	<li>Lösung 4 (1 x Triton x-100): 200 mL der Lösung 3 einnehmen und 800 mL Reinstwasser.</li>
	<li>Lösung 5 (1 X TnBP): 990 mL der Lösung 2 10 mL TnBP mit einer 10 mL-Pipette hinzufügen.</li>
	<li>Lösung 6 (40 Kunitz Einheiten/mL DNase): Fügen Sie 2.000 Kunitz Einheiten der DNaseI in 50 mL Dulbeccos Phosphat-Puffer Kochsalzlösung enthält CaCl2 und MgCl2. Frisch zubereiten und sofort nutzen.</li>
	<li>Lösung 7 (PBS): Fügen Sie 24 g Natrium-Chlorid, 0,6 g Kaliumchlorid, 4,32 g Natrium Phosphat und 0,72 g Kalium Phosphat 3 L von Reinstwasser hinzu. Rühren Sie, bis aufgelöst. Den pH-Wert 7,4 einstellen. 1 L des PBS in den Autoklaven sterilisieren und getrennt zu lagern.</li>
	<li>Lösung 8 (0,1 % Peressigsäure): 50 mL sterile Lösung 7, 50 µL Peressigsäure hinzufügen. Frisch zubereiten und sofort nutzen.</li>
</ol>4. Vorbereitung der endothelialen Medium
<ol><li>5 mL L-Glutamin, 5 mL Anti-Anti, 50 mL von Humanserum AB und alle Komponenten des EGM-2 Wachstumsfaktor Kit außer fötalen Rinderserum bis 500 mL des MCDB131 Mediums unter einer sterilen Haube hinzugeben.</li>
</ol>5. Decellularization der Stammvenen
<ol><li>Die menschlichen stammvenen von-80 ° C bei Zimmertemperatur Auftauen. Wieder bei-80 ° C eingefroren und wieder bei Raumtemperatur Auftauen.</li>
	<li>Eine Biopsie von 2 mm Länge mit einer Schere ausschneiden und fixieren in Formaldehyd für 24-48 h bei Raumtemperatur. Binden Sie jedes Ende der Vene, die Widerhaken eines männlichen und weiblichen Luer-Anschluss mit einer Naht.</li>
	<li>Schließen Sie die Vene Decellularization Setup 1 und füllen Sie 1 L Lösung 2. Technologieprodukte für 15 min bei 35 mL/min leeren Sie den Inhalt des Setups.</li>
	<li>Fügen Sie 1 L Lösung 4 und Technologieprodukte für 4 h 35 mL/min. entleeren Sie den Inhalt des Setups.</li>
	<li>Fügen Sie 500 mL der Lösung 2 und Technologieprodukte für 5 min. entleeren Sie den Inhalt des Setups. Wiederholen Sie diesen Schritt. Perfusion Setup 1 trennen Sie die Vene und verbinden Sie mit Perfusion Setup 2.</li>
	<li>Fügen Sie 1 L Lösung 5, schalten die Rührer und Technologieprodukte für 4 h bei 35 mL/min. Hinweis: Lösung 5 sucht nach dem Einschalten auf die Rührer und Perfusion bewölkt.</li>
	<li>Trennen Sie die Vene von Perfusion Setup 2 und waschen Sie der Vene von innen und außen mit Spritze oder einer Pipette 10 mL in 4 Änderungen von Reinstwasser für 5-10 min.</li>
	<li>Verbinden Sie die Vene mit Perfusion Setup 3, 50 mL der Lösung 6 hinzufügen und durchspülen mit 10 mL/min in einer Kammer 37 ° C für 4 Std. leeren Sie den Inhalt des Setups und das Setup die Vene trennen.</li>
	<li>Verbinden Sie die Vene Perfusion Setup 1, füllen Sie 1 L Lösung 2 und über Nacht 35 mL/min. Wiederholen Sie Schritt 5.4 Schritt 5.9 4 mal (für eine Gesamtmenge von 5 Zyklen) durchspülen. Nehmen Sie eine Biopsie wieder wie in Schritt 5.2. Hinweis: Überspringen Schritt 5,8 zweiten Teil in Zyklen 1 und 3.</li>
	<li>Leeren Sie den Inhalt des Setups. Füllen Sie 1 L Lösung 2 und Technologieprodukte für 24 h bei 35 mL/min Änderung Lösung 2 nach 12 Uhr leeren Sie den Inhalt des Setups. Füllen Sie 1L das Reinstwasser und Technologieprodukte für 24 h bei 35 mL/min Änderung der Reinstwasser nach 12 h.Empty den Inhalt des Setups. Füllen Sie 1 L Lösung 7 und durchspülen Sie 7 nach 12 h 24 h bei 35 mL/min Änderung Lösung.</li>
</ol>6. Überprüfung der Decellularization
<ol><li>Waschen Sie das Formalin fixiert Biopsien in Reinstwasser für 15 min. Prozess in einem Gewebe-Prozessor nach Standardprotokollen und Einbettung in Paraffin22.</li>
	<li>5 µm-Abschnitte, die mit einem Mikrotom geschnitten und Fleck mit Meyers Hämatoxylin und 0,2 % alkoholischer Eosin (H & E) nach Standardprotokollen22.</li>
	<li>Sehen Sie unter dem Mikroskop für den Verlust der Kerne in decellularized Gewebe im Vergleich zu normalem Gewebe zu überprüfen.</li>
</ol>(7) recellularization
<ol><li>Sterilisieren Sie die Vene, indem man sie in ein 50 mL-Tube mit 50 mL der Lösung 8. Schütteln Sie im Shaker für 1 h bei 37 ° c bei 80 Umdrehungen pro Minute (u/min)</li>
	<li>Behandeln Sie die Vene unter Laminar-Flow (LAF) Kabinett von nun an Sterilität zu pflegen. Übertragen Sie die Vene mit sterilen Pinzette, eine neue 50 mL-Tube mit 50 mL sterile Lösung 7 und 500 µL Anti-Anti. Wie oben für 12 h. Änderung Lösung 7 mindestens zweimal zwischendurch schütteln.</li>
	<li>Mit sterilen Pinzette, übertragen Sie die Vene, eine neue Tube 50 mL und 50 mL endotheliale Medien. Regen Sie wie oben für 11 h.</li>
	<li>Montieren Sie den Bioreaktor mit sterilen Handschuhen unter die LAF Schrank. Binden Sie die Vene in des Bioreaktors Vene Einlass und Auslass mit sterilen Naht und Zange.</li>
	<li>Schließen Sie die Vene an den Bioreaktor und füllen Sie mit dem gleichen Medium. Hinzufügen von Heparin bei 50 IU/mL und Technologieprodukte für 1 h bei 2 mL/min bei 37 ° C.</li>
	<li>15-25 mL frisches Blut (je nach Länge der Vene) vom Spender in Heparin beschichtet Vacutainer Röhrchen sammeln und 1:1 mit Steen Lösung verdünnen. Später fügen Sie hinzu, endokrine Drüse abgeleitet vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF-EG, 80 ng/mL), grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF-b, 4 µL/mL) und Acetyl-Salicylsäure (5 µg/mL).</li>
	<li>Verschieben des Bioreaktors in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2 und Technologieprodukte für 48 h mit 2 mL/min.</li>
	<li>Ca. nach 12 h, bewegen des Bioreaktors, ein Kabinett, LAF nehmen Sie einen Tropfen Blut und Messen Sie Glukose mit Hilfe einer Blutzuckermessung Gerät. Wenn der Pegel unter 3 Mmol/L ist, fügen Sie Glukose zu bringen im Bereich von 7-9 Mmol/L. Wiederholen Sie diesen Schritt alle 8-12 h.</li>
	<li>Verschieben Sie nach 48 h des Bioreaktors in die LAF Kabinett und abtropfen lassen Sie das Blut aus dem Bioreaktor. 30 mL sterile Lösung 7 hinzufügen und für 5 min. Abfluß die Lösung durchspülen. Geben Sie 30 mL sterile Lösung 7 und Technologieprodukte für 5 min. wiederholen zweimal, oder bis die blutrote Farbe verloren geht. Hinweis: Die Biopsie kann zur Überprüfung der Zelle Anlage eingenommen werden. Trennen Sie die Vene, 5 mm Kanten der Ader mit einer Schere schneiden und entsorgen. Nehmen Sie eine Biopsie zu, wie im Schritt 5.2 angegeben und schließen Sie die Vene wieder an den Bioreaktor (optionaler Schritt an).</li>
	<li>30-45 mL von endothelialen Medium und Technologieprodukte für 96 h im Inkubator mit 2 mL/min. Hinweis: Fügen Sie endotheliale Medium bis die Vene untergetaucht ist.</li>
	<li>Verschieben Sie des Bioreaktors in den LAF-Schrank, trennen Sie die recellularized Vene, schneiden Sie 5 mm Kanten der Ader mit einer Schere und entsorgen. Nehmen Sie eine Biopsie, wie im Schritt 5.2 angegeben.</li>
</ol>8. Überprüfung der Recellularization
<ol><li>Befolgen Sie die Anweisungen in Abschnitt 6 und führen Sie H & E Färbung. Die Folien unter dem Mikroskop auf das Vorhandensein von Zellen zu untersuchen.</li>
</ol>

<ol>
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SSH hält Anteile an Verigraft, ein Unternehmen, das die Technologie der Gewebetechnik Blutgefäße lizenziert hat. Die anderen Autoren haben nichts preisgeben.

Die hier vorgestellte für Decellularization der saphenous Adern Technik ist eine einfache und kostengünstige Methode, die auch auf alle kleinen Durchmesser Venen wie Nabelschnur und Mamma Adern angewendet werden kann. Die Decellularization Lösungen und deren Konzentrationen in dieser Methode verwendet werden von unserer bisherigen Ergebnisse6,7. Obwohl wir 5 Zyklen von Decellularization empfehlen, haben wir in bestimmten Adern auch komplette Decellularization in 3 Zyklen festgestellt. Jedoch wurden reproduzierbare Ergebnisse mit 5 Zyklen. Die Anwendung dieses Protokolls, wir decellularized Venen mit unterschiedlichen Längen bis zu 30 cm erfolgreich (unveröffentlicht Ergebnis). Aufhebung der Decellularization Lösung Steckdose 45 cm wird einen Druck von 33 MmHg in der Vene erstellen. Nach unserer Erfahrung haben wir dies als wichtigen Schritt in einem die ganze Vene einheitlich und reproduzierbar in 5 Zyklen festgestellt. Der gewählte Druck ist 3 mal höher als der normale stammvenen Druck (5-10 MmHg) aber ist das gleiche wie inkompetent Venen (Krampfadern)23. Darüber hinaus vermuten wir, dass diesen hohe Druck eine bedeutende Kraft auf die venenwände entsteht und daher, effizienter und schneller Zelle entfernen helfen kann.
Da TnBP ein organisches Lösungsmittel ist und unlöslich in Wasser, rühren das Waschmittel bis wird es bewölkt wichtig ist; Andernfalls wird das Waschmittel schwimmen. Aus dem gleichen Grund wurde um TnBP gemischt in Lösung zu halten das Waschmittel auslassrohr am oberen Rand das Glasgefäß mit der schlauchauslauf gelegt. Effiziente Entfernung von TnBP aus der Vene nach seiner Verwendung in jedem Zyklus durch das Fehlen von schwimmenden TnBP Tröpfchen im Wasser gewaschenen gesehen werden kann. Wir haben auch festgestellt, dass die DNase-Schritt überspringen auch eine decellularized Gewebe produziert, aber in einigen Fällen wurde ein vergleichsweise hoher DNA-Gehalt im decellularized Gewebe bemerkt. Hoher Druck und hohe Durchflussraten nicht für effiziente DNase Tätigkeit erforderlich sind, kann ein geringer Perfusion (10 mL/min) verwendet werden. Eine unterschiedliche Peristaltische Pumpe diente als seiner geringeren Größe in einfache Handhabung des Setups hilft. Da wir diesen Schaden die meisten Zellen während Decellularization resultiert in Zyklus 2 bemerkt haben, empfiehlt es sich, überspringen DNase-Behandlung während der Zyklen 1 und 3 (unveröffentlichte Ergebnis). Obwohl die Charakterisierung und Quantifizierung von Proteinen der extrazellulären Matrix in dieser Handschrift nicht durchgeführt wurden, zeigten unsere bisherigen Erfahrungen mit ähnlichen Decellularization Protokolle die Erhaltung der biomechanischen Eigenschaften, extrazelluläre Matrix Struktur und Proteine7. Obwohl unsere vorläufige Quantifizierung Experimente mit diesen Adern ein ähnliches Ergebnis (unveröffentlicht) produziert, werden unsere bereits veröffentlichten Ergebnisse dieses Vertrauen stärken.
Recellularization mit Blut ist eine bequeme und einfache Prozess vorbei erweitert Knochenmarkzellen, wie man, lange Zelle Expansion Zeiten, spontane Mutationen im erweiterten Zellen, chirurgischen Eingriff und Beschwerden für den Patienten vermeiden kann. Denn es ist bekannt, dass Endothelialization kann auch von zirkulierenden EPC auftreten, wir stellten die Hypothese, dass Perfusion mit Blut gefolgt von Perfusion mit endothelialen Medium wird für Recellularization ausreichend sein. Die Sicherheit der Vene Gewebe konstruiert mit einer ähnlichen Methode ist vom Erfolg der Transplantation gesehen, wenn Kinder mit extra hepatische portalader Obstruktion7zwei solche Venen implantiert wurden. Wir spekulieren, dass die Wachstumsfaktoren in decellularized extrazelluläre Matrix die Befestigung der zirkulierenden EPC vom Blut24zulässt. Recellularization der Venen nach ein ähnliches Protokoll zeigte Zellen positiv für VEGF-Rezeptor-2 und Cluster der Differenzierung (CD) 14 auf das Lumen während CD45 mit dem Ausdruck ihrer Zellen in Adventitia7gesehen wurden. Wir denken auch, dass eine durchgängige endotheliale Schicht nicht in allen Fällen beobachtet werden kann, insbesondere bei Verwendung von Blut aus älteren und kranken Patienten, es ist bekannt, dass solche Personen Zahlen der zirkulierenden Vorläuferzellen Zellen25gesunken. Jedoch wir postulieren, dass Perfusion mit des Empfängers Blut kann viele der Antigene, die wegen Decellularization ausgesetzt sind und kann somit sinkt die entzündliche Nebenwirkungen wenn verpflanzt im Gegensatz zu verpflanzen nur Maske decellularized Blutgefäße. Darüber hinaus kann Durchblutung einzahlen erhöhte Konzentration von Wachstumsfaktoren auf die Lumen und Adventitia, die wiederum vermehrt der zirkulierenden Vorläuferzellen, was zu einem schnellen Prozess des Recellularization in Vivorekrutieren kann.
Die Vorteile des in dieser Studie verwendeten Bioreaktor-Designs sind komplette Autoklavieren, einfache Montage, Wirtschaftlichkeit, einfache Handhabung und die geringste Möglichkeit eines Schadens. Mit Hilfe unserer Erfahrung das aktuelle Design, Venen bis zu 10 cm in der Länge waren recellularized. Obwohl Venen bis zu 25 cm in der Länge kann auch durch die Vene in "U"-Form innerhalb des Bioreaktors zu halten recellularized, dies sollte überprüft werden. Der Bioreaktor Entwurf zeigt, dass die Richtung der Strömung in die Vene gegen die Schwerkraft ist und als solche entwickelt ist, weil es der normalen Strömungsrichtung der für diese Adern in den Menschen ist. 12 h Perfusion der endothelialen mittlerer Stufe ist die Voraussetzung der Vene und erhöhen die Affinität zur Befestigung der eingehenden EPC. Zugabe von zusätzlichen Heparin und Durchblutung für 1 h senkt das Risiko der Bildung von Blutgerinnseln in den Röhren während der Durchblutung.
Das Volumen des Blutes erforderlich ist abhängig von der Länge der Vene. Das Grundprinzip, die, das wir für das Blutvolumen zu folgen, ist, dass die Vene in Blut getaucht werden sollten. Beim Umgang mit Blut Volumen größer als 45 mL, möglicherweise gelegentlich mischen erforderlich um Zelle Ansammlung in der Unterseite des Bioreaktors zu verhindern. Wir haben Steen Lösung für Blut, denn er einen hohen Anteil an Proteinen und Komponenten erforderlich enthält, um Gewebe während Organ Transplantation26,27gesund zu halten. Zugabe von VEGF und b-FGF ist vorteilhaft, da sie potente angiogene Wachstumsfaktoren28 sind und ihre Anwesenheit Migration, Proliferation und Differenzierung von EPC29,30,31,32 induziert . Die Höhe der VEGF hinzugefügt basiert auf unserer früheren unveröffentlichte Ergebnisse, wo die Verbreitung von EPC 80 ng/ml gesehen wurde. Zugabe von Aspirin hemmt die Aktivierung von Thrombozyten33 dadurch verringert die Chancen für ihre Verbundenheit mit endotheliale Schicht. Kontinuierliche Überwachung und Zugabe von Glukose werden auch vorteilhaft für die Zellproliferation und Hämolyse der roten Blutkörperchen zu verhindern.
Da nur eine einfache Blutprobe vom Empfänger erforderlich ist, kann es als eine einfache und praktikable Verfahren erfordern weniger Fachwissen betrachtet werden. Obwohl der gesamte Vorgang von Anfang bis Ende hier gezeigten 20 Tage dauert, speichern die decellularized Venen als eine aus dem Regal Produkt wird das Verfahren bis 8 Tage für Patienten zu verkürzen. Obwohl Lagerung von decellularized Venen Recellularization Effizienz technisch nicht beeinflussen sollte, muss es ausgewertet werden. Tissue-Engineering Venen erzeugt dieses Verfahren können in der Klinik für Bypass-Operationen, verstopfte Adern, venöse Insuffizienz führt zu Krampfadern ohne Immunsuppression und so für eine bessere Qualität der ersetzen verwendet werden Leben für den Patienten.

Vaskuläre Leitungen sind für verschiedene Krankheitsbilder wie Aneurysmen, Arteria carotis-Stenose und Arteriosklerose führt zu schweren vaskulären Problemen erforderlich. Chirurgen verwenden autologen, allogenen oder synthetische vaskulären Conduits, die funktionelle Blutversorgung wiederherzustellen. Obwohl die Verwendung von autologen Blutgefäße noch den idealen Ansatz gilt, ist die Verfügbarkeit bei Patienten majorly eingeschränkt. Die Alternativen wie synthetische oder allogene Transplantate haben tiefgreifende Probleme mit immunsuppressiven Behandlungen und schlechte Durchgängigkeit Reoperation1,2, was zu großen gesundheitlichen Belastungen in Länder führt. Gewebe-Engineering von Blutgefäßen soll Transplantate bieten eine natürliche Homologie und autologen Zellen. Damit der Empfänger Immunsystem erkennt die transplantierten Transplantat als das selbst und da solch eine Transplantat die natürlichen Proteinen und Zellen in der ursprünglichen Konfiguration enthält, könnte es besser funktionieren, im Vergleich zu den derzeitigen Alternativen. Tissue Engineering Organe, wie z. B. die Blase3, die Harnröhre4, die Luftröhre5und Venen6,7, erfolgreich in der Klinik eingesetzt werden.
Tissue engineering, um personalisierte Transplantate zu produzieren erfordert eine Transplantat von einem Spender, gefolgt von Decellularization und Recellularization. Decellularization ist eine vielversprechende Technologie, Zellen von Geweben und Organen8,9,10zu entfernen. Decellularization kann von bestimmten physikalischen, chemischen und enzymatischen Methoden11 oder durch die Kombination durchgeführt werden. Zur optimalen Nutzung dieser Methoden können decellularized Gewebe ähnliche strukturelle und funktionelle Proteine in einer extrazellulären Matrix, die ähnlich wie bei nativen Gewebe haben. Solche Organe besitzen die Fähigkeit, Anhaftung, Migration, Proliferation und Differenzierung von eingehenden Stammzellen zu verbessern.
Recellularization ist ein dynamischer Prozess der Aussaat Zellen in das Transplantat und Empfänger Stammzellen für klinische Transplantation genutzt werden. Stammzellen, die derzeit für solche Zwecke benutzt sind Knochenmark mesenchymale und Orgel Bewohner3,5,6. Tier- und forschungsorientierte Studien haben Stammzellen aus mesenchymalen Ursprungs verwendet, die fetale und induzierte pluripotente12,13,14. Dieser Prozess erfordert einen Bioreaktor (eine Kammer, die hält der Vene und bietet die notwendigen Voraussetzungen wie Druck, Temperatur, Gase und pH-Wert), Zellen und Nährmedien. Die Herausforderung bei der Recellularization ist, erhalten die erforderliche Anzahl von Zellen eines bestimmten Typs und einer seeding Strategie durch die Zellen ganze Gewebe oder Organ erreichen können. Obwohl keine vollständige Gewebe oder Organ strukturell und funktionell wurde generiert und ausgewertet, bis jetzt, einige Verbesserungen auf dem Gebiet und die ersten Ergebnisse zeigen die künftige Möglichkeit15. Die Schlüsselfunktion der Vene liegt in der luminalen Endothel, das Infiltration von Entzündungszellen in Gewebe und die mittleren Glattmuskel-Ebene, die hilft bei der Verengung und bietet auch die Kraft, um Blutdruck16halten steuert. Studien haben gezeigt, dass bei Schäden, Endothelialization Anastomose oder aus zirkulierenden endothelialen Vorläuferzellen (EPC) im Blut17,18,19auftritt. Unsere Strategie für die Recellularization der Venen stützt sich auf die im Blut zirkulierenden EPC.
Tissue Engineering von Venen und Arterien wurde von mehreren Gruppen, die nach verschiedenen Decellularization und Recellularization Strategien20,21durchgeführt. Unsere Fraktion hat auch durchgeführt und entwickelt Strategien für Beckenkamm und Mamma Venen6,7Decellularization und Recellularization. Decellularization wurde von Agitation von der Ader im Triton X-100, Tri-n-Butyl-Phosphat (TnBP) und Enzym Deoxyribonuclease (DNase) durchgeführt. Die Recellularization erfolgte mittels Knochenmark abgeleitet Endothelzellen und glatten Muskel Zellen6 oder peripherem Blut7. Die Adern recellularized entweder Protokoll zeigten klinische Versprechen bei der Bereitstellung von funktionellen Blut-Versorgungsmaterial in der Transplantation von pädiatrischen Patienten mit extra hepatische portalader Obstruktion6,7.
Wir haben derzeit eine modifizierte Version des gleichen Protokolls für die verbesserte und einfache Durchführung der Decellularization, Recellularization und Bioreaktor Umgang mit kleinem Durchmesser Venen entwickelt. Die aktuellen Decellularization Protokoll Perfusion der Reinigungsmittel durch die Vene mit Druck statt Agitation mit Reinigungsmitteln. Das Recellularization-Protokoll beinhaltet einen zusätzlichen Schritt der Vorkonditionierung zur Verbesserung der Zelladhäsion und die Zugabe von Wachstumsfaktoren im zirkulierenden Blut zur Verbesserung der Zelladhäsion, überleben und Verbreitung. Wir haben auch das Design des Bioreaktors mit handelsüblichen Produkten verbessert. In diesem Beitrag präsentieren wir eine detaillierte Beschreibung des modifizierten Protokolls zur Durchführung von Decellularization und Recellularization des menschlichen saphenous Adern.

<table><tbody><tr><td>4-Port Cap</td><td>CPLabSafety</td><td>WF-GL45-4Kit</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl salicylic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5376</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>B-FGF</td><td>Lonza</td><td>cc-4113B</td><td></td></tr><tr><td>Blood Glucose monitoring system - Free style Lite</td><td>Abbott</td><td>70808-70</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Worthington</td><td>LS0020007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS with CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt dihydrate</td><td>AlfaAesar</td><td>A15161.OB</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 Growth Factors Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>EG-VEGF</td><td>Peprotech</td><td>100-44</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottle 250ml</td><td>VWR</td><td>2151593</td><td>Any bottle with GL45 cap can be used</td></tr><tr><td>Glass bottle 1L</td><td>VWR</td><td>2151595</td><td>Any bottle with GL45 cap can be used</td></tr><tr><td>Glass jar 500ml with bottom hose outlet</td><td>Kimble Chase Life Science</td><td>14607</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Leo</td><td>387107</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Coated Vacutainer Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>368480</td><td></td></tr><tr><td>Human AB Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3667</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Luer Female with 1/8&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LF-2PP-QC</td><td>For 3X5mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Female with 3/32&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LF-1.5PP-QC</td><td>For 2X4mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Male with 3/32&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LM-1.5PP-QC</td><td>For 2X4mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Male with 1/8&quot; ID Barb</td><td>Oina</td><td>LM-2PP-QC</td><td>For 3X5mm silicon tube</td></tr><tr><td>Luer Male with 5/32&quot; ID Barb</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45518-06</td><td>For 5X8mm silicon tube</td></tr><tr><td>MCDB 131</td><td>Life Technologies</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>Per acetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>433241</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump I</td><td>Masterflex</td><td>7524-45</td><td>For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75</td></tr><tr><td>Peristaltic pump II</td><td>Ismatec</td><td>ISM941</td><td>For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor.</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydrogen phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Reducing Connector 1.5mmX2.5mm</td><td>Biotech</td><td>ISM569A</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Ika</td><td>KS4000 i&amp;nbsp; control</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogen phosphate</td><td>Merck</td><td>71640-M</td><td></td></tr><tr><td>Steen solution</td><td>Xvivo</td><td>19004</td><td></td></tr><tr><td>Suture</td><td>Agnthos</td><td>14817</td><td></td></tr><tr><td>Tri-n-butyl Phosphate</td><td>AlfaAesar</td><td>A16084.AU</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>AlfaAesar</td><td>A16046.OF</td><td></td></tr><tr><td>Tube 60ml with flat base</td><td>Sarstedt</td><td>60596</td><td></td></tr><tr><td>Tube A</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td></tr><tr><td>Tube B</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube C</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3</td></tr><tr><td>Tube D</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2</td></tr><tr><td>Tube E</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube F</td><td>VWR</td><td>2280713</td><td>Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td></tr><tr><td>Tube G</td><td>VWR</td><td>2280713</td><td>Cut 2 pieces, each of 60 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td></tr><tr><td>Tube H</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube I</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube J</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr><tr><td>Tube K</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup</td></tr></tbody></table>

decellularization and recellularization methodology for human saphenous veins

Vaskuläre Conduits verwendet, während die meisten vaskuläre Operationen sind allogene oder synthetische Transplantate, die oft zu Komplikationen, die durch Immunsuppression und schlechte Durchgängigkeit führen. Gewebe-Engineering bietet eine neuartige Lösung um personalisierte Transplantate mit einer natürlichen extrazellulären Matrix des Empfängers Zellen mit der Methode der Decellularization und Recellularization zu generieren. Wir zeigen eine detaillierte Methode für die Durchführung von Decellularization der menschlichen stammvenen und Recellularization durch Perfusion des peripheren Blutes. Die Vene war decellularized Vorrichtung 1 % Triton x-100, 1 % Tri-n-Butyl-Phosphat (TnBP) und Deoxyribonuclease (DNase) 2.000 Kunitz Maßeinheiten. Triton x-100 und TnBP wurden bei 35 mL/min für 4 h durchströmt, während DNase bei 10 mL/min bei 37 ° C für 4 h durchströmt wurde. Die Vene war in Reinstwasser und PBS gewaschen und dann in 0,1 % Peressigsäure sterilisiert. Es war wieder mit PBS-Puffer gewaschen und in Endothelzellen Medium vorkonditioniert. Die Vene war verbunden mit einem Bioreaktor und durchblutet mit endothelialen Medium mit 50 IU/mL Heparin für 1 h Recellularization erfolgte durch Füllung der Bioreaktor mit frischem Blut, 1:1 in Steen Lösung verdünnt und endokrine Drüse abgeleitet vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktoren (80 ng/mL), grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (4 µL/mL) und Acetyl-Salicylsäure (5 µg/mL). Der Bioreaktor wurde dann zog in einem Inkubator und durchblutet für 48 h mit 2 mL/min unter Beibehaltung Glukose zwischen 3-9 Mmol/L. Später wurde die Vene mit PBS gewaschen, mit endothelialen Medium gefüllt und für 96 h im Inkubator durchblutet. Behandlung mit Triton x-100, TnBP und DNase decellularized die stammvenen in 5 Zyklen. Die decellularized Vene sah weiß im Gegensatz zu normalen und recellularized Venen (hellrot). Das Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung zeigte die Anwesenheit von Kernen nur in Normal, aber nicht in decellularized Adern. In der recellularized Vene zeigte H & E Färbung die Anwesenheit von Zellen auf der luminalen Oberfläche der Vene.

Die grobe Morphologie eine normale Vene ist Licht rot (Abb. 3A). Die rote Farbe ist in progressive Decellularization Zyklen verloren (2, Abb. 3 b-Zyklus; Zyklus 3, Abbildung 3) und durch die 5th Zyklus, es sieht blass und weiß (Abbildung 3D). Die recellularized Vene nach Durchblutung (Abbildung 3E) und endotheliale Medien Perfusion (Abbildung 3F) sieht leuchtend rot in der Farbe. Die 5 Zyklen der Decellularization Behandlung entfernt erfolgreich die Zellen aus der Vene wie keine blaue Kerne in der H & E Färbung (Abbildung 4 b) zu sehen waren. Im Gegensatz dazu wurden mehrere Kerne in die normale Richtung (Abb. 4A) gesehen. Das Vorhandensein von angeschlossenen Zellen auf der luminalen Seite sieht in der H & E Färbung in der recellularized Ader mit Blut für 48 h (Abbildung 4, Schwarze Pfeile) und nach Perfusion mit dem Endothel Medium für 96 h (Abbildung 3D, Schwarze Pfeile).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig1.jpg"> Abbildung 1 : Montage der Perfusion Setups für Decellularization. A) das Bild zeigt das montierte Decellularization Setup 1 für Triton x-100 und waschen. Die weißen Pfeile zeigen den Fließweg für Lösungen und rote Pfeile ein- und Ausläufe für Venen- und Lösungen. B) das Bild zeigt das montierte Decellularization Setup 2 für TnBP Perfusion. Ebenso wie in Decellularization Setup 1, weiße Pfeile zeigen den Fließweg für Lösungen und rote Pfeile zeigen ein- und Ausläufe für Venen- und Lösungen. C) das Bild zeigt das montierte Decellularization Setup 3 für Deoxyribonuclease Perfusion. Die weißen Pfeile zeigen den Fließweg für Lösungen und rote Pfeile zeigen die Einlässe für Venen- und Lösungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig2.jpg"> Abbildung 2 : Vorbereitung und Montage des Bioreaktors für Recellularization. A) Bild zeigt zur Montage des Bioreaktors erforderliche Materialien. B) Bild von der Innenseite des 4-Port-Kappe zeigt die Platzierung der Anschlüsse (rote Pfeile), Reduzierung Punkte verbinden Vene Einlass und Auslass (weisse Pfeile) und Anordnung der Rohre H, I und J. Das freie Ende des Schlauches H befindet sich in den Bioreaktor Medien zurück. C) die jeweiligen Röhren und ausgehen können von der Oberseite 4 Port GAP gesehen werden. D) Bild zeigt den montierten Bioreaktor. E) Bild zeigt das ganze Bioreaktor-Setup mit der peristaltischen Pumpe. Die Rohre K verlängern Verbindungen aus dem Bioreaktor zur peristaltischen Pumpe. F) die schematische Darstellung des gesamten bioreaktorsystem Perfusion. Die orangefarbenen Pfeile zeigen die Richtung des Flusses. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig3.jpg"> Abbildung 3 : Brutto-Morphologie der Venen bei Decellularization und Recellularization. A) die grobe Morphologie des normalen Vene sieht leuchtend rot in der Farbe. Die Farbe ist mit einer zunehmenden Zahl von Decellularization Zyklen verloren B) 2-Zyklus und C) 3-Zyklus. D) von 5 Zyklen, die Vene sieht blass und weiß. Die Vene nach Vorrichtung mit E) Blut für 48 h und F) mit dem Endothel Medium für 96 h sieht wieder leuchtend rot in der Farbe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig4.jpg"> Abbildung 4 : Charakterisierung von decellularized und recellularized Venen. Die Hämatoxylin und Eosin Färbung Bild des (A) normale Vene enthält viele blaue Kerne aber fehlen sie in (B) decellularized Vene. In die Vene mit recellularized C) Blut für 48 h und mit D) endotheliale Medium für 96 h, Befestigung der Zellen (Schwarze Pfeile) im Lumen bemerkt wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization und Recellularization Methoden für menschliche Saphenous Adern

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die stammvenen Decellularization mit Wasch- und Recellularization durch die Durchblutung der peripheren Blut und die endotheliale Medium.

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.1K Aufrufe.  University of Gothenburg. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die stammvenen Decellularization mit Wasch- und Recellularization durch die Durchblutung der peripheren Blut und die endotheliale Medium.

Serie: Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Dezellularisierung und Recellularization von Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Forschung

Biotechnik

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk of thromboemboli formation1,2,3. We have developed a method to line the inside surface of Ti tubes with autologous blood-derived human or porcine endothelial progenitor cells (EPCs)4. By implanting Ti tubes containing a confluent layer of porcine EPCs in the inferior vena cava (IVC) of pigs, we tested the improved biocompatibility of the cell-seeded surface in the prothrombotic environment of a large animal model and compared it to unmodified bare metal surfaces5,6,7 (Figure 1). This method can be used to endothelialize devices within minutes of implantation and test their antithrombotic function in vivo. 
Peripheral blood was obtained from 50 kg Yorkshire swine and its mononuclear cell fraction cultured to isolate EPCs4,8. Ti tubes (9.4 mm ID) were pre-cut into three 4.5 cm longitudinal sections and reassembled with heat-shrink tubing. A seeding device was built, which allows for slow rotation of the Ti tubes. 
We performed a laparotomy on the pigs and externalized the intestine and urinary bladder. Sharp and blunt dissection was used to skeletonize the IVC from its bifurcation distal to the right renal artery proximal. The Ti tubes were then filled with fluorescently-labeled autologous EPC suspension and rotated at 10 RPH x 30 min to achieve uniform cell-coating9. After administration of 100 USP/ kg heparin, both ends of the IVC and a lumbar vein were clamped. A 4 cm veinotomy was performed and the device inserted and filled with phosphate-buffered saline. As the veinotomy was closed with a 4-0 Prolene running suture, one clamp was removed to de-air the IVC. At the end of the procedure, the fascia was approximated with 0-PDS (polydioxanone suture), the subcutaneous space closed with 2-0 Vicryl and the skin stapled closed. 
After 3 - 21 days, pigs were euthanized, the device explanted en-block and fixed. The Ti tubes were disassembled and the inner surfaces imaged with a fluorescent microscope.
We found that the bare metal Ti tubes fully occluded whereas the EPC-seeded tubes remained patent. Further, we were able to demonstrate a confluent layer of EPCs on the inside blood-contacting surface.
Concluding, our technology can be used to endothelialize Ti tubes within minutes of implantation with autologous EPCs to prevent thrombosis of the device. Our surgical method allows for testing the improved biocompatibility of such modified devices with minimal blood loss and EPC-seeded surface disruption.

A method for seeding titanium blood-contacting biomaterials with autologous cells and testing biocompatibility is described. This method uses endothelial progenitor cells and titanium tubes, seeded within minutes of surgical implantation into porcine venae cavae. This technique is adaptable to many other implantable biomedical devices.

Autologe endotheliale Vorläuferzellen Cell-Sätechnik und Biokompatibilitätstestung Für Herz-Kreislauf-Geräte in Großtiermodell

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

Tissue Engineering eines Menschen 3D<em&gt; In-vitro-</em&gt; Tumor-Testsystem

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Generierung und Pfropfen von Tissue Engineering Gefäße in einem Maus-Modell

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

Verfahren für Menschen V. saphena<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Perfusion und Außen Verstärkung

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Medizin

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction can be performed using autologous free flap transfer or vascularized composite allotransplantation (VCA), such methods also have disadvantages. Issues such as donor site morbidity and tissue availability limit autologous free flap transfer, while immunosuppression is a significant limitation of VCA. Engineered tissues in reconstructive surgery using decellularization/recellularization methods represent a possible solution. Decellularized tissues are generated using methods that remove native cellular material while preserving the underlying extracellular matrix (ECM) microarchitecture. These acellular scaffolds can then be subsequently recellularized with recipient-specific cells.
This protocol details the procurement and decellularization methods used to achieve acellular scaffolds in a pig model. In addition, it also provides a description of the perfusion bioreactor design and setup. The flaps include the porcine omentum, tensor fascia lata, and the radial forearm. Decellularization is performed via ex vivo perfusion of low concentration sodium dodecyl sulfate (SDS) detergent followed by DNase enzyme treatment and peracetic acid sterilization in a customized perfusion bioreactor.
Successful tissue decellularization is characterized by a white-opaque appearance of flaps macroscopically. Acellular flaps show the absence of nuclei on histological staining and a significant reduction in DNA content. This protocol can be used efficiently to generate decellularized soft tissue scaffolds with preserved ECM and vascular microarchitecture. Such scaffolds can be used in subsequent recellularization studies and have the potential for clinical translation in reconstructive surgery.

The protocol describes the surgical procurement and subsequent decellularization of vascularized porcine flaps by the perfusion of sodium dodecyl sulfate detergent through the flap vasculature in a customized perfusion bioreactor.

Beschaffung und Perfusions-Dezellularisierung von porcinen vaskularisierten Klappen in einem maßgeschneiderten Perfusionsbioreaktor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an evolving reconstructive avenue for transferring multiple tissues as a composite subunit. Despite the promising nature of VCA, the long-term immunosuppressive requirements are a significant limitation due to the increased risk of malignancies, end-organ toxicity, and opportunistic infections. Tissue engineering of acellular composite scaffolds is a potential alternative in reducing the need for immunosuppression. Herein, the procurement of a rat hindlimb and its subsequent decellularization using sodium dodecyl sulfate (SDS) is described. The procurement strategy presented is based upon the common femoral artery. A machine perfusion-based bioreactor system was constructed and used for ex vivo decellularization of the hindlimb. Successful perfusion decellularization was performed, resulting in a white translucent-like appearance of the hindlimb. An intact, perfusable, vascular network throughout the hindlimb was observed. Histological analyses showed the removal of nuclear contents and the preservation of tissue architecture across all tissue compartments.

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

We describe the surgical technique and decellularization process for composite rat hindlimbs. Decellularization is conducted using low-concentration sodium dodecyl sulfate through an ex vivo machine perfusion system.

Beschaffung und Dezellularisierung von Rattenhinterbeinen mit einem Ex-vivo-Perfusions-basierten Bioreaktor für die vaskularisierte Komposit-Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

Synergizing Antegrade Endoscopic with Bridging Vein Harvesting for Improvement of Great Saphenous Vein Graft Quality from the Lower Leg

Antegrade endoscopic harvesting of autografts for bypass grafting may be an optimal strategy addressing excellent graft quality and reduced post-operative wound complications. This standardized protocol for antegrade endoscopic vein harvesting (EVH) from the lower leg has the potential to be introduced to routine coronary artery bypass grafting (CABG). Patients undergoing CABG surgery are positioned on a surgical table with two additional foam rollers below the extended legs, enabling antegrade EVH from the lower leg. Following minimally invasive surgical access through a bridging vein harvest technique, an endoscopic optical dissector is inserted antegrade into the wound. The main vessel and side branches are dissected under continuous optical control of vein quality status and the working channel. After, an endoscopic optical retractor is inserted with an internal bipolar electrocoagulation device for precise, safe, and tissue-protective interruption of side branches. After release of the vein, the vessel is cut off at the proximal and distal ends under optical control, retrieved from the wound, then cannulated and flushed with heparinized saline. Finally, all side branches of the vein graft are double-clipped. Vascular histology is analyzed in a randomized selection of vein samples. After applying this standardized EVH protocol, the learning curve was shown to be steep, and graft quality was sufficient for coronary artery bypass grafting in every case. There was no conversion to surgical harvesting and low risks for tissue damage and bleeding. Leg positioning and synergizing EVH with bridging vein harvesting improved procedural success and vein graft quality. In our hands, antegrade EVH from the lower leg was feasible, demonstrating straightforward graft dissection as well as adequate macroscopic and microscopic graft quality with preserved endothelial integrity. In conclusion, the introduced technique is safe, shows excellent vein autograft quality, and illustrates feasibility for elective and urgent isolated CABG and combined CABG scenarios.

Presented here is a protocol for antegrade endoscopic vein harvesting from the lower leg, which can safely be introduced in routine coronary artery bypass grafting. Vein grafts present excellent graft quality following this standardized protocol with positioning of the legs, minimally invasive access to the vein, and antegrade endoscopic vein harvesting.

Synergizing Antegrade Endoskopisch mit Überbrückung Vene Harvesting zur Verbesserung der großen Saphenous Vein Graft Qualität aus dem Unterschenkel

Antegrade endoscopic harvesting of autografts for bypass grafting may be an optimal strategy addressing excellent graft quality and reduced post-operative ...

A Training and Testing System for Performing Vascular Reconstruction In Vitro

Manual vascular reconstruction training is essential for a beginner surgeon. However, an optimal training system for vascular reconstruction in vitro has yet to be developed. In this study, we introduce an in vitro training and testing system using a magnetic anchoring technique with which a trainee can practice manual vascular reconstruction individually. Additionally, this system can also be used to test the quality of the reconstruction. The described system includes a vascular reconstruction training machine, magnetic tractors, and a magnetic suture puller. In this manuscript, we detail an end-to-end vein anastomosis using porcine right and left iliac veins. To identify the potential damage caused by a magnetic suture puller on the suture, we created three groups with six segments of 4-0 polypropylene sutures each: a control group with no intervention on the polypropylene suture, a group in which the polypropylene suture is manually pulled with sterile gloves 20x, and a magnetic puller group in which the magnetic puller pulled the polypropylene suture 20x. These groups were tested by light microscopy and breaking strength tests, and the effect of reconstruction was assessed. In the light microscopy test, the control group was less likely to be damaged (p &#60; 0.05) and the number of damaged points of the manual group and magnetic puller group were similar (p &#62; 0.05). The results of the breaking strength test were compared across groups and no significant difference was observed (p &#62; 0.05). The end-to-end anastomosis of the porcine iliac veins was successfully performed using this training system, and the reconstructed veins could undergo 2.0 kPa perfusion pressure. Using this training and testing system the trainee can practice manual vascular reconstruction in vitro individually with the aid of magnetic tractors and a magnetic suture puller, and the quality of the reconstruction can be tested.

Here we present a training and testing system where a trainee can complete manual vascular reconstruction in vitro individually using a magnetic anchoring technique. The system can also be used to test the quality of reconstruction.

Ein Trainings- und Testsystem zur Durchführung der Gefäßrekonstruktion in vitro

Manual vascular reconstruction training is essential for a beginner surgeon. However, an optimal training system for vascular reconstruction in vitro has ...

Occlusion of the Great and Small Saphenous Vein Using Copolymeric Glue Based on N-Butyl Cyanoacrylate and Methacryloxy Sulfolane

We present the preliminary results of a longitudinal observational study aimed at evaluating the effectiveness and safety at different short- and long-term follow-ups of vascular occlusion of the great saphenous vein (GSV) and small saphenous vein (SSV) affected by severe pathological reflux, using an innovative modified cyanoacrylate surgical glue composed of N-butyl cyanoacrylate and methacryloxy sulfolane (NBCA+MS). Ninety patients, prospectively recruited for 1 year, underwent the study with EcoColor-Doppler (ECD) to evaluate the maximum diameters of the GSV and SSV in the orthostatic position and the reflux time (RT). An RT greater than 0.5 s was considered pathologic. Clinical, etiology, anatomy, and pathophysiology (CEAP) assessment was used for the complete evaluation of each patient in the study. All the patients were treated by NBCA+MS glue to obtain vein occlusion and observed before treatment (baseline; T0), within 6 h after treatment (T1), 1 month after treatment (T2), 3 months after treatment (T3), 6 months after treatment (T4), and 1 year after treatment (T5). Chi-square (&#967;) analysis was performed to evaluate the effectiveness and safety of the treatment. All the patients participated in the entire duration of the study. Complete occlusion was maintained in 100% of patients at T1, 98.9% at T2 and T3, and 97.8% at T4 and T5 (p &lt; 0.001). None of the patients suffered from post-surgical thrombosis. No blue hyperpigmentation, or paresthesia was observed during the entire observation period. Immediately after treatment, 7.7% of patients needed painkillers; 1 week after treatment, 100% of patients returned to normal life. Vascular occlusion of the great or small saphenous vein using NBCA+MS glue is a safe procedure with persistent benefits after a 1 year follow-up. This procedure can be performed with local anesthesia, allowing a quick return to normal life. Thanks to its low invasiveness, the treatment is not painful.

Here, we present a protocol to treat the great saphenous vein (GSV) and the small saphenous vein (SSV) affected by severe pathological reflux, using an original sclerosing and embolizing cyanoacrylate-based glue composed of N-butyl cyanoacrylate and methacryloxy sulfolane (NBCA+MS).

Decellularization und Recellularization Methoden für menschliche Saphenous Adern

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