Wir möchten danken Professor Anders Jeppsson für Hilfe bei der Bereitstellung von Blutgefäßen in den Experimenten verwendet. Diese Studie wurde finanziert durch die LUA ALF Zuschuss an SSH.

Das Gewebe verwendet, und das Protokoll dieses Papiers folgt die ethischen Richtlinien der Universität Göteborg.
(1) Gewebe Zubereitung und Lagerung
<ol><li>Schneiden Sie das umgebende Gewebe aus der abgerufenen stammvenen mit chirurgischen Pinzetten und Scheren. Hinweis: Die stammvenen wird von der unteren Extremität des Menschen von Gefäßchirurgen durchschnitten. Die stammvenen verwendet in diesem Papier ist ein unbenutzten Teil nach Bypass-Operation.</li>
	<li>Um auslaufen zu verhindern während der Perfusion, verbinden Sie die Seitentrieben an ihren Enden mit Nahtmaterial und Zange.</li>
	<li>Halten Sie die Vene in einem 50 mL-Tube mit 40 mL der Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS). Waschen Sie die Vene durch eine Änderung PBS 2 - 3 Mal um überschüssiges Blut zu entfernen. Speichern Sie die Vene durch das Einfrieren bei-80 ° C.</li>
</ol>2. Vorbereitung des Decellularization-Setups und Recellularization Bioreaktor
Hinweis: Mit Schere, Schnitt die Silizium-Rohre, wie in Tabelle 1dargestellt.
<ol><li>
Decellularization Setup 1 (für Triton x-100-Perfusion und waschen)
	<ol>
<li>Bis 2 L Kammer (Kunststoffwanne), kleben Sie alle drei Stücke von Rohr A wie in Figur 1Adargestellt. Hinweis: Kleben Sie einen Schlauch an einer Wand, wo der Boden der Kammer (Waschmittel Eingang) berührt, und die anderen zwei Röhren an der gegenüberliegenden Wand mit einem Abstand von ca. 5-10 cm dazwischen abhängig von der Länge der Vene. Mindestens 5 cm dieser Röhren sollten auch dem Kammerboden (Vene der Einlass und Auslass) mit Klebeband befestigt.</li>
		<li>Über die männlichen und weiblichen Luer-Anschlüsse in Reihe anschließen das Waschmittel Einlass Röhre zu Röhre B gefolgt von Rohr F, Rohr C und schließlich an die Vene. Ort der Röhre F in die Kassette von der peristaltischen Pumpe ich.</li>
		<li>Nehmen Sie ein anderes Rohr C und verbinden Sie ein Ende der Vene Outlet. Legen Sie das andere Ende in das Glas mit der Grundablass Schlauch, das 45 cm über der Kammer (Waschmittel Outlet) befindet, und kleben Sie es sichern. Nehmen Sie Rohr G und schieben Sie ein Ende in der schlauchauslauf das Glasgefäß und stecken Sie das andere Ende in die Vene Kammer. Hinweis: Die Bilder der vollständigen Setup (rote Pfeile), Kammer und Fließrichtung (weisse Pfeile) sind in Abbildung 1Agezeigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Decellularization Setup 2 (für TnBP Perfusion)
	<ol>
<li>Nehmen Sie eine 1 L-Glas, und platzieren Sie ein Ende des Rohres C (Waschmittel Einlass) in das Glas, bis das Rohr das Glas Boden berührt.</li>
		<li>Schließen Sie das andere Ende an Rohr F gefolgt von Rohr C. Ort das andere Ende des Schlauches C in das Glas bis halbe Tiefe (Ader Eingang). Setzen Sie die Kassette der peristaltischen Pumpe Rohr F ich.</li>
		<li>Rohr D und schreiben ein Ende in das Gefäß (Vene Steckdose) bis halbe Tiefe und das andere Ende in das Glasgefäß mit dem unteren Schlauch 45 cm Höhe aus der Vene Einlass (Waschmittel Steckdose). Um zu sichern, kleben Sie das Waschmittel Einlass und Auslass Röhren.</li>
		<li>1 L-Glas auf einen Magnetrührer und halten Sie den Magneten in der Flasche.</li>
		<li>Nehmen Sie Rohr G und schieben Sie ein Ende auf der schlauchauslauf das Glasgefäß und stecken Sie das andere Ende in 1 L Glas. Hinweis: Das Bild des kompletten Setups (rote Pfeile), Kammer und Strömung Richtung (weisse Pfeile) ist in Abbildung 1 bgezeigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Decellularization Setup 3 (für DNase Perfusion)
	<ol>
<li>Eine 250-mL-Glasflasche und schreiben Sie beide Enden des Schlauches C. Ort der mittlere Bereich des Rohres in die Kassette der peristaltischen Pumpe II. Hinweis: Ein Ende der Röhre ist die Lösung-Bucht und das andere Ende des Schlauches ist an die Vene Einlass. Die Vene Steckdose frei in Lösung bleibt.</li>
		<li>Legen Sie das ganze Setup inklusive Pumpe bei 37 ° C. Das Bild des vollständigen Setup und Fließrichtung wird in Abbildung 1dargestellt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recellularization Bioreaktor
	<ol>
<li>Halten Sie bereit alle Teile wie in Abbildung 2Agezeigt.</li>
		<li>Wie in Abbildung 2 bgezeigt, nehmen Sie die 4-Port-Kappe und legen Sie in jedem Hafen, Rohr H (Ader Steckdose) tube ich (Medien-Eingang) und Rohr J (Ader Eingang). Stecken Sie das andere Ende des Schlauches H in der 4th Anschluss (Medienunternehmen). Hinweis: Der Blick auf die 4-Port-Kappe von oben ist in Abbildung 2gezeigt. Schneiden Sie für einfache Einfügung von Rohren die Kanten zu einer scharfen Spitze mit einer Schere.</li>
		<li>Biegen Sie das andere Ende des Schlauches J in U-Form und binden Sie es mit einer Naht. Schließen Sie die reduzierenden Stecker an den inneren Enden der Röhren H & J.</li>
		<li>Legen Sie die 60 mL-Tube mit flachem Boden in der 250 mL Glasflasche und platzieren Sie die obige gemachte Setup in das Rohr wie in Abb. 2Ddargestellt. Wie in Abbildung 2Edargestellt, schließen Sie Schläuche K, E und K in Reihe an. Schließen Sie ein K, die Vene Einlass und ein weiteres Rohr K an die Medien. Hinweis: Die schematische Darstellung des Setup und Fließrichtung ist in Abbildung 2Fgesehen.</li>
		<li>Den Bioreaktor durch Autoklavieren zu sterilisieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Vorbereitung der Lösungen
<ol><li>Lösung 1 (10 X Wasser): bis 1 L von Reinstwasser, fügen Sie 2 g Natriumazid und 18,6 g der Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA). Rühren Sie, bis die Salze gelöst sind.</li>
	<li>Lösung 2 (1 X Wasser): nehmen Sie 100 mL der Lösung 1 und 900 mL Reinstwasser.</li>
	<li>Lösung 3 (5 x Triton x-100): 950 mL Reinstwasser, hinzufügen, 50 mL von Triton x-100, 1 g Natriumazid und 9,3 g EDTA. Rühren Sie, bis aufgelöst.</li>
	<li>Lösung 4 (1 x Triton x-100): 200 mL der Lösung 3 einnehmen und 800 mL Reinstwasser.</li>
	<li>Lösung 5 (1 X TnBP): 990 mL der Lösung 2 10 mL TnBP mit einer 10 mL-Pipette hinzufügen.</li>
	<li>Lösung 6 (40 Kunitz Einheiten/mL DNase): Fügen Sie 2.000 Kunitz Einheiten der DNaseI in 50 mL Dulbeccos Phosphat-Puffer Kochsalzlösung enthält CaCl2 und MgCl2. Frisch zubereiten und sofort nutzen.</li>
	<li>Lösung 7 (PBS): Fügen Sie 24 g Natrium-Chlorid, 0,6 g Kaliumchlorid, 4,32 g Natrium Phosphat und 0,72 g Kalium Phosphat 3 L von Reinstwasser hinzu. Rühren Sie, bis aufgelöst. Den pH-Wert 7,4 einstellen. 1 L des PBS in den Autoklaven sterilisieren und getrennt zu lagern.</li>
	<li>Lösung 8 (0,1 % Peressigsäure): 50 mL sterile Lösung 7, 50 µL Peressigsäure hinzufügen. Frisch zubereiten und sofort nutzen.</li>
</ol>4. Vorbereitung der endothelialen Medium
<ol><li>5 mL L-Glutamin, 5 mL Anti-Anti, 50 mL von Humanserum AB und alle Komponenten des EGM-2 Wachstumsfaktor Kit außer fötalen Rinderserum bis 500 mL des MCDB131 Mediums unter einer sterilen Haube hinzugeben.</li>
</ol>5. Decellularization der Stammvenen
<ol><li>Die menschlichen stammvenen von-80 ° C bei Zimmertemperatur Auftauen. Wieder bei-80 ° C eingefroren und wieder bei Raumtemperatur Auftauen.</li>
	<li>Eine Biopsie von 2 mm Länge mit einer Schere ausschneiden und fixieren in Formaldehyd für 24-48 h bei Raumtemperatur. Binden Sie jedes Ende der Vene, die Widerhaken eines männlichen und weiblichen Luer-Anschluss mit einer Naht.</li>
	<li>Schließen Sie die Vene Decellularization Setup 1 und füllen Sie 1 L Lösung 2. Technologieprodukte für 15 min bei 35 mL/min leeren Sie den Inhalt des Setups.</li>
	<li>Fügen Sie 1 L Lösung 4 und Technologieprodukte für 4 h 35 mL/min. entleeren Sie den Inhalt des Setups.</li>
	<li>Fügen Sie 500 mL der Lösung 2 und Technologieprodukte für 5 min. entleeren Sie den Inhalt des Setups. Wiederholen Sie diesen Schritt. Perfusion Setup 1 trennen Sie die Vene und verbinden Sie mit Perfusion Setup 2.</li>
	<li>Fügen Sie 1 L Lösung 5, schalten die Rührer und Technologieprodukte für 4 h bei 35 mL/min. Hinweis: Lösung 5 sucht nach dem Einschalten auf die Rührer und Perfusion bewölkt.</li>
	<li>Trennen Sie die Vene von Perfusion Setup 2 und waschen Sie der Vene von innen und außen mit Spritze oder einer Pipette 10 mL in 4 Änderungen von Reinstwasser für 5-10 min.</li>
	<li>Verbinden Sie die Vene mit Perfusion Setup 3, 50 mL der Lösung 6 hinzufügen und durchspülen mit 10 mL/min in einer Kammer 37 ° C für 4 Std. leeren Sie den Inhalt des Setups und das Setup die Vene trennen.</li>
	<li>Verbinden Sie die Vene Perfusion Setup 1, füllen Sie 1 L Lösung 2 und über Nacht 35 mL/min. Wiederholen Sie Schritt 5.4 Schritt 5.9 4 mal (für eine Gesamtmenge von 5 Zyklen) durchspülen. Nehmen Sie eine Biopsie wieder wie in Schritt 5.2. Hinweis: Überspringen Schritt 5,8 zweiten Teil in Zyklen 1 und 3.</li>
	<li>Leeren Sie den Inhalt des Setups. Füllen Sie 1 L Lösung 2 und Technologieprodukte für 24 h bei 35 mL/min Änderung Lösung 2 nach 12 Uhr leeren Sie den Inhalt des Setups. Füllen Sie 1L das Reinstwasser und Technologieprodukte für 24 h bei 35 mL/min Änderung der Reinstwasser nach 12 h.Empty den Inhalt des Setups. Füllen Sie 1 L Lösung 7 und durchspülen Sie 7 nach 12 h 24 h bei 35 mL/min Änderung Lösung.</li>
</ol>6. Überprüfung der Decellularization
<ol><li>Waschen Sie das Formalin fixiert Biopsien in Reinstwasser für 15 min. Prozess in einem Gewebe-Prozessor nach Standardprotokollen und Einbettung in Paraffin22.</li>
	<li>5 µm-Abschnitte, die mit einem Mikrotom geschnitten und Fleck mit Meyers Hämatoxylin und 0,2 % alkoholischer Eosin (H & E) nach Standardprotokollen22.</li>
	<li>Sehen Sie unter dem Mikroskop für den Verlust der Kerne in decellularized Gewebe im Vergleich zu normalem Gewebe zu überprüfen.</li>
</ol>(7) recellularization
<ol><li>Sterilisieren Sie die Vene, indem man sie in ein 50 mL-Tube mit 50 mL der Lösung 8. Schütteln Sie im Shaker für 1 h bei 37 ° c bei 80 Umdrehungen pro Minute (u/min)</li>
	<li>Behandeln Sie die Vene unter Laminar-Flow (LAF) Kabinett von nun an Sterilität zu pflegen. Übertragen Sie die Vene mit sterilen Pinzette, eine neue 50 mL-Tube mit 50 mL sterile Lösung 7 und 500 µL Anti-Anti. Wie oben für 12 h. Änderung Lösung 7 mindestens zweimal zwischendurch schütteln.</li>
	<li>Mit sterilen Pinzette, übertragen Sie die Vene, eine neue Tube 50 mL und 50 mL endotheliale Medien. Regen Sie wie oben für 11 h.</li>
	<li>Montieren Sie den Bioreaktor mit sterilen Handschuhen unter die LAF Schrank. Binden Sie die Vene in des Bioreaktors Vene Einlass und Auslass mit sterilen Naht und Zange.</li>
	<li>Schließen Sie die Vene an den Bioreaktor und füllen Sie mit dem gleichen Medium. Hinzufügen von Heparin bei 50 IU/mL und Technologieprodukte für 1 h bei 2 mL/min bei 37 ° C.</li>
	<li>15-25 mL frisches Blut (je nach Länge der Vene) vom Spender in Heparin beschichtet Vacutainer Röhrchen sammeln und 1:1 mit Steen Lösung verdünnen. Später fügen Sie hinzu, endokrine Drüse abgeleitet vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF-EG, 80 ng/mL), grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF-b, 4 µL/mL) und Acetyl-Salicylsäure (5 µg/mL).</li>
	<li>Verschieben des Bioreaktors in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2 und Technologieprodukte für 48 h mit 2 mL/min.</li>
	<li>Ca. nach 12 h, bewegen des Bioreaktors, ein Kabinett, LAF nehmen Sie einen Tropfen Blut und Messen Sie Glukose mit Hilfe einer Blutzuckermessung Gerät. Wenn der Pegel unter 3 Mmol/L ist, fügen Sie Glukose zu bringen im Bereich von 7-9 Mmol/L. Wiederholen Sie diesen Schritt alle 8-12 h.</li>
	<li>Verschieben Sie nach 48 h des Bioreaktors in die LAF Kabinett und abtropfen lassen Sie das Blut aus dem Bioreaktor. 30 mL sterile Lösung 7 hinzufügen und für 5 min. Abfluß die Lösung durchspülen. Geben Sie 30 mL sterile Lösung 7 und Technologieprodukte für 5 min. wiederholen zweimal, oder bis die blutrote Farbe verloren geht. Hinweis: Die Biopsie kann zur Überprüfung der Zelle Anlage eingenommen werden. Trennen Sie die Vene, 5 mm Kanten der Ader mit einer Schere schneiden und entsorgen. Nehmen Sie eine Biopsie zu, wie im Schritt 5.2 angegeben und schließen Sie die Vene wieder an den Bioreaktor (optionaler Schritt an).</li>
	<li>30-45 mL von endothelialen Medium und Technologieprodukte für 96 h im Inkubator mit 2 mL/min. Hinweis: Fügen Sie endotheliale Medium bis die Vene untergetaucht ist.</li>
	<li>Verschieben Sie des Bioreaktors in den LAF-Schrank, trennen Sie die recellularized Vene, schneiden Sie 5 mm Kanten der Ader mit einer Schere und entsorgen. Nehmen Sie eine Biopsie, wie im Schritt 5.2 angegeben.</li>
</ol>8. Überprüfung der Recellularization
<ol><li>Befolgen Sie die Anweisungen in Abschnitt 6 und führen Sie H & E Färbung. Die Folien unter dem Mikroskop auf das Vorhandensein von Zellen zu untersuchen.</li>
</ol>

<ol>
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SSH hält Anteile an Verigraft, ein Unternehmen, das die Technologie der Gewebetechnik Blutgefäße lizenziert hat. Die anderen Autoren haben nichts preisgeben.

Die hier vorgestellte für Decellularization der saphenous Adern Technik ist eine einfache und kostengünstige Methode, die auch auf alle kleinen Durchmesser Venen wie Nabelschnur und Mamma Adern angewendet werden kann. Die Decellularization Lösungen und deren Konzentrationen in dieser Methode verwendet werden von unserer bisherigen Ergebnisse6,7. Obwohl wir 5 Zyklen von Decellularization empfehlen, haben wir in bestimmten Adern auch komplette Decellularization in 3 Zyklen festgestellt. Jedoch wurden reproduzierbare Ergebnisse mit 5 Zyklen. Die Anwendung dieses Protokolls, wir decellularized Venen mit unterschiedlichen Längen bis zu 30 cm erfolgreich (unveröffentlicht Ergebnis). Aufhebung der Decellularization Lösung Steckdose 45 cm wird einen Druck von 33 MmHg in der Vene erstellen. Nach unserer Erfahrung haben wir dies als wichtigen Schritt in einem die ganze Vene einheitlich und reproduzierbar in 5 Zyklen festgestellt. Der gewählte Druck ist 3 mal höher als der normale stammvenen Druck (5-10 MmHg) aber ist das gleiche wie inkompetent Venen (Krampfadern)23. Darüber hinaus vermuten wir, dass diesen hohe Druck eine bedeutende Kraft auf die venenwände entsteht und daher, effizienter und schneller Zelle entfernen helfen kann.
Da TnBP ein organisches Lösungsmittel ist und unlöslich in Wasser, rühren das Waschmittel bis wird es bewölkt wichtig ist; Andernfalls wird das Waschmittel schwimmen. Aus dem gleichen Grund wurde um TnBP gemischt in Lösung zu halten das Waschmittel auslassrohr am oberen Rand das Glasgefäß mit der schlauchauslauf gelegt. Effiziente Entfernung von TnBP aus der Vene nach seiner Verwendung in jedem Zyklus durch das Fehlen von schwimmenden TnBP Tröpfchen im Wasser gewaschenen gesehen werden kann. Wir haben auch festgestellt, dass die DNase-Schritt überspringen auch eine decellularized Gewebe produziert, aber in einigen Fällen wurde ein vergleichsweise hoher DNA-Gehalt im decellularized Gewebe bemerkt. Hoher Druck und hohe Durchflussraten nicht für effiziente DNase Tätigkeit erforderlich sind, kann ein geringer Perfusion (10 mL/min) verwendet werden. Eine unterschiedliche Peristaltische Pumpe diente als seiner geringeren Größe in einfache Handhabung des Setups hilft. Da wir diesen Schaden die meisten Zellen während Decellularization resultiert in Zyklus 2 bemerkt haben, empfiehlt es sich, überspringen DNase-Behandlung während der Zyklen 1 und 3 (unveröffentlichte Ergebnis). Obwohl die Charakterisierung und Quantifizierung von Proteinen der extrazellulären Matrix in dieser Handschrift nicht durchgeführt wurden, zeigten unsere bisherigen Erfahrungen mit ähnlichen Decellularization Protokolle die Erhaltung der biomechanischen Eigenschaften, extrazelluläre Matrix Struktur und Proteine7. Obwohl unsere vorläufige Quantifizierung Experimente mit diesen Adern ein ähnliches Ergebnis (unveröffentlicht) produziert, werden unsere bereits veröffentlichten Ergebnisse dieses Vertrauen stärken.
Recellularization mit Blut ist eine bequeme und einfache Prozess vorbei erweitert Knochenmarkzellen, wie man, lange Zelle Expansion Zeiten, spontane Mutationen im erweiterten Zellen, chirurgischen Eingriff und Beschwerden für den Patienten vermeiden kann. Denn es ist bekannt, dass Endothelialization kann auch von zirkulierenden EPC auftreten, wir stellten die Hypothese, dass Perfusion mit Blut gefolgt von Perfusion mit endothelialen Medium wird für Recellularization ausreichend sein. Die Sicherheit der Vene Gewebe konstruiert mit einer ähnlichen Methode ist vom Erfolg der Transplantation gesehen, wenn Kinder mit extra hepatische portalader Obstruktion7zwei solche Venen implantiert wurden. Wir spekulieren, dass die Wachstumsfaktoren in decellularized extrazelluläre Matrix die Befestigung der zirkulierenden EPC vom Blut24zulässt. Recellularization der Venen nach ein ähnliches Protokoll zeigte Zellen positiv für VEGF-Rezeptor-2 und Cluster der Differenzierung (CD) 14 auf das Lumen während CD45 mit dem Ausdruck ihrer Zellen in Adventitia7gesehen wurden. Wir denken auch, dass eine durchgängige endotheliale Schicht nicht in allen Fällen beobachtet werden kann, insbesondere bei Verwendung von Blut aus älteren und kranken Patienten, es ist bekannt, dass solche Personen Zahlen der zirkulierenden Vorläuferzellen Zellen25gesunken. Jedoch wir postulieren, dass Perfusion mit des Empfängers Blut kann viele der Antigene, die wegen Decellularization ausgesetzt sind und kann somit sinkt die entzündliche Nebenwirkungen wenn verpflanzt im Gegensatz zu verpflanzen nur Maske decellularized Blutgefäße. Darüber hinaus kann Durchblutung einzahlen erhöhte Konzentration von Wachstumsfaktoren auf die Lumen und Adventitia, die wiederum vermehrt der zirkulierenden Vorläuferzellen, was zu einem schnellen Prozess des Recellularization in Vivorekrutieren kann.
Die Vorteile des in dieser Studie verwendeten Bioreaktor-Designs sind komplette Autoklavieren, einfache Montage, Wirtschaftlichkeit, einfache Handhabung und die geringste Möglichkeit eines Schadens. Mit Hilfe unserer Erfahrung das aktuelle Design, Venen bis zu 10 cm in der Länge waren recellularized. Obwohl Venen bis zu 25 cm in der Länge kann auch durch die Vene in "U"-Form innerhalb des Bioreaktors zu halten recellularized, dies sollte überprüft werden. Der Bioreaktor Entwurf zeigt, dass die Richtung der Strömung in die Vene gegen die Schwerkraft ist und als solche entwickelt ist, weil es der normalen Strömungsrichtung der für diese Adern in den Menschen ist. 12 h Perfusion der endothelialen mittlerer Stufe ist die Voraussetzung der Vene und erhöhen die Affinität zur Befestigung der eingehenden EPC. Zugabe von zusätzlichen Heparin und Durchblutung für 1 h senkt das Risiko der Bildung von Blutgerinnseln in den Röhren während der Durchblutung.
Das Volumen des Blutes erforderlich ist abhängig von der Länge der Vene. Das Grundprinzip, die, das wir für das Blutvolumen zu folgen, ist, dass die Vene in Blut getaucht werden sollten. Beim Umgang mit Blut Volumen größer als 45 mL, möglicherweise gelegentlich mischen erforderlich um Zelle Ansammlung in der Unterseite des Bioreaktors zu verhindern. Wir haben Steen Lösung für Blut, denn er einen hohen Anteil an Proteinen und Komponenten erforderlich enthält, um Gewebe während Organ Transplantation26,27gesund zu halten. Zugabe von VEGF und b-FGF ist vorteilhaft, da sie potente angiogene Wachstumsfaktoren28 sind und ihre Anwesenheit Migration, Proliferation und Differenzierung von EPC29,30,31,32 induziert . Die Höhe der VEGF hinzugefügt basiert auf unserer früheren unveröffentlichte Ergebnisse, wo die Verbreitung von EPC 80 ng/ml gesehen wurde. Zugabe von Aspirin hemmt die Aktivierung von Thrombozyten33 dadurch verringert die Chancen für ihre Verbundenheit mit endotheliale Schicht. Kontinuierliche Überwachung und Zugabe von Glukose werden auch vorteilhaft für die Zellproliferation und Hämolyse der roten Blutkörperchen zu verhindern.
Da nur eine einfache Blutprobe vom Empfänger erforderlich ist, kann es als eine einfache und praktikable Verfahren erfordern weniger Fachwissen betrachtet werden. Obwohl der gesamte Vorgang von Anfang bis Ende hier gezeigten 20 Tage dauert, speichern die decellularized Venen als eine aus dem Regal Produkt wird das Verfahren bis 8 Tage für Patienten zu verkürzen. Obwohl Lagerung von decellularized Venen Recellularization Effizienz technisch nicht beeinflussen sollte, muss es ausgewertet werden. Tissue-Engineering Venen erzeugt dieses Verfahren können in der Klinik für Bypass-Operationen, verstopfte Adern, venöse Insuffizienz führt zu Krampfadern ohne Immunsuppression und so für eine bessere Qualität der ersetzen verwendet werden Leben für den Patienten.

Vaskuläre Leitungen sind für verschiedene Krankheitsbilder wie Aneurysmen, Arteria carotis-Stenose und Arteriosklerose führt zu schweren vaskulären Problemen erforderlich. Chirurgen verwenden autologen, allogenen oder synthetische vaskulären Conduits, die funktionelle Blutversorgung wiederherzustellen. Obwohl die Verwendung von autologen Blutgefäße noch den idealen Ansatz gilt, ist die Verfügbarkeit bei Patienten majorly eingeschränkt. Die Alternativen wie synthetische oder allogene Transplantate haben tiefgreifende Probleme mit immunsuppressiven Behandlungen und schlechte Durchgängigkeit Reoperation1,2, was zu großen gesundheitlichen Belastungen in Länder führt. Gewebe-Engineering von Blutgefäßen soll Transplantate bieten eine natürliche Homologie und autologen Zellen. Damit der Empfänger Immunsystem erkennt die transplantierten Transplantat als das selbst und da solch eine Transplantat die natürlichen Proteinen und Zellen in der ursprünglichen Konfiguration enthält, könnte es besser funktionieren, im Vergleich zu den derzeitigen Alternativen. Tissue Engineering Organe, wie z. B. die Blase3, die Harnröhre4, die Luftröhre5und Venen6,7, erfolgreich in der Klinik eingesetzt werden.
Tissue engineering, um personalisierte Transplantate zu produzieren erfordert eine Transplantat von einem Spender, gefolgt von Decellularization und Recellularization. Decellularization ist eine vielversprechende Technologie, Zellen von Geweben und Organen8,9,10zu entfernen. Decellularization kann von bestimmten physikalischen, chemischen und enzymatischen Methoden11 oder durch die Kombination durchgeführt werden. Zur optimalen Nutzung dieser Methoden können decellularized Gewebe ähnliche strukturelle und funktionelle Proteine in einer extrazellulären Matrix, die ähnlich wie bei nativen Gewebe haben. Solche Organe besitzen die Fähigkeit, Anhaftung, Migration, Proliferation und Differenzierung von eingehenden Stammzellen zu verbessern.
Recellularization ist ein dynamischer Prozess der Aussaat Zellen in das Transplantat und Empfänger Stammzellen für klinische Transplantation genutzt werden. Stammzellen, die derzeit für solche Zwecke benutzt sind Knochenmark mesenchymale und Orgel Bewohner3,5,6. Tier- und forschungsorientierte Studien haben Stammzellen aus mesenchymalen Ursprungs verwendet, die fetale und induzierte pluripotente12,13,14. Dieser Prozess erfordert einen Bioreaktor (eine Kammer, die hält der Vene und bietet die notwendigen Voraussetzungen wie Druck, Temperatur, Gase und pH-Wert), Zellen und Nährmedien. Die Herausforderung bei der Recellularization ist, erhalten die erforderliche Anzahl von Zellen eines bestimmten Typs und einer seeding Strategie durch die Zellen ganze Gewebe oder Organ erreichen können. Obwohl keine vollständige Gewebe oder Organ strukturell und funktionell wurde generiert und ausgewertet, bis jetzt, einige Verbesserungen auf dem Gebiet und die ersten Ergebnisse zeigen die künftige Möglichkeit15. Die Schlüsselfunktion der Vene liegt in der luminalen Endothel, das Infiltration von Entzündungszellen in Gewebe und die mittleren Glattmuskel-Ebene, die hilft bei der Verengung und bietet auch die Kraft, um Blutdruck16halten steuert. Studien haben gezeigt, dass bei Schäden, Endothelialization Anastomose oder aus zirkulierenden endothelialen Vorläuferzellen (EPC) im Blut17,18,19auftritt. Unsere Strategie für die Recellularization der Venen stützt sich auf die im Blut zirkulierenden EPC.
Tissue Engineering von Venen und Arterien wurde von mehreren Gruppen, die nach verschiedenen Decellularization und Recellularization Strategien20,21durchgeführt. Unsere Fraktion hat auch durchgeführt und entwickelt Strategien für Beckenkamm und Mamma Venen6,7Decellularization und Recellularization. Decellularization wurde von Agitation von der Ader im Triton X-100, Tri-n-Butyl-Phosphat (TnBP) und Enzym Deoxyribonuclease (DNase) durchgeführt. Die Recellularization erfolgte mittels Knochenmark abgeleitet Endothelzellen und glatten Muskel Zellen6 oder peripherem Blut7. Die Adern recellularized entweder Protokoll zeigten klinische Versprechen bei der Bereitstellung von funktionellen Blut-Versorgungsmaterial in der Transplantation von pädiatrischen Patienten mit extra hepatische portalader Obstruktion6,7.
Wir haben derzeit eine modifizierte Version des gleichen Protokolls für die verbesserte und einfache Durchführung der Decellularization, Recellularization und Bioreaktor Umgang mit kleinem Durchmesser Venen entwickelt. Die aktuellen Decellularization Protokoll Perfusion der Reinigungsmittel durch die Vene mit Druck statt Agitation mit Reinigungsmitteln. Das Recellularization-Protokoll beinhaltet einen zusätzlichen Schritt der Vorkonditionierung zur Verbesserung der Zelladhäsion und die Zugabe von Wachstumsfaktoren im zirkulierenden Blut zur Verbesserung der Zelladhäsion, überleben und Verbreitung. Wir haben auch das Design des Bioreaktors mit handelsüblichen Produkten verbessert. In diesem Beitrag präsentieren wir eine detaillierte Beschreibung des modifizierten Protokolls zur Durchführung von Decellularization und Recellularization des menschlichen saphenous Adern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1158">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:333px;">4-Port Cap</td>
			<td style="width:208px;">CPLabSafety</td>
			<td style="width:119px;">WF-GL45-4Kit</td>
			<td style="width:499px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Acetyl salicylic acid</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Anti-Anti</td>
			<td style="width:208px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">B-FGF</td>
			<td style="width:208px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">cc-4113B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:333px;">Blood Glucose monitoring system - Free style Lite</td>
			<td style="width:208px;">Abbott</td>
			<td style="width:119px;">70808-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">DNase-I</td>
			<td style="width:208px;">Worthington</td>
			<td style="width:119px;">LS0020007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:333px;">Dulbecco&#39;s PBS with CaCl2 and MgCl2</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td style="width:208px;">AlfaAesar</td>
			<td style="width:119px;">A15161.OB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">EGM-2 Growth Factors Kit</td>
			<td style="width:208px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:333px;">EG-VEGF</td>
			<td style="width:208px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:333px;">Glass bottle 250ml</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2151593</td>
			<td>Any bottle with GL45 cap can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Glass bottle 1L</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2151595</td>
			<td>Any bottle with GL45 cap can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Glass jar 500ml with bottom hose outlet</td>
			<td style="width:208px;">Kimble Chase Life Science</td>
			<td style="width:119px;">14607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Heparin</td>
			<td style="width:208px;">Leo</td>
			<td style="width:119px;">387107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Heparin Coated Vacutainer Tubes</td>
			<td style="width:208px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">368480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Human AB Serum</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:208px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Female with 1/8&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Oina</td>
			<td style="width:119px;">LF-2PP-QC</td>
			<td>For 3X5mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Female with 3/32&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Oina</td>
			<td style="width:119px;">LF-1.5PP-QC</td>
			<td>For 2X4mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Male with 3/32&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Oina</td>
			<td style="width:119px;">LM-1.5PP-QC</td>
			<td>For 2X4mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Male with 1/8&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Oina</td>
			<td style="width:119px;">LM-2PP-QC</td>
			<td>For 3X5mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Luer Male with 5/32&#34; ID Barb</td>
			<td style="width:208px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-45518-06</td>
			<td>For 5X8mm silicon tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">MCDB 131</td>
			<td style="width:208px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10372-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Per acetic acid</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">433241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Peristaltic pump I</td>
			<td style="width:208px;">Masterflex</td>
			<td style="width:119px;">7524-45</td>
			<td>For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Peristaltic pump II</td>
			<td style="width:208px;">Ismatec</td>
			<td style="width:119px;">ISM941</td>
			<td>For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Potassium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Reducing Connector 1.5mmX2.5mm</td>
			<td style="width:208px;">Biotech</td>
			<td style="width:119px;">ISM569A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Shaker</td>
			<td style="width:208px;">Ika</td>
			<td style="width:119px;">KS4000 i&#160; control</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:208px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">13423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Sodium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:208px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">71640-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Steen solution</td>
			<td style="width:208px;">Xvivo</td>
			<td style="width:119px;">19004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Suture</td>
			<td style="width:208px;">Agnthos</td>
			<td style="width:119px;">14817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Tri-n-butyl Phosphate</td>
			<td style="width:208px;">AlfaAesar</td>
			<td style="width:119px;">A16084.AU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:208px;">AlfaAesar</td>
			<td style="width:119px;">A16046.OF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Tube 60ml with flat base</td>
			<td style="width:208px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">60596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube A</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube B</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube C</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube D</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube E</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280706</td>
			<td>Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube F</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280713</td>
			<td>Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube G</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280713</td>
			<td>Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube H</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280703</td>
			<td>Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube I</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280703</td>
			<td>Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube J</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280703</td>
			<td>Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube K</td>
			<td style="width:208px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">2280703</td>
			<td>Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization and recellularization methodology for human saphenous veins

Vaskuläre Conduits verwendet, während die meisten vaskuläre Operationen sind allogene oder synthetische Transplantate, die oft zu Komplikationen, die durch Immunsuppression und schlechte Durchgängigkeit führen. Gewebe-Engineering bietet eine neuartige Lösung um personalisierte Transplantate mit einer natürlichen extrazellulären Matrix des Empfängers Zellen mit der Methode der Decellularization und Recellularization zu generieren. Wir zeigen eine detaillierte Methode für die Durchführung von Decellularization der menschlichen stammvenen und Recellularization durch Perfusion des peripheren Blutes. Die Vene war decellularized Vorrichtung 1 % Triton x-100, 1 % Tri-n-Butyl-Phosphat (TnBP) und Deoxyribonuclease (DNase) 2.000 Kunitz Maßeinheiten. Triton x-100 und TnBP wurden bei 35 mL/min für 4 h durchströmt, während DNase bei 10 mL/min bei 37 ° C für 4 h durchströmt wurde. Die Vene war in Reinstwasser und PBS gewaschen und dann in 0,1 % Peressigsäure sterilisiert. Es war wieder mit PBS-Puffer gewaschen und in Endothelzellen Medium vorkonditioniert. Die Vene war verbunden mit einem Bioreaktor und durchblutet mit endothelialen Medium mit 50 IU/mL Heparin für 1 h Recellularization erfolgte durch Füllung der Bioreaktor mit frischem Blut, 1:1 in Steen Lösung verdünnt und endokrine Drüse abgeleitet vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktoren (80 ng/mL), grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (4 µL/mL) und Acetyl-Salicylsäure (5 µg/mL). Der Bioreaktor wurde dann zog in einem Inkubator und durchblutet für 48 h mit 2 mL/min unter Beibehaltung Glukose zwischen 3-9 Mmol/L. Später wurde die Vene mit PBS gewaschen, mit endothelialen Medium gefüllt und für 96 h im Inkubator durchblutet. Behandlung mit Triton x-100, TnBP und DNase decellularized die stammvenen in 5 Zyklen. Die decellularized Vene sah weiß im Gegensatz zu normalen und recellularized Venen (hellrot). Das Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung zeigte die Anwesenheit von Kernen nur in Normal, aber nicht in decellularized Adern. In der recellularized Vene zeigte H & E Färbung die Anwesenheit von Zellen auf der luminalen Oberfläche der Vene.

Die grobe Morphologie eine normale Vene ist Licht rot (Abb. 3A). Die rote Farbe ist in progressive Decellularization Zyklen verloren (2, Abb. 3 b-Zyklus; Zyklus 3, Abbildung 3) und durch die 5th Zyklus, es sieht blass und weiß (Abbildung 3D). Die recellularized Vene nach Durchblutung (Abbildung 3E) und endotheliale Medien Perfusion (Abbildung 3F) sieht leuchtend rot in der Farbe. Die 5 Zyklen der Decellularization Behandlung entfernt erfolgreich die Zellen aus der Vene wie keine blaue Kerne in der H & E Färbung (Abbildung 4 b) zu sehen waren. Im Gegensatz dazu wurden mehrere Kerne in die normale Richtung (Abb. 4A) gesehen. Das Vorhandensein von angeschlossenen Zellen auf der luminalen Seite sieht in der H & E Färbung in der recellularized Ader mit Blut für 48 h (Abbildung 4, Schwarze Pfeile) und nach Perfusion mit dem Endothel Medium für 96 h (Abbildung 3D, Schwarze Pfeile).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig1.jpg"> Abbildung 1 : Montage der Perfusion Setups für Decellularization. A) das Bild zeigt das montierte Decellularization Setup 1 für Triton x-100 und waschen. Die weißen Pfeile zeigen den Fließweg für Lösungen und rote Pfeile ein- und Ausläufe für Venen- und Lösungen. B) das Bild zeigt das montierte Decellularization Setup 2 für TnBP Perfusion. Ebenso wie in Decellularization Setup 1, weiße Pfeile zeigen den Fließweg für Lösungen und rote Pfeile zeigen ein- und Ausläufe für Venen- und Lösungen. C) das Bild zeigt das montierte Decellularization Setup 3 für Deoxyribonuclease Perfusion. Die weißen Pfeile zeigen den Fließweg für Lösungen und rote Pfeile zeigen die Einlässe für Venen- und Lösungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig2.jpg"> Abbildung 2 : Vorbereitung und Montage des Bioreaktors für Recellularization. A) Bild zeigt zur Montage des Bioreaktors erforderliche Materialien. B) Bild von der Innenseite des 4-Port-Kappe zeigt die Platzierung der Anschlüsse (rote Pfeile), Reduzierung Punkte verbinden Vene Einlass und Auslass (weisse Pfeile) und Anordnung der Rohre H, I und J. Das freie Ende des Schlauches H befindet sich in den Bioreaktor Medien zurück. C) die jeweiligen Röhren und ausgehen können von der Oberseite 4 Port GAP gesehen werden. D) Bild zeigt den montierten Bioreaktor. E) Bild zeigt das ganze Bioreaktor-Setup mit der peristaltischen Pumpe. Die Rohre K verlängern Verbindungen aus dem Bioreaktor zur peristaltischen Pumpe. F) die schematische Darstellung des gesamten bioreaktorsystem Perfusion. Die orangefarbenen Pfeile zeigen die Richtung des Flusses. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig3.jpg"> Abbildung 3 : Brutto-Morphologie der Venen bei Decellularization und Recellularization. A) die grobe Morphologie des normalen Vene sieht leuchtend rot in der Farbe. Die Farbe ist mit einer zunehmenden Zahl von Decellularization Zyklen verloren B) 2-Zyklus und C) 3-Zyklus. D) von 5 Zyklen, die Vene sieht blass und weiß. Die Vene nach Vorrichtung mit E) Blut für 48 h und F) mit dem Endothel Medium für 96 h sieht wieder leuchtend rot in der Farbe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig4.jpg"> Abbildung 4 : Charakterisierung von decellularized und recellularized Venen. Die Hämatoxylin und Eosin Färbung Bild des (A) normale Vene enthält viele blaue Kerne aber fehlen sie in (B) decellularized Vene. In die Vene mit recellularized C) Blut für 48 h und mit D) endotheliale Medium für 96 h, Befestigung der Zellen (Schwarze Pfeile) im Lumen bemerkt wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization und Recellularization Methoden für menschliche Saphenous Adern

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die stammvenen Decellularization mit Wasch- und Recellularization durch die Durchblutung der peripheren Blut und die endotheliale Medium.

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

decellularization-recellularization-methodology-for-human-saphenous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.1K Aufrufe.  University of Gothenburg. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die stammvenen Decellularization mit Wasch- und Recellularization durch die Durchblutung der peripheren Blut und die endotheliale Medium.

Serie: Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Dezellularisierung und Recellularization von Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Forschung

Biotechnik

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

Magnet-Resonanz-Elastographie Methodik für die Beurteilung von Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts Wachstum

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Messe Cytometry: Protokoll für die tägliche Tuning und Ausführen von Zellproben auf einem CyTOF Messe Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Perfusion-based whole organ decellularization has recently gained interest in the field of tissue engineering as a means to create site-specific extracellular matrix scaffolds, while largely preserving the native architecture of the scaffold. To date, this approach has been utilized in a variety of organ systems, including the heart, lung, and liver 1-5. Previous decellularization methods for tissues without an easily accessible vascular network have relied upon prolonged exposure of tissue to solutions of detergents, acids, or enzymatic treatments as a means to remove the cellular and nuclear components from the surrounding extracellular environment6-8. However, the effectiveness of these methods hinged upon the ability of the solutions to permeate the tissue via diffusion. In contrast, perfusion of organs through the natural vascular system effectively reduced the diffusion distance and facilitated transport of decellularization agents into the tissue and cellular components out of the tissue. Herein, we describe a method to fully decellularize an intact porcine heart through coronary retrograde perfusion. The protocol yielded a fully decellularized cardiac extracellular matrix (c-ECM) scaffold with the three-dimensional structure of the heart intact. Our method used a series of enzymes, detergents, and acids coupled with hypertonic and hypotonic rinses to aid in the lysis and removal of cells. The protocol used a Trypsin solution to detach cells from the matrix followed by Triton X-100 and sodium deoxycholate solutions to aid in removal of cellular material. The described protocol also uses perfusion speeds of greater than 2 L/min for extended periods of time. The high flow rate, coupled with solution changes allowed transport of agents to the tissue without contamination of cellular debris and ensured effective rinsing of the tissue. The described method removed all nuclear material from native porcine cardiac tissue, creating a site-specific cardiac ECM scaffold that can be used for a variety of applications.

A method to rapidly and completely remove cellular components from an intact porcine heart through retrograde perfusion is described. This method yields a site specific cardiac extracellular matrix scaffold which has the potential for use in multiple clinical applications.

Verfahren für Dezellularisierung der Porcine Heart von Retrograde Coronary Perfusion

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Successful tissue engineering involves the combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo. Scaffolds may be synthetic, naturally-derived or derived from tissues/organs. The latter are obtained using a technique called decellularization. Decellularization may involve a combination of physical, chemical, and enzymatic methods. The goal of this technique is to remove all cellular traces whilst maintaining the macro- and micro-architecture of the original tissue.
Intestinal tissue engineering has thus far used relatively simple scaffolds that do not replicate the complex architecture of the native organ. The focus of this paper is to describe an efficient decellularization technique for rat small intestine. The isolation of the small intestine so as to ensure the maintenance of a vascular connection is described. The combination of chemical and enzymatic solutions to remove the cells whilst preserving the villus-crypt axis in the luminal aspect of the scaffold is also set out. Finally, assessment of produced scaffolds for appropriate characteristics is discussed.

The article describes a methodology for the production of an acellular matrix from rat intestine. The derivation of intestinal scaffolds is important for future applications in tissue engineering, stem cell biology and drug testing.

Ein Dezellularisierung Methodik für die Herstellung von Naturdarm Azelluläre Matrix

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Verfahren für Dezellularisierung von Rattenlebern in einer oszillierenden Druck Perfusionsvorrichtung

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are an emerging treatment for photoreceptor degenerative diseases that seek to restore vision by artificially stimulating the surviving retinal neurons in the hope of eliciting comprehensible visual perception in patients. Current retinal prostheses have demonstrated success in restoring limited vision to patients using an array of electrodes to electrically stimulate the retina but face substantial physical barriers in restoring high acuity, natural vision to patients. Chemical neurostimulation using native neurotransmitters is a biomimetic alternative to electrical stimulation and could bypass the fundamental limitations associated with retinal prostheses using electrical neurostimulation. Specifically, chemical neurostimulation has the potential to restore more natural vision with comparable or better visual acuities to patients by injecting very small quantities of neurotransmitters, the same natural agents of communication used by retinal chemical synapses, at much finer resolution than current electrical prostheses. However, as a relatively unexplored stimulation paradigm, there is no established protocol for achieving chemical stimulation of the retina in vitro. The purpose of this work is to provide a detailed framework for accomplishing chemical stimulation of the retina for investigators who wish to study the potential of chemical neuromodulation of the retina or similar neural tissues in vitro. In this work, we describe the experimental setup and methodology for eliciting retinal ganglion cell (RGC) spike responses similar to visual light responses in wild-type and photoreceptor-degenerated wholemount rat retinas by injecting controlled volumes of the neurotransmitter glutamate into the subretinal space using glass micropipettes and a custom multiport microfluidic device. This methodology and protocol are general enough to be adapted for neuromodulation using other neurotransmitters or even other neural tissues.

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

This protocol describes a novel method for investigating a form of chemical neurostimulation of wholemount rat retinas in vitro with the neurotransmitter glutamate. Chemical neurostimulation is a promising alternative to the conventional electrical neurostimulation of retinal neurons for treating irreversible blindness caused by photoreceptor degenerative diseases.

Methodik für biomimetische Chemie Neuromodulation der Ratte Netzhaut mit dem Neurotransmitter Glutamat In-vitro-

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components are presented as a surface coating. These culture systems constitute a simplification of the complex nature of the tissue ECM that encompasses biochemical composition, structure, and mechanical properties. To better emulate the ECM-cell communication shaping the cardiac microenvironment, we developed a protocol that allows for the decellularization of the whole fetal heart and adult left ventricle tissue explants simultaneously for comparative studies. The protocol combines the use of a hypotonic buffer, a detergent of anionic surfactant properties, and DNase treatment without any requirement for specialized skills or equipment. The application of the same decellularization strategy across tissue samples from subjects of various age is an alternative approach to perform comparative studies. The present protocol allows the identification of unique structural differences across fetal and adult cardiac ECM mesh and biological cellular responses. Furthermore, the herein methodology demonstrates a broader application being successfully applied in other tissues and species with minor adjustments, such as in human intestine biopsies and mouse lung.

The cardiac extracellular matrix (ECM) is a complex network of molecules that orchestrate key processes in tissues and organs while enduring physiological remodeling throughout life. Standardized decellularization of fetal and adult hearts permits comparative experimental studies of both tissues in a 3D context by capturing native architecture and biomechanical properties.

Vergleichbare Decellularization von fetalen und adulten Herzgewebe Explantaten als 3D-ähnliche Plattformen für In-vitro-Studien

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Zwei Methoden zur Decellularization von Pflanzengewebe für Tissue-Engineering-Anwendungen

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...