Dieses Projekt wurde unterstützt von NPU ich LO1417 (Ministerium für Bildung, Jugend und Sport der Tschechischen Republik).

1. Vorbereitung von biologischem Material
<ol><li>Bereiten Sie biologisches Material, mit dem Ausdruck des eindringmittel tagged Proteins von Interesse sowie eine cytoplasmatische Markierung vor. Folgen Sie den Anweisungen in der Einleitung erwähnt.</li>
</ol>(2) konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie
<ol><li>Das Material vorbereitet in Abschnitt 1 mit FM 4-64 Farbstoff7Fleck.<ol>
<li>Wenden Sie eine Färbung Protokoll, die für das untersuchte Material geeignet ist. Färben Sie für BY-2 tabakzellen 200 μl Zellsuspension mit 0,2 μl 10 mm FM 4-64 Lösung in Dimethylsulfoxide. Hinweis: Die typische Färbung Konzentration von FM 4-64 Farbstoff geht 10 μM mit 10 mM Stammlösung in Dimethylsulfoxide. Verwenden Sie die niedrigste Konzentration von FM 4-64 für richtige Färbung und inkubieren Sie Zellen auf Eis (FM 4-64 und niedrige Temperatur können Plasmamembran Eigenschaften beeinflussen) nicht. Fahren Sie mit Beobachtung konfokalen Mikroskopie sofort verwenden. Das Intervall zwischen der Färbung und die Bildaufnahme sollte nicht länger als 10 Minuten sein; Andernfalls wirkt Endozytose des Farbstoffs der FM 4-64 Färbung.</li>
		<li>Verarbeiten Sie mehrere Proben nacheinander zu, und keine Flecken Sie, die Proben zu Beginn des Experiments.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erfassen eines Konfokalen Querdurchmesser pro Zelle.<ol>
<li>Legen Sie eine sequenzielle Zweikanal-Scannen für den Chromophor als Protein-Tag (der erste Kanal muss) und FM 4-64 (der zweite Kanal muss) verwendet. Legen Sie eine höhere optische Auflösung (10 – 20 px/μm). Ein Beispiel-Setup: 63 X Öl Immersion Ziel, NA 1.3, Bildgröße 1.024 x 1.024 px. Sicherstellen Sie, dass die Plasmamembran Ebene senkrecht auf die konfokale Schnittebene in der aufgenommenen Bilder.</li>
		<li>Mindestens 20 Zellen pro Probe müssen genügend Daten für die statistische Auswertung zu erfassen (abhängig von der Signal-Variabilität in verarbeiteten Materials).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. erforderliche Softwareinstallation
<ol><li>Installieren Sie Fidschi ImageJ Verteilung8und das gewünschte Makro peripheren.<ol>
<li>Herunterladen Sie Software von der Website https://fiji.sc/#download und installieren Sie sie nach dem Auspacken.</li>
		<li>Starten Sie Fidschi durch Doppelklick auf die Datei "ImageJ(.exe)" in das entpackte Verzeichnis "Fiji.app".</li>
		<li>Ein Makro "peripheren" von der folgenden Website herunterladen: http://kfrserver.Natur.cuni.cz/LiDE/vosolsob/Peripheral/Source/Peripheral_.IJM.</li>
		<li>Wählen Sie in Fidschi, Plugins | Makros | Installieren... im Haupt-Menü und geben Sie den Pfad auf die heruntergeladene Datei "Peripheral_.ijm." Hinweis: Zwei neue Tools des installierten Makros "peripheren" erscheint in der Symbolleiste Fidschi: "Nehmen Sie Profil Tool" und "Peripheren Protein-Menü".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Installieren Sie die R-Projekt Software9und benötigten Pakete.<ol>
<li>Folgen Sie den Anweisungen auf der Website https://cloud.r-project.org/ für R-Projekt Installation. Hinweis: Die gesamte Analyse wird in Fidschi durchgeführt werden. Die R-Software wird nur intern aufgerufen werden durch das Fidschi-Makro "peripheren" während der Berechnung.</li>
		<li>R-GUI ausführen, wählen Sie -Pakete | Installieren Sie Pakete... im Hauptmenü und geben Sie den nächsten Repository und Paket "ggplot2" für die Installation. Hinweis: Alternativ zum R Befehlszeilen eingeben: install.packages("ggplot2").</li>
		<li>Das Ziel eine periphere R-Paket herunter: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz. Durch die Auswahl Pakete zu installieren | Installieren Sie Pakete aus lokalen Dateien.... Hinweis: Alternativ geben Sie auf der Befehlszeile R diesen Befehl nur: install.Packages ("http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz", Repo = NULL, Typ = "Quelle").</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) Bildanalyse in Fidschi
<ol><li>Die konfokale Bilder der zytoplasmatischen Marker zu verarbeiten.<ol>
<li>Importieren Sie die Bilder nach Fidschi mit Plugins | Bio-Formate | Bio-Formate Importeur Fidschi im Menü mit den Standardeinstellungen.</li>
		<li>Überprüfen Sie, ob der Bio-Formate-Importeur die Bild-Kalibrierung richtig erkannt. Die Bild-Dimension im oberen linken Feld Bild Informationsfenster angezeigt muss die Originalmaße Bild entsprechen.</li>
		<li>Nicht ordnungsgemäß kalibriert behandeln Bilder mit den falschen Abmessungen individuell, z. B.durch die Einstellung der richtigen Parameter im Dialogfenster analysieren | Legen Sie Maßstab... Fidschi im Menü: füllen Sie die Breite des Bildes in Pixel in das Feld " Abstand in Pixel " und die wirkliche Breite in der entsprechenden Längeneinheit im Feld Abstand bekannt ). Hinweis: Wenn die Leica LCS LEI-Dateien nicht ordnungsgemäß kalibriert sind, folgen Sie Schritt 4.2.1.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie das Import-Optionen Makro für eine Analyse-Set-up. Das Makro aktivieren, indem Sie eine der drei Möglichkeiten: Wählen Sie Plugins | Makros | Import-Optionen [f1] in Fidschi-Hauptmenü, wählen Sie das gleiche Element nach Klicken auf das Menü Werkzeug Peripheren Protein Menüoder drücken Sie die Tastatur-Abkürzung F1. Legen Sie den Parameter im Dialogfenster aufgerufene Makro.<ol>
<li>Lösen Sie bei der Leica LCS LEI Format unsachgemäße Kalibrierung durch Leica.lei Bilder Kontrollkästchen aktivieren. Diese Option importiert ordnungsgemäß die Bildabmessungen aus der Datei mit der Endung "Lei".</li>
		<li>Definieren Sie den entsprechenden Wert im Feld Gaussian blur Radius (px). Dies beeinflusst Bild glätten und Lärm-Reduzierung. Ein niedriger Wert (1 px) ist ausreichend und verursacht keine Verluste Bild Informationen.</li>
		<li>Legen Sie einen Wert im Feld Profil Linienbreite (px). Eine dickere Linie verursacht höhere Glättung der Profilkurven. Ein Standardwert 10 wird px empfohlen.</li>
		<li>Legen Sie einen Bildtitel Analyse durch die Definition von "Probe Trennzeichen" und "Exportierte Elemente." Hinweis: Ein Bildtitel (Dateinamen ohne Erweiterung, z. B.: "Experiment-1_line-02_cell-11") wird um die Charaktere, die im Feld "Sample Trennzeichen" aufgeführt aufgeteilt werden (z.B.: "-_") in einer Reihe von Elementen ("Experiment", "1"," "Linie", "02", "Zelle" und "11") als Gruppierung Faktoren (Probe, Zelle, Zeile oder Behandlung Identität) in der folgenden Analyse verwendet werden können. Definieren Sie, welche Elemente verwendet werden, durch Eingabe ihrer Sequenznummer ("0" für das erste Element) in den eingereichten "Exportiert Elemente." Verwenden Sie Leerzeichen getrennte Format, z. B."3 5." In diesem Beispiel werden "02" und "11" bezeichnet als Gruppierung Faktoren namens "Fac_0" und "Fac_1." Darüber hinaus wird die Identität der einzelnen Messungen werden als bezeichnet "Ich" Faktor.</li>
		<li>Alternativ halten Sie die Probe Trennzeichen leer und geben Sie 0 in die exportierte Elemente , wenn die Vollbild-Titel beibehalten werden kann.</li>
		<li>Überprüfen Sie auf dem Windows-Betriebssystem, ob der Pfad zu den R-Software korrekt erkannt im Feld Pfad zum R.exewerden. Andernfalls geben Sie den vollständigen Pfad zu der Datei R.exe in das System (z.B."C:\Program Files\R\bin\R.exe").</li>
		<li>Klicken Sie auf "OK". Überprüfen Sie den Titel im nächsten Dialogfenster analysieren und klicken Sie auf "OK" oder wieder zurücksetzen. Hinweis: Alle Bilder werden automatisch geglättet und schließlich neu kalibriert werden. Eine Liste der alle exportierten Gruppierung Faktoren wird im Ergebnisfenster angezeigt.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie eine lineare Auswahl über die Plasmamembran-Region in die bearbeiteten Bilder und Messen Sie die Fluoreszenz-Profile zu.<ol>
<li>Wählen Sie das Fidschi-Werkzeug gerade Linie von der Fidschi-Symbolleiste. Klicken Sie auf das Bild und ziehen Sie eine Linie in der Plasmamembran-Region. Die Zeile sollte muss in den Extrazellulärraum beginnen und senkrecht auf der Plasmamembran. Wählen Sie Regionen mit einer dickeren und homogenere Schicht der kortikalen Zytoplasma. Die optimale Länge der linearen Auswahl ist 5-10 μm.</li>
		<li>Laufen Sie die Profil-Makro zu nehmen , indem analoge Methode wie im Schritt 4.2 (Kürzel "X") oder in der Fidschi-Symbolleiste auf Profil Tool nehmen . Die automatische Messung der Fluoreszenz-Profile in beiden Kanälen erfolgt und die Daten werden im Ergebnisfenster angezeigt.</li>
		<li>Wenn mit der Taste "X" benutzerunfreundlich gilt, die Makro-Quelldatei Peripheral_.ijm im Text-Editor zu öffnen, ersetzen Sie das "X"-Symbol in der Zeile "Makro"Take Profil [X]"{" mit einem günstigeren Symbol (, wird nicht verwendet, in der Umgebung der Fidschi-Inseln als eine aktive Tastatur-Abkürzung) und speichern Sie die Datei. Installieren Sie das Makro (Schritt 3.1.4) und starten Sie die Analyse aus dem Bildimport.</li>
		<li>Nehmen Sie nach einzelsignal Variabilität repräsentative Zahlen der Profile für jede Zelle.</li>
		<li>Sichern Sie die Daten per Datei | Ziel speichern unter.... Verwenden Sie immer die Erweiterung "Csv"; Es ist notwendig für die richtige Datenformat.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie die Plot-Profil-Daten-Makro (Abkürzung F5) für die grafische Visualisierung der gemessenen Profile. Legen Sie den Parameter im Dialogfenster aufgerufene Makro.<ol>
<li>Halten Sie das Kontrollkästchen Gebrauch Filtern nach Eingabedaten? abgewählt.</li>
		<li>Geben Sie an, ob die Handlung von aktuellen Daten im Ergebnisfenster, aus einem einzigen CSV-Datei oder aus CSV-Dateien in einem angegebenen Verzeichnis durch Klicken auf das entsprechende Optionsfeld erstellt werden soll. Hinweis: Wenn der Plot aus den jüngsten Ergebnissen erstellt, Daten werden zuerst gespeichert werden (Dialogfeld "Speichern unter... " wird automatisch aktiviert).</li>
		<li>Geben Sie an welche Gruppierung Faktoren für das Plotten durch Aktivieren der entsprechenden Kontrollkästchen verwendet werden. Wählen Sie den Faktor "i.", wenn alle Profile in einzigartige Grundstücke angezeigt werden soll. Halten Sie die Kontrollkästchen nicht ausgewählt ist, sollten alle Daten von auf einem einzigen Grundstück dargestellt. Achtung: Auswählen eines Faktors Gruppierung, die nicht in den verarbeiteten Ergebnisse Ursachen Fehler während der Ploterstellung vorhanden ist.</li>
		<li>Geben Sie den Dateinamen beim Speichern von einem Grundstück im Feld Output-Datei-Präfix und definieren Sie die Handlung Bildabmessungen in Grundstück hohe und Breite Plot-Dateien. Hinweis: Die daraus resultierende Handlung wird in einem Quell-Daten-Verzeichnis als eine PNG-Datei gespeichert werden.</li>
		<li>Wählen Sie die PDF-Ausgabe? Kontrollkästchen, wenn eine zusätzliche PDF-Ausgabe kann produziert werden.</li>
		<li>Klicken Sie auf "OK". Geben Sie den Pfad zum Speichern der Ergebnisse oder schließlich für Daten importieren Sie im nächsten Dialogfenster. Analyse zu bestätigen, indem Sie auf "OK" in den Dialogfenstern zeigen die durchgeführten R-Code. Hinweis: Die Handlung wird in einem neuen Bildfenster geöffnet werden und die R Analyseausgabe werden in Text-Fenster aufgelistet.</li>
	</ol></li>
	<li>Laufen Sie die Profil Filterung Setup Makro (Abkürzung F2) haben einige gezeichneten profile übermäßige Signale im extrazellulären Raum (für das tagged Protein) oder in den intrazellulären Raum (für das FM 4-64-Signal). Folgen Sie durch die Einstellung der Parameter im Dialogfenster aufgerufene Makro. Hinweis: Filter ermöglicht die Entfernung von schlechten Profile nach der maximal zulässigen Intensität Schwelle an angegebenen X-Koordinaten.<ol>
<li>Für jeden Kanal inmitten der entsprechenden Intensität Schwellenwerts die Datei Messungen mit einem übermäßigen extrazelluläre (intrazellulären) Signal zu entfernen. Geben Sie der Region, wo die Intensität Schwelle angewendet wird, in das Feld an X-Koordinaten zu senken (größer).</li>
		<li>Führen Sie die Plot-Makro der Profil-Daten (Schritt 4.4) erneut mit dem Kontrollkästchen Gebrauch Filtern nach Eingabedaten? ausgewählt; sicherstellen Sie, dass alle aberranten Profile erfolgreich entfernt wurden. Ansonsten, verbessern Sie die Filterparameter (Schritt 4.5.1).</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie das Makro erstellen Modell (Abkürzung F3) erstellen ein Modell der Plasmamembran und die Zytoplasma-Fluoreszenz-Verteilung anhand der Kalibrierdaten. Folgen Sie durch die Einstellung der Parameter im Dialogfenster aufgerufene Makro.<ol>
<li>Angeben, wenn die Eingabedaten gefilterten (Schritt 4.5) durch die Wahl sein sollte die Nutzung Filtern nach Eingabedaten? Kontrollkästchen.</li>
		<li>Geben Sie die Quelldaten analogisch wie in Schritt 4.4.2.</li>
		<li>Geben Sie ein Intervall an dem das Modell wird vorhergesagt werden, per Definition von "Start", "beenden" und "Schritt" Werte in μm. Hinweis: Alle Profilmessungen sollte länger als das angegebene Intervall.</li>
		<li>Geben Sie die Wellenlängen der Fluoreszenz Anregung und Emission Maxima von der Chromophore in die entsprechenden Felder verwendet. Stellen Sie den Standardeinstellungen für GLP und FM 4-64-Kombination. Hinweis: "GLP" kennzeichnet den Chromophor verwendet für das Protein tagging (GFP, GFP, YFP, etc.) und "FM4" der Chromophor für eine Plasmamembran Färbung (in der Regel FM 4-64) verwendet.</li>
		<li>Geben Sie die Ausgabe-Datei-Präfix -Feld. Das Präfix wird für eine resultierende Modell wie die RData Datei ein Quellverzeichnis Daten speichern verwendet werden.</li>
		<li>Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Grundstück Modell? Wenn die grafische Ausgabe erforderlich ist. Die Handlung wird gespeichert als die PNG-Datei sowie die PDF-Datei Wenn der PDF-Ausgabe? Kontrollkästchen aktiviert ist.</li>
		<li>Klicken Sie auf "OK". Geben Sie den Eingang oder Ausgang Wege im nächsten Dialogfenster und die Analyse zu bestätigen, indem Sie auf "OK" im Dialogfenster zeigt die durchgeführten R-Code. Hinweis: Die Handlung von der modellierten zytoplasmatischen und Membran Verbindung der peripher-assoziierten Protein Fluoreszenz werden in das neue Bildfenster angezeigt, und die R Analyseausgabe werden im Text-Fenster aufgelistet.</li>
	</ol></li>
	<li>Die Bilder der Zellen mit dem Ausdruck des Proteins des Interesses zu verarbeiten.<ol>
<li>Importieren Sie die Bilder analog wie in Schritt 4.1.</li>
		<li>Richten Sie die Analyse analog wie in Schritt 4.2. Die Glättung und Linie Breite sollten identisch sein.</li>
		<li>Messen Sie die Profile analog wie in Schritt 4.3.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Richtigkeit der Profile durch Plotten (Schritt 4.4) und legen Sie die Filterung (Schritt 4.5) auf Wunsch.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie das berechnen Verteilung Makro (Abkürzung F4) für die Berechnung der ein Protein Partitionierung zwischen der Plasmamembran und im Zytoplasma. Folgen Sie der Parametereinstellung im Dialogfenster aufgerufene Makro.<ol>
<li>Analogisch mit dem vorherigen Schritt (Schritt 4.4), angeben der Datenquelle Filterung und Dateinamen Präfix.</li>
		<li>Geben Sie an, ob das Modell für Protein-Verteilung-Berechnung aus den letzten Modell-Berechnung in der letzten Instanz des "Peripheren" Makros auf Fidschi (select-Kontrollkästchen Aktuelle Ergebnisse) oder die RData (geladen wird Kontrollkästchen Sie aktivieren Sie das- "aus Datei").</li>
		<li>Halten Sie das Kontrollkästchen Ergebnisse mit größer als passives Variabilität entfernen aktiviert, wenn ein Ergebnis-Filterung gewünscht wird. Geben Sie den Schwellenwert der maximale zulässige residual Variabilität, die durch das Signal Zersetzung der einzelnen Profilmessung unerklärliche werden kann. Zum Beispiel: 0.200 der Wert gibt an, dass alle Messungen mit unerklärlichen Variabilität höher als 20 % der Gesamtvariabilität der Fluoreszenzintensität im Profil werden verworfen.</li>
		<li>Wählen Sie Probe Gruppierung Faktoren, die für Box-Plot erstellen (Schritt 4.4) verwendet werden dürfen.</li>
		<li>Aktivieren Sie das Kontrollkästchen PDF-Ausgabe? für das Boxplot als PDF-Datei speichern.</li>
		<li>Klicken Sie auf "OK", geben Sie den Eingang oder Ausgang Wege und die Analyse zu bestätigen, indem Sie auf "OK" im Dialogfenster zeigt die durchgeführten R-Code. Hinweis: Boxplot der peripher-assoziierten Protein Aufteilung zwischen der Plasmamembran und Zytoplasma wird in einem neuen Bildfenster angezeigt werden, und die R Analyseausgabe werden in Text-Fenster aufgelistet.</li>
		<li>Für Fremdbearbeitung, speichern Sie die Ergebnisse im Fenster Ergebnisse über Datei angezeigt | Ziel speichern unter... in das Menü "Fenster".</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+composition+and+a+polybasic+motif+determine+D6+PROTEIN+KINASE+polar+association+with+the+plasma+membrane+and+tropic+responses.">Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses.</a> Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).</li><li>Kato, M., Aoyama, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ca2+-binding+protein+PCaP2+located+on+the+plasma+membrane+is+involved+in+root+hair+development+as+a+possible+signal+transducer.">The Ca2+-binding protein PCaP2 located on the plasma membrane is involved in root hair development as a possible signal transducer.</a> Plant J. 74 (4), 690-700 (2013).</li><li>Kubitscheck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence Microscopy: From Principles to Biological Applications. , (2013).</li><li>Janecki, A. J., Janecki, M., Akhter, S., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+plasma+membrane+expression+of+a+fusion+protein+of+Na/H+exchanger+NHE3+and+green+fluorescence+protein+(GFP)+in+living+PS120+fibroblasts.">Quantitation of plasma membrane expression of a fusion protein of Na/H exchanger NHE3 and green fluorescence protein (GFP) in living PS120 fibroblasts.</a> J Histochem Cytochem. 48 (11), 1479-1492 (2000).</li><li>Peitzsch, R. M., McLaughlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+acylated+peptides+and+fatty+acids+to+phospholipid+vesicles:+pertinence+to+myristoylated+proteins.">Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins.</a> Biochemistry. 32 (39), 10436-10443 (1993).</li><li>Vosolsob&#283;, S., Petr&#225;&#353;ek, J., Schwarzerov&#225;, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+plasticity+of+plasma+membrane+interaction+in+DREPP+family+proteins.">Evolutionary plasticity of plasma membrane interaction in DREPP family proteins.</a> Biochim Biophys Acta - Biomembr. 1859 (5), 686-697 (2017).</li><li>Bolte, S., Talbot, C., Boutte, Y., Catrice, O., Read, N. D., Satiat-Jeunemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM-dyes+as+experimental+probes+for+dissecting+vesicle+trafficking+in+living+plant+cells.">FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells.</a> J Microsc. 214 (2), 159-173 (2004).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A language and environment for statistical computing. , (2008).</li><li>Logan, D. C., Domergue, O., Teyssendier de la Serve, B., Rossignol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+family+of+plasma+membrane+polypeptides+differentially+regulated+during+plant+development.">A new family of plasma membrane polypeptides differentially regulated during plant development.</a> Biochem Mol Biol Int. 43 (5), 1051-1062 (1997).</li><li>Ide, Y., Nagasaki, N., Tomioka, R., Suito, M., Kamiya, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+properties+of+a+novel,+hydrophilic+cation-binding+protein+associated+with+the+plasma+membrane.">Molecular properties of a novel, hydrophilic cation-binding protein associated with the plasma membrane.</a> J Exp Bot. 58 (5), 1173-1183 (2007).</li><li>Nagasaki-Takeuchi, N., Miyano, M., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasma+membrane-associated+protein+of+Arabidopsis+thaliana+AtPCaP1+binds+copper+ions+and+changes+its+higher+order+structure.">A plasma membrane-associated protein of Arabidopsis thaliana AtPCaP1 binds copper ions and changes its higher order structure.</a> J Biochem. 144 (4), 487-497 (2008).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDP25,+A+Novel+Calcium+Regulatory+Protein,+Mediates+Hypocotyl+Cell+Elongation+by+Destabilizing+Cortical+Microtubules+in+Arabidopsis.">MDP25, A Novel Calcium Regulatory Protein, Mediates Hypocotyl Cell Elongation by Destabilizing Cortical Microtubules in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23 (12), 4411-4427 (2011).</li><li>Qin, T., Liu, X., Li, J., Sun, J., Song, L., Mao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+microtubule-destabilizing+protein+25+functions+in+pollen+tube+growth+by+severing+actin+filaments.">Arabidopsis microtubule-destabilizing protein 25 functions in pollen tube growth by severing actin filaments.</a> Plant Cell. 26 (1), 325-339 (2014).</li><li>Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+BY-2+Cell+Line+as+the+&amp;#34;HeLa&amp;#34;+Cell+in+the+Cell+Biology+of+Higher+Plants.">Tobacco BY-2 Cell Line as the &amp;#34;HeLa&amp;#34; Cell in the Cell Biology of Higher Plants.</a> Int Rev Cytol. 132, 1-30 (1992).</li><li>Hellens, R. P., Anne Edwards, E., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGreen:+A+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">pGreen: A versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol Biol. 42 (6), 819-832 (2000).</li><li>Vermeer, J. E. M., Thole, J. M., Goedhart, J., Nielsen, E., Munnik, T., Gadella, T. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+phosphatidylinositol+4-phosphate+dynamics+in+living+plant+cells.">Imaging phosphatidylinositol 4-phosphate dynamics in living plant cells.</a> Plant J. 57 (2), 356-372 (2009).</li><li>La&#328;kov&#225;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Dynamics+of+Plant+Plasma+Membrane+Proteins+with+Fluorescence+Recovery+and+Raster+Image+Correlation+Spectroscopy.">Determination of Dynamics of Plant Plasma Membrane Proteins with Fluorescence Recovery and Raster Image Correlation Spectroscopy.</a> Microsc Microanal. 22 (2), 290-299 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die hier beschriebene Methode erzeugt eine genauere Schätzung der Plasmamembran Partitionierung für peripher verbunden Proteine, die im Vergleich zu anderen Ansätzen basiert auf der Messung der Fluoreszenz-Intensität-5. Die wesentliche Verbesserung dieser Methode ist, dass die Lichtbeugung und Überlagerung von der Plasmamembran und zytoplasmatischen Signale berücksichtigt. Obwohl diese Methodenergebnisse im Zusammenhang mit Ergebnissen einer einfachen Methode, basierend auf dem Vergleich der...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57837/determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally">Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins</a>. The Affiliations section was updated.
One of the affiliations was updated from:
Department of Experimental Plant Biology, University of Science, Charles University
to:
Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57837/determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally">Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins</a>. The Affiliations section was updated.

Erratum: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Peripher-assoziierten Plasmamembran Proteine sind die wichtigsten Komponenten der Zelle Signalwege. Eines ihrer grundlegenden Aufgaben ist ihre transiente Plasmamembran Assoziation und Dissoziation, die wichtig für die Signalübertragung zwischen Plasmamembran und Zytoplasma ist. Plasmamembran peripher-assoziierte Proteine auf Plasmamembran durch Lipid-Anker (N-myristylierung, S-Acylation oder Prenylation) oder durch Lipid-Bindung-Domänen (Interaktion mit Phosphatidylinositol Phosphate, phosphatidic Säure, anbaubar usw.).
Plasmamembran bindenden Eigenschaften dieser Proteine können sein untersucht in Vivo, z. B.wenn ein eindringmittel getaggt Protein durch eine Site-verwiesene Mutagenese der wichtigen Aminosäuren geändert wird, oder wenn es mit verschiedenen Inhibitoren beeinflussen behandelt wird Lipid signaling. Die Verteilungen der peripheren Membranproteine, Plasma werden meist qualitativ, besonders in Fällen geprüft wenn re PROTEINVERTEILUNG offensichtlich ist. Die vorgestellte Methode ist optimal für Situationen, wenn Protein Umverteilung nur teilweise ist und quantitative Bewertung notwendig ist. Ein häufig verwendeter Ansatz Wenn Plasmamembran Vereinigung von konfokalen geschätzt wird laser scanning Mikroskopie-Bildern, wie ein Verhältnis von Fluoreszenz-Intensität an der Plasmamembran und in das Zytoplasma1,2, ist aber nicht einfach, präzise. Fluoreszenz-Intensität in der Plasmamembran reflektieren eine Überlagerung der Plasmamembran und Zytoplasma Signal aufgrund der Lichtbeugung Merkmal für die besondere Fluoreszenz-Mikroskopie-Technik und optischen Elementen verwendet3. Infolgedessen ist der zytoplasmatischen Signal auch in der Membran-Region enthalten. Aus diesem Grund kann nicht FM 4-64 Färbung Muster für eine Membran Signal Auswahl4als Maske verwendet werden. Darüber hinaus einfache Messungen von Membran-Signal an der Position von FM 4-64 Färbung immer systematisch maximale definiert das echte Plasmamembran Signal des peripher-assoziierten Plasmamembran Protein durch die Überlagerung der überschätzen die Membran und zytoplasmatischen Compound. Das Maximum der beobachteten Signale für Gewebekulturen getaggt peripher-assoziierte Proteine auch nicht zusammen mit dem Maximum der Plasmamembran Marker (d.h. FM 4-64 Styryl Farbstoff) lokalisiert, aber ist das Zytoplasma verlagert. Eine weitere Einschränkung ist, dass der FM 4-64 Emission Höhepunkt im Vergleich zu den Emission Gipfeln für grüne fluoreszierende Proteine wie GFP aufgrund der Wellenlänge-Abhängigkeit von Lichtbeugung3breiter ist.
In die hier beschriebene Methode ist das tagged Protein-Signal durch zwei empirische Funktionen beschreiben einer hypothetischen Verteilung der Plasmamembran und Zytoplasma Signal bzw. ausgestattet. Dieses Signal Zersetzung ist auf lineare Fluoreszenz Profile angewendet, die an der Zelloberfläche senkrecht zur Plasmamembran in Quellbilder, gelten die regulären, Zweikanal-konfokale Abschnitte fluoreszent-markierte Protein zum Ausdruck zu bringen sind Zellen mit FM 4-64 Farbstoff gekennzeichnet.
Die erste Funktion, die für die Montage verwendet beschreibt eine Beugung eines Zytoplasma-Signals auf dem Zellenrand. Es wird von zuvor erworbenen Fluoreszenz Profile erhalten, die in den Zellen, die mit dem Ausdruck eines Zytoplasma Protein Markers markiert durch die gleichen Chromophor als Plasmamembran peripher-assoziierten Protein des Interesses gemessen wurden. Die zweite Funktion beschreibt eine Beugung der Plasmamembran Signal ist die Fluoreszenz von FM 4-64 abgeleitet. Dieses Signal wird zunächst von einer Gaußschen Funktion angenähert, der für eine ungefähre Modellierung von Lichtbeugung eine Punktquelle verwendet wird. Zweitens ist dieses Modell, gültig für rote FM 4-64 Emission mathematisch in der Form umgewandelt, die relevant für einer Emissionswellenlänge von den Chromophor verwendet für die Kennzeichnung von peripher-assoziierte Proteine auf der Plasmamembran von Interesse sind. Beide Funktionen werden durch die maximale Intensität und der Mittelwert von 10 % der höchsten Werte für FM 4-64 und zytoplasmatischen Proteinen Signal bzw. normalisiert. Durch dieses Signal Zersetzung (nicht-lineare mindestens quadratisch Anpassungsmethode) können das Verhältnis der Plasmamembran und Zytoplasma Bruchteil des untersuchten Proteins leicht und genau geschätzt werden. Die realen physische Dimension des berechneten Partitionierungs-Koeffizienten ist im Bereich von Mikrometer, weil zytoplasmatischen Volumenkonzentration mit oberflächenkonzentration auf der Plasmamembran verglichen wird. Es definiert den Abstand zwischen der Plasmamembran Cytoplasma, innerhalb derer die gleiche Menge an Proteinen im angrenzenden Bereich der Plasmamembran lokalisiert ist. Dieser Wert entspricht der Partitionierung Koeffizient K2 eingeführt, zuvor5. Die Methode ist sehr schnell, erfordert nur einzelne konfokale Abschnitte aufgenommen mit Routine konfokale Laser-scanning-Mikroskop, und es ist rechnerisch nicht anspruchsvoll. Der Kern der Analyse in einen tragbaren R-Paket implementiert wurde und eine zusätzliche ImageJ-Makro wurde geschrieben, um grafische Benutzeroberfläche zum Starten der Analysis über die intuitive Dialoge. Software und ausführliche Beschreibung der Methode (früher veröffentlichten6) finden Sie unter http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.
Die Methode eignet sich für isolierte Zellen, Protoplasten und Geweben, wo die Plasmamembran der einzelnen Zellen deutlich unterscheidbar ist, mit dem Ausdruck ein eindringmittel getaggt Konstrukt der peripher-assoziierten Protein untersucht. Ein Chromophor kompatibel mit FM 4-64 Färbung verwendet werden muss. FM 4-64 gibt rote Fluoreszenz; Daher kann untersuchten Proteins durch ein Fluoreszenz-Protein mit blauen, grünen oder gelben Emission (z. B.GFP, GFP, YFP) markiert werden. Stabile Transformation von biologischem Material wird empfohlen, weil dadurch weniger künstliche und mehr reproduzierbare Beobachtungen der PROTEINVERTEILUNG. Es ist notwendig, dass die untersuchten Proteine eine relativ homogene zytoplasmatischen Verteilung hat. Die Lokalisation eines Proteins in das endoplasmatische Retikulum oder ein weiteres Fach der intrazellulären Membran kann künstliche Ergebnissen führen.
Darüber hinaus muss das gleiche biologische Material mit dem Ausdruck eines zytoplasmatischen Markers für den Vergleich verwendet werden. Zellen können durch eine kostenlose Chomophore (das gleiche wie für periphere Protein tagging, z. B.kostenlose GLP) oder tagged Proteins des Interesses mit abgeschafft Membran-Bindungskapazität umgewandelt werden. Membran-Bindungskapazität kann, z. B. durch Trimmen der Membran-bindende Domäne oder Site-verwiesene Mutagenese der wichtigen Aminosäure Essigreiniger (z.B. Websites für N-myristylierung, S-Acylation, oder Prenylation, etc.) abgeschafft werden.
Für die konfokale scanning-Mikroskopie müssen Zellen durch eine Membran-Marker wie FM 4-64 Farbstoff gekennzeichnet sein. Wenn FM 4-64 Färbung nicht für das untersuchte Material (wegen störenden Autofluoreszenz, schlechte Farbstoff eindringen, etc.) geeignet ist, können die Plasmamembran, z. B. durch integrale Plasmamembran Protein markiert, eine entsprechende Chomophore (beschriftet werden mCherry, RFP, etc.). Es ist wichtig, dass die Markierung vernachlässigbar Lokalisierung in die intrazellulären Membran Fächer (Endomembranes) hat.
Arbeiten mit festen Proben und Antikörper kann fixierbar analogen FM 4-64FX oder Plasmamembran Kennzeichnung durch Antikörper gegen ein geeignetes Ziel verwendet werden. In diesem Fall ist es wichtig, die Ergebnisse sehr sorgfältig ausgewertet werden, da Fixierung Verfahren zum selektiven Verlust von Proteinen aus dem Zytoplasma und der Plasmamembran führen können.

<table><tbody><tr><td>FM 4-64</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T13320</td><td>Plasma membrane dye</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540 Sigma</td><td>Dye solvent</td></tr><tr><td>Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes)</td><td></td><td></td><td>Equipment for cell labelling and microscopy</td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ordinary computer</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determination of plasma membrane partitioning for peripherally-associated proteins

Diese Methode bietet einen schnellen Ansatz für die Ermittlung der Plasmamembran Partitionierung von jedem eindringmittel getaggt peripher-assoziierten Protein mit den Profilen der Fluoreszenzintensität über die Plasmamembran. Gemessenen Fluoreszenz Profile sind durch ein Modell für die Membran und Zytoplasma Fluoreszenz Verteilung entlang einer Linie, die senkrecht auf der Peripherie der Zelle angewendet ausgestattet. Dieses Modell ist aus der Fluoreszenz Intensitätswerte in Referenzzellen auszudrücken eindringmittel getaggt Marker für Zytoplasma und mit FM 4-64-mit der Bezeichnung Plasmamembran gebaut. Die Methode kann auf verschiedene Arten von Zellen und Organismen angewendet werden; Allerdings können nur die Plasmamembranen von nicht benachbarten Zellen ausgewertet werden. Diese schnelle Mikroskopie-basierte Methode eignet sich für Experimente, wo dynamische Veränderungen der Plasmamembran-assoziierten Marker erwartet werden und müssen quantifiziert werden, z.B.bei der Analyse der mutierten Versionen von Proteinen, Inhibitor Behandlungen, und signal-Transduktion Beobachtungen. Die Methode ist eine Multi-Plattform-R-Paket implementiert, die mit einem Makro ImageJ gekoppelt ist, die als eine benutzerfreundliche Oberfläche dient.

DREPP10 ist ein anlagenspezifischen peripher-assoziierten Plasmamembran-Protein, das einhergeht mit der Plasmamembran über eine N-myristylierung und eine elektrostatische Wechselwirkung mit Phosphatidylinositol Phosphate11, 12. DREPP wurde als Bestandteil des Kalzium-Signalisierung Maschinen in der Pflanzenzelle beschrieben und auch interagiert mit dem Zytoskelett13,<sup...

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Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Quantitative Analyse des Niveaus der Plasmamembran Verein für Gewebekulturen getaggt peripher-assoziierten Protein durchführen. Die Methode basiert auf die rechnerische Zersetzung der Membran und zytoplasmatischen Komponente des Signals beobachtet in Zellen mit Plasmamembran fluoreszierenden Marker gekennzeichnet.

Bestimmung der Plasmamembran Partitionierung für peripher-assoziierte Proteine

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally

Research

JoVE Journal

Biology

8.3K Aufrufe.  Faculty of Science, Charles University. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Quantitative Analyse des Niveaus der Plasmamembran Verein für Gewebekulturen getaggt peripher-assoziierten Protein durchführen. Die Methode basiert auf die rechnerische Zersetzung der Membran und zytoplasmatischen Komponente des Signals beobachtet in Zellen mit Plasmamembran fluoreszierenden Marker gekennzeichnet.

Serie: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Forschung

Biochemie

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate neurotransmission that occurs within synapses because it is highly regulated by dynamic protein-protein interactions and phosphorylation events. Accordingly, when any method is used to study synaptic transmission, a major goal is to preserve these transient physiological modifications. Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments. In other words, the protocol describes a biochemical methodology to carry out protein enrichment from presynaptic, postsynaptic, and extrasynaptic compartments. First, synaptosomes, or synaptic terminals, are obtained from neurons that contain all synaptic compartments by means of a discontinuous sucrose gradient. Of note, the quality of this initial synaptic membrane preparation is critical. Subsequently, the isolation of the different subsynaptic compartments is achieved with light solubilization using mild detergents at differential pH conditions. This allows for separation by gradient and isopycnic centrifugations. Finally, protein enrichment at the different subsynaptic compartments (i.e., pre-, post- and extrasynaptic membrane fractions) is validated by means of immunoblot analysis using well-characterized synaptic protein markers (i.e., SNAP-25, PSD-95, and synaptophysin, respectively), thus enabling a direct assessment of the synaptic distribution of any particular neuronal protein.

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments.

Gehirn Membran Fraktionierung: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Bewertung der Subsynaptischen Protein-Lokalisierung

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently tagged proteins have revolutionized the study of subcellular protein distribution. However, it is difficult to quantify the distribution with fluorescent microscopy, especially when proteins are partially cytosolic. Moreover, it is often important to study endogenous proteins. Biochemical assays such as immunoblots remain the gold standard for quantification of protein distribution after subcellular fractionation. Although there are commercial kits that aim to isolate cytosolic or certain membrane fractions, most of these kits are based on extraction with detergents, which may be unsuitable for studying peripheral membrane proteins that are easily extracted from membranes. Here we present a detergent-free protocol for cellular homogenization by nitrogen cavitation and subsequent separation of cytosolic and membrane-bound proteins by ultracentrifugation. We confirm the separation of subcellular organelles in soluble and pellet fractions across different cell types, and compare protein extraction among several common non-detergent-based mechanical homogenization methods. Among several advantages of nitrogen cavitation is the superior efficiency of cellular disruption with minimal physical and chemical damage to delicate organelles. Combined with ultracentrifugation, nitrogen cavitation is an excellent method to examine the shift of peripheral membrane proteins between cytosolic and membrane fractions.

Here we present protocols for detergent-free homogenization of cultured mammalian cells based on nitrogen cavitation and subsequent separation of cytosolic and membrane-bound proteins by ultracentrifugation. This method is ideal for monitoring the partitioning of peripheral membrane proteins between soluble and membrane fractions.

Stickstoff-Kavitation und differentielle Zentrifugation ermöglicht eine Überwachung der Verteilung von peripheren Membranproteinen in kultivierten Zellen

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

Native Cell Membrane Nanoparticles System für Membran-Protein-Protein-Interaktionsanalyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ranging from nanometers to micrometers and microseconds to minutes, respectively. Such a broad range of biological processes challenges conventional microscopy approaches. Here, we detail the procedure for implementing spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) measurements using a classical fluorescence microscope that has been customized. The protocol includes a specific performance check of the svFCS setup and the guidelines for molecular diffusion measurements by svFCS on the plasma membrane of living cells under physiological conditions. Additionally, we provide a procedure for disrupting plasma membrane raft nanodomains by cholesterol oxidase treatment and demonstrate how these changes in the lateral organization of the plasma membrane might be revealed by svFCS analysis. In conclusion, this fluorescence-based method can provide unprecedented details on the lateral organization of the plasma membrane with the appropriate spatial and temporal resolution.

This article aims to present a protocol on how to build a spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) microscope to measure molecular diffusion at the plasma membrane of living cells.

Spotvariations-Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie zur Analyse der molekularen Diffusion an der Plasmamembran lebender Zellen

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Biologie

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-Chip: Eine Label-freie Studie von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Biotechnik

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. Lipid rafts are membrane microdomains enriched in cholesterol and sphingolipids. They play a role in cellular physiological processes such as signalling, and trafficking1,2 but are also thought to be key players in several diseases including viral or bacterial infections and neurodegenerative diseases3.
Yet their existence is still a matter of controversy4,5. Indeed, lipid raft size has been estimated to be around 20 nm6, far under the resolution limit of conventional microscopy (around 200 nm), thus precluding their direct imaging. Up to now, the main techniques used to assess the partition of proteins of interest inside lipid rafts were Detergent Resistant Membranes (DRMs) isolation and co-patching with antibodies. Though widely used because of their rather easy implementation, these techniques were prone to artefacts and thus criticized7,8. Technical improvements were therefore necessary to overcome these artefacts and to be able to probe lipid rafts partition in living cells.
Here we present a method for the sensitive analysis of lipid rafts partition of fluorescently-tagged proteins or lipids in the plasma membrane of living cells. This method, termed Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), relies on the disparity in diffusion times of fluorescent probes located inside or outside of lipid rafts. In fact, as evidenced in both artificial membranes and cell cultures, probes would diffuse much faster outside than inside dense lipid rafts9,10. To determine diffusion times, minute fluorescence fluctuations are measured as a function of time in a focal volume (approximately 1 femtoliter), located at the plasma membrane of cells with a confocal microscope (Fig. 1). The auto-correlation curves can then be drawn from these fluctuations and fitted with appropriate mathematical diffusion models11.
FCS can be used to determine the lipid raft partitioning of various probes, as long as they are fluorescently tagged. Fluorescent tagging can be achieved by expression of fluorescent fusion proteins or by binding of fluorescent ligands. Moreover, FCS can be used not only in artificial membranes and cell lines but also in primary cultures, as described recently12. It can also be used to follow the dynamics of lipid raft partitioning after drug addition or membrane lipid composition change12.

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

A technique to probe the lipid raft partitioning of fluorescent proteins at the plasma membrane of living cells is described. It takes advantage of the disparity in diffusion times of proteins located inside or outside of lipid rafts. Acquisition can be performed dynamically in control conditions or after drug addition.

Bestimmung der Lipid Raft Partitionieren von Fluoreszenz-markierten Sonden in lebenden Zellen mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Hochdurchsatz-Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugerzellen

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Immunologie und Infektion

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabolische Markierung und Membran Fraktionierung für Vergleichende Proteomanalyse von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Fahrwerk Zellkulturen

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Bestimmung der Plasmamembran Partitionierung für peripher-assoziierte Proteine

Zusammenfassung

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Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine durch Transmissionselektronenmikroskopie

Gehirn Membran Fraktionierung: An

Stickstoff-Kavitation und differentielle Zentrifugation ermöglicht eine Überwachung der Verteilung von peripheren Membranproteinen in kultivierten Zellen

Native Cell Membrane Nanoparticles System für Membran-Protein-Protein-Interaktionsanalyse

Spotvariations-Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie zur Analyse der molekularen Diffusion an der Plasmamembran lebender Zellen

Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

PIP-on-a-Chip: Eine Label-freie Studie von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen

Bestimmung der Lipid Raft Partitionieren von Fluoreszenz-markierten Sonden in lebenden Zellen mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS)

Hochdurchsatz-Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugerzellen

Metabolische Markierung und Membran Fraktionierung für Vergleichende Proteomanalyse von

Bestimmung der Plasmamembran Partitionierung für peripher-assoziierte Proteine

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Gehirn Membran Fraktionierung: An

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Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

PIP-on-a-Chip: Eine Label-freie Studie von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen

Bestimmung der Lipid Raft Partitionieren von Fluoreszenz-markierten Sonden in lebenden Zellen mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS)

Hochdurchsatz-Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugerzellen

Metabolische Markierung und Membran Fraktionierung für Vergleichende Proteomanalyse von

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine durch Transmissionselektronenmikroskopie