פרויקט זה נתמך על ידי NPU, אני, LO1417 (משרד החינוך, נוער וספורט, של הרפובליקה הצ'כית).

<ol>
	<li>Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+composition+and+a+polybasic+motif+determine+D6+PROTEIN+KINASE+polar+association+with+the+plasma+membrane+and+tropic+responses.">Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses.</a> Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).</li><li>Kato, M., Aoyama, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ca2+-binding+protein+PCaP2+located+on+the+plasma+membrane+is+involved+in+root+hair+development+as+a+possible+signal+transducer.">The Ca2+-binding protein PCaP2 located on the plasma membrane is involved in root hair development as a possible signal transducer.</a> Plant J. 74 (4), 690-700 (2013).</li><li>Kubitscheck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence Microscopy: From Principles to Biological Applications. , (2013).</li><li>Janecki, A. J., Janecki, M., Akhter, S., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+plasma+membrane+expression+of+a+fusion+protein+of+Na/H+exchanger+NHE3+and+green+fluorescence+protein+(GFP)+in+living+PS120+fibroblasts.">Quantitation of plasma membrane expression of a fusion protein of Na/H exchanger NHE3 and green fluorescence protein (GFP) in living PS120 fibroblasts.</a> J Histochem Cytochem. 48 (11), 1479-1492 (2000).</li><li>Peitzsch, R. M., McLaughlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+acylated+peptides+and+fatty+acids+to+phospholipid+vesicles:+pertinence+to+myristoylated+proteins.">Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins.</a> Biochemistry. 32 (39), 10436-10443 (1993).</li><li>Vosolsob&#283;, S., Petr&#225;&#353;ek, J., Schwarzerov&#225;, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+plasticity+of+plasma+membrane+interaction+in+DREPP+family+proteins.">Evolutionary plasticity of plasma membrane interaction in DREPP family proteins.</a> Biochim Biophys Acta - Biomembr. 1859 (5), 686-697 (2017).</li><li>Bolte, S., Talbot, C., Boutte, Y., Catrice, O., Read, N. D., Satiat-Jeunemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM-dyes+as+experimental+probes+for+dissecting+vesicle+trafficking+in+living+plant+cells.">FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells.</a> J Microsc. 214 (2), 159-173 (2004).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A language and environment for statistical computing. , (2008).</li><li>Logan, D. C., Domergue, O., Teyssendier de la Serve, B., Rossignol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+family+of+plasma+membrane+polypeptides+differentially+regulated+during+plant+development.">A new family of plasma membrane polypeptides differentially regulated during plant development.</a> Biochem Mol Biol Int. 43 (5), 1051-1062 (1997).</li><li>Ide, Y., Nagasaki, N., Tomioka, R., Suito, M., Kamiya, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+properties+of+a+novel,+hydrophilic+cation-binding+protein+associated+with+the+plasma+membrane.">Molecular properties of a novel, hydrophilic cation-binding protein associated with the plasma membrane.</a> J Exp Bot. 58 (5), 1173-1183 (2007).</li><li>Nagasaki-Takeuchi, N., Miyano, M., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasma+membrane-associated+protein+of+Arabidopsis+thaliana+AtPCaP1+binds+copper+ions+and+changes+its+higher+order+structure.">A plasma membrane-associated protein of Arabidopsis thaliana AtPCaP1 binds copper ions and changes its higher order structure.</a> J Biochem. 144 (4), 487-497 (2008).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDP25,+A+Novel+Calcium+Regulatory+Protein,+Mediates+Hypocotyl+Cell+Elongation+by+Destabilizing+Cortical+Microtubules+in+Arabidopsis.">MDP25, A Novel Calcium Regulatory Protein, Mediates Hypocotyl Cell Elongation by Destabilizing Cortical Microtubules in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23 (12), 4411-4427 (2011).</li><li>Qin, T., Liu, X., Li, J., Sun, J., Song, L., Mao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+microtubule-destabilizing+protein+25+functions+in+pollen+tube+growth+by+severing+actin+filaments.">Arabidopsis microtubule-destabilizing protein 25 functions in pollen tube growth by severing actin filaments.</a> Plant Cell. 26 (1), 325-339 (2014).</li><li>Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+BY-2+Cell+Line+as+the+&amp;#34;HeLa&amp;#34;+Cell+in+the+Cell+Biology+of+Higher+Plants.">Tobacco BY-2 Cell Line as the &amp;#34;HeLa&amp;#34; Cell in the Cell Biology of Higher Plants.</a> Int Rev Cytol. 132, 1-30 (1992).</li><li>Hellens, R. P., Anne Edwards, E., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGreen:+A+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">pGreen: A versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol Biol. 42 (6), 819-832 (2000).</li><li>Vermeer, J. E. M., Thole, J. M., Goedhart, J., Nielsen, E., Munnik, T., Gadella, T. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+phosphatidylinositol+4-phosphate+dynamics+in+living+plant+cells.">Imaging phosphatidylinositol 4-phosphate dynamics in living plant cells.</a> Plant J. 57 (2), 356-372 (2009).</li><li>La&#328;kov&#225;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Dynamics+of+Plant+Plasma+Membrane+Proteins+with+Fluorescence+Recovery+and+Raster+Image+Correlation+Spectroscopy.">Determination of Dynamics of Plant Plasma Membrane Proteins with Fluorescence Recovery and Raster Image Correlation Spectroscopy.</a> Microsc Microanal. 22 (2), 290-299 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

השיטה המתוארת כאן יוצר אומדן מדויק יותר של קרום פלזמה למחיצות חלבונים הקשורים באופן עקיף לעומת גישות אחרות מבוסס על מדידת עוצמות קרינה פלואורסצנטית5. השיפור העיקרי של שיטה זו הוא כי זה לוקח בחשבון את שבירת האור ואת עקרון הסופרפוזיציה של קרום הפלזמה, את האותות cytoplasmic. למרות התו...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57837/determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally">Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins</a>. The Affiliations section was updated.
One of the affiliations was updated from:
Department of Experimental Plant Biology, University of Science, Charles University
to:
Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57837/determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally">Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins</a>. The Affiliations section was updated.

Erratum: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

באופן עקיף-הקשורים פלזמה-הממברנה חלבונים הם המרכיבים העיקריים של התא איתות המסלולים. אחד התפקידים הבסיסיים שלהם הוא שלהם האגודה קרום פלזמה ארעי, דיסוציאציה, וזה חשוב עבור אותות בין קרום פלזמה לבין הציטופלסמה. יכול להיות מצורף באופן עקיף-הקשורים קרום פלזמה חלבונים על קרום פלזמה השומנים עוגנים (N-myristoylation, S-acylation או prenylation) או על ידי השומנים מחייב תחומים (אינטראקציה עם מלחי phosphatidylinositol, חומצה phosphatidic, וכו).
קרום פלזמה מחייב מאפיינים של חלבונים אלה יכול להיות בדק ויוו, למשל, כאשר חלבון מתויג fluorescently שינה מוטגנזה של חומצות אמינו מפתח, או כאשר הוא מטופל עם מעכבי שונים המשפיעים השומנים איתות. חלוקות של חלבוני ממברנה פלזמה פריפריאלי בעיקר להיות מוערכים איכותית, במיוחד במקרים, כאשר חלוקה מחדש חלבון הוא ברור. השיטה הציג היא אופטימלית במצבים כאשר חלוקה מחדש של חלבון זה רק חלקי הערכה כמותית הוא הכרחי. בגישה בשימוש תכוף של מתי קרום פלזמה האגודה מוערך מן קונאפוקלית לייזר סריקה תמונות מיקרוסקופ כמו יחס של עוצמות קרינה פלואורסצנטית קרום הפלזמה, הציטופלסמה1,2, הוא פשוט, אבל לא . זה מדויק עוצמות קרינה פלואורסצנטית ב קרום פלזמה משקפים צירוף לינארי של קרום פלזמה, הציטופלסמה האות בשל תכונת עקיפה אור טכניקה מיקרוסקופית פלורסצנטיות מסוים של רכיבים אופטיים בשימוש3. כתוצאה מכך, האות cytoplasmic כלולה גם באיזור הממברנה. מסיבה זו, דפוס מכתימים FM 4-64 לא ניתן להשתמש כמסיכה עבור בחירת אות4ממברנה. יתר על כן, מדידות פשוטות של קרום אות במיקום המוגדר על-ידי FM 4-64 מכתים המרבי תמיד באופן שיטתי מגזים האות קרום פלזמה האמיתי של חלבון קרום פלזמה הקשורים באופן עקיף כתוצאה הסופרפוזיציה של ממברנה, cytoplasmic המתחם. המרבי של אותות שנצפה מתויג fluorescently חלבונים הקשורים באופן עקיף גם לא לשפה משותפת עם המרבי של דה מרקר קרום פלזמה (קרי, FM 4-64 styryl צבע), אבל הוא זז לכיוון הציטופלסמה. מגבלה נוספת היא מבוססת על העובדה FM שיא פליטת 4-64 היא רחבה יותר בהשוואה הפסגות פליטה ירוק ניאון חלבונים כמו GFP בשל אורך גל-התלות של שבירת אור3.
השיטה המתוארת כאן, האות חלבון מתויג מולבשת על ידי שתי פונקציות אמפירי המתארת את התפלגות היפותטי של קרום פלזמה ו אות ציטופלזמה, בהתאמה. זה פירוק האות מוחל על פרופילים פלורסצנטיות ליניארי שניתן להחיל על פני השטח תא בניצב קרום פלזמה בתמונות המקור, אשר רגיל, שני ערוצים מקטעים קונאפוקלית מתויג fluorescently חלבון להביע תאים עם FM 4-64 צבע תוויות.
הפונקציה הראשונה המשמש למדידות מתאר דיפרקציה של אות הציטופלסמה בקצה התא. קבלתו של פרופילי פלורסצנטיות שנרכשו בעבר נמדדו בתאים המבטאים סימן הפרוטאין. ציטופלזמה שתייגת על ידי כרומופור אותו כמו החלבון הקשורים באופן עקיף קרום פלזמה עניין. הפונקציה השנייה המתארת דיפרקציה של אות קרום פלזמה נגזרת של זריחה של FM 4-64. האות הזה מוערכת ראשית באמצעות פונקציה לפי עקומת גאוס אשר נמצא בשימוש עבור מידול משוער של אור עקיפה של המקור. שנית, מודל זה, חוקי עבור פליטת FM 4-64 אדום, מבחינה מתמטית כשהופכים את הטופס הרלוונטי עבור אורך גל פליטה של כרומופור להשתמש בתיוג של חלבונים הקשורים באופן עקיף של עניין-קרום פלזמה. שתי הפונקציות הן מנורמל עוצמת מירבית ועל ידי הממוצע מ 10% של הערכים הגבוהים ביותר עבור אות FM 4-64 ו אות cytoplasmic חלבון, בהתאמה. על ידי פירוק זה האות (שיטת המדידה מרובע לפחות לא לינאריות), היחס של קרום פלזמה לבין השבר הציטופלסמה של החלבון שנבדקו יכול להיות מוערך בקלות ובדייקנות. הממד ממשית של מקדם חלוקה למחיצות מחושב הוא בטווח של מיקרומטר, כי ריכוז עוצמה cytoplasmic מושווה ריכוז משטח על קרום פלזמה. הוא מגדיר את המרחק של קרום פלזמה אל הציטופלסמה, שבתוכו כמות זהה של חלבונים הוא מקומי כמו האזור הסמוך של קרום פלזמה. ערך זה שווה למחיצות המקדם K2 הציגה בעבר5. השיטה מהירה מאוד, הדורש יחיד רק מקטעים קונאפוקלית רכשה באמצעות סריקת מיקרוסקופ, לייזר קונפוקלי שגרתית, זה לא דורש שהמפתחות. הליבה ניתוח יושמה במארז נייד R ונכתב מאקרו נוספות של ImageJ כדי לספק ממשק משתמש גרפי להפעיל הניתוח של תיבות הדו-שיח אינטואיטיבי. תיאור מפורט יותר של השיטה ותוכנה (פורסם קודם לכן6) ניתן למצוא ב- http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.
השיטה מתאימה תאים בודדים, protoplasts, רקמות, איפה קרום פלזמה של תאים בודדים ניתן להבחנה ברורה, המבטאת מבנה מתויג fluorescently של בדק חלבונים הקשורים באופן עקיף. כרומופור תואמת ל- FM צביעת 4-64 יש להשתמש. FM 4-64 פולט פלואורסצנטי אדום; לכן, יכול להיות מתויגת חלבון שנבדקו על-ידי קרינה פלואורסצנטית חלבון עם כחול, ירוק או צהוב פליטה (למשל, ה-GFP, CFP, YFP). שינוי יציב של חומר ביולוגי מומלץ מכיוון שהיא מאפשרת תצפיות ומלאכותית יותר לשחזור פחות חלבון הפצה. זה הכרחי כי החלבון שנבדקו יש התפלגות cytoplasmic יחסית הומוגנית. הלוקליזציה של חלבון את רשתית תוך-פלזמית או אחר תאיים קרום התא יכול לייצר תוצאות מלאכותי.
בנוסף, יש להשתמש באותו חומר ביולוגי לבטא סמן cytoplasmic עבור ההשוואה. תאים יכול להיהפך של chomophore חינם (זהה לזה המשמש חלבון היקפיים תיוג, למשל, ה-GFP חינם) או על ידי חלבון מתויג עניין עם קיבולת איגוד ביטל ממברנה. ממברנה איגוד קיבולת שאפשר לבטל, לדוגמה, על-ידי חיתוך של התחום מחייב ממברנה או מוטגנזה של חומצת אמינו מפתח residua (למשל, אתרים עבור N-myristoylation, S-acylation, או prenylation, וכו ').
עבור מיקרוסקופיה קונפוקלית סריקה, יש ליצור תאים על-ידי סמן קרום כמו צבען FM 4-64. אם FM 4-64 מכתים אינו מתאים חומר לימודי (עקב autofluorescence מפריעות, צבע עניים חדירה, וכו '), קרום פלזמה ניתן שכותרתו, לדוגמה, על ידי חלבון ממברנלי אינטגרלי פלזמה מתויג כדי (chomophore המתאים mCherry, RFP, וכדומה). זה חיוני כי דה מרקר יש לוקליזציה זניח בתאים ממברנה תאיים (endomembranes).
אם עובדים עם נוגדנים ודוגמאות קבוע, שניתן לתקן אנלוגי FM 4-64FX או קרום פלזמה תיוג על ידי נוגדנים נגד מטרה המתאים יכול לשמש. במקרה זה, זה חיוני כדי להעריך את התוצאות בזהירות רבה כי קיבוע הליכים יכול להוביל לאובדן סלקטיבי של חלבונים הציטופלסמה והן קרום פלזמה.

<table><tbody><tr><td>FM 4-64</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T13320</td><td>Plasma membrane dye</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540 Sigma</td><td>Dye solvent</td></tr><tr><td>Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes)</td><td></td><td></td><td>Equipment for cell labelling and microscopy</td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ordinary computer</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determination of plasma membrane partitioning for peripherally-associated proteins

שיטה זו מספקת גישה מהירה על הקביעה של קרום פלזמה חלוקת כל מתויג fluorescently שמעניינת קשורה חלבון באמצעות הפרופילים של עוצמת קרינה פלואורסצנטית על פני קרום פלזמה. קרינה פלואורסצנטית נמדד פרופילים מצוידים על ידי מודל עבור ממברנה והפצה פלורסצנטיות הציטופלסמה לאורך קו שהוחל בניצב הפריפריה התא. מודל זה נבנה מתוך הערכים עוצמת קרינה פלואורסצנטית בתאים הפניה לבטא סמן מתויג fluorescently הציטופלסמה ועם קרום פלזמה 4-64-שכותרתו ' FM. השיטה שניתן להחיל על סוגי תאים שונים, אורגניזמים; עם זאת, ניתן להעריך רק ממברנות פלזמה של תאים שאינם סמוכים. בשיטה זו מבוסס מיקרוסקופיה מהר מתאימה עבור ניסויים, שבה צפויים שינויים עדינים ולא דינמי של קרום פלזמה-הקשורים סמני ו צורך ניתן לכמת, לדוגמא, בניתוח של גירסאות מוטציה של חלבונים, מעכב טיפולים, האות התמרה חושית תצפיות. השיטה מיושמת בחבילה R בפלטפורמות כי זה משולב עם מאקרו של ImageJ המשמשת ממשק ידידותי למשתמש.

DREPP10 הוא חלבון צמחים ספציפיים הקשורים באופן עקיף-קרום פלזמה המשויך קרום פלזמה דרך של N-myristoylation יחד עם אינטראקציה אלקטרוסטטית עם מלחי phosphatidylinositol11, 12. DREPP תוארה רכיב של מכונות איתות הסידן בתא צמח ויפעל גם עם שלד התא13...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins at JoVE.com

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע ניתוח כמותי של הרמה של התאחדות קרום פלזמה מתויג fluorescently חלבונים הקשורים באופן עקיף. השיטה מבוססת על פירוק חישובית של קרום ומרכיב cytoplasmic של האות נצפו תאים עם תוויות עם סמן פלורסנט קרום פלזמה.

קביעת חלוקה למחיצות של קרום פלזמה חלבונים הקשורים באופן עקיף

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally

Research

JoVE Journal

Biology

8.3K Views.  Faculty of Science, Charles University. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע ניתוח כמותי של הרמה של התאחדות קרום פלזמה מתויג fluorescently חלבונים הקשורים באופן עקיף. השיטה מבוססת על פירוק חישובית של קרום ומרכיב cytoplasmic של האות נצפו תאים עם תוויות עם סמן פלורסנט קרום פלזמה.

Video: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate neurotransmission that occurs within synapses because it is highly regulated by dynamic protein-protein interactions and phosphorylation events. Accordingly, when any method is used to study synaptic transmission, a major goal is to preserve these transient physiological modifications. Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments. In other words, the protocol describes a biochemical methodology to carry out protein enrichment from presynaptic, postsynaptic, and extrasynaptic compartments. First, synaptosomes, or synaptic terminals, are obtained from neurons that contain all synaptic compartments by means of a discontinuous sucrose gradient. Of note, the quality of this initial synaptic membrane preparation is critical. Subsequently, the isolation of the different subsynaptic compartments is achieved with light solubilization using mild detergents at differential pH conditions. This allows for separation by gradient and isopycnic centrifugations. Finally, protein enrichment at the different subsynaptic compartments (i.e., pre-, post- and extrasynaptic membrane fractions) is validated by means of immunoblot analysis using well-characterized synaptic protein markers (i.e., SNAP-25, PSD-95, and synaptophysin, respectively), thus enabling a direct assessment of the synaptic distribution of any particular neuronal protein.

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments.

קרום המוח Fractation: An<em&gt; אקס ויוו</em&gt; גישה כדי להעריך לוקליזציה חלבון subsynaptic

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently tagged proteins have revolutionized the study of subcellular protein distribution. However, it is difficult to quantify the distribution with fluorescent microscopy, especially when proteins are partially cytosolic. Moreover, it is often important to study endogenous proteins. Biochemical assays such as immunoblots remain the gold standard for quantification of protein distribution after subcellular fractionation. Although there are commercial kits that aim to isolate cytosolic or certain membrane fractions, most of these kits are based on extraction with detergents, which may be unsuitable for studying peripheral membrane proteins that are easily extracted from membranes. Here we present a detergent-free protocol for cellular homogenization by nitrogen cavitation and subsequent separation of cytosolic and membrane-bound proteins by ultracentrifugation. We confirm the separation of subcellular organelles in soluble and pellet fractions across different cell types, and compare protein extraction among several common non-detergent-based mechanical homogenization methods. Among several advantages of nitrogen cavitation is the superior efficiency of cellular disruption with minimal physical and chemical damage to delicate organelles. Combined with ultracentrifugation, nitrogen cavitation is an excellent method to examine the shift of peripheral membrane proteins between cytosolic and membrane fractions.

Here we present protocols for detergent-free homogenization of cultured mammalian cells based on nitrogen cavitation and subsequent separation of cytosolic and membrane-bound proteins by ultracentrifugation. This method is ideal for monitoring the partitioning of peripheral membrane proteins between soluble and membrane fractions.

קוויטציה חנקן, צנטריפוגה דיפרנציאלית מאפשר ניטור ההתפלגות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בתאים בתרבית

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ranging from nanometers to micrometers and microseconds to minutes, respectively. Such a broad range of biological processes challenges conventional microscopy approaches. Here, we detail the procedure for implementing spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) measurements using a classical fluorescence microscope that has been customized. The protocol includes a specific performance check of the svFCS setup and the guidelines for molecular diffusion measurements by svFCS on the plasma membrane of living cells under physiological conditions. Additionally, we provide a procedure for disrupting plasma membrane raft nanodomains by cholesterol oxidase treatment and demonstrate how these changes in the lateral organization of the plasma membrane might be revealed by svFCS analysis. In conclusion, this fluorescence-based method can provide unprecedented details on the lateral organization of the plasma membrane with the appropriate spatial and temporal resolution.

This article aims to present a protocol on how to build a spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) microscope to measure molecular diffusion at the plasma membrane of living cells.

ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית של וריאציה נקודתית לניתוח דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה של תאים חיים

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP על שבב: מחקר ללא תווית של אינטראקציות חלבון- phosphoinositide

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Bioengineering

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. Lipid rafts are membrane microdomains enriched in cholesterol and sphingolipids. They play a role in cellular physiological processes such as signalling, and trafficking1,2 but are also thought to be key players in several diseases including viral or bacterial infections and neurodegenerative diseases3.
Yet their existence is still a matter of controversy4,5. Indeed, lipid raft size has been estimated to be around 20 nm6, far under the resolution limit of conventional microscopy (around 200 nm), thus precluding their direct imaging. Up to now, the main techniques used to assess the partition of proteins of interest inside lipid rafts were Detergent Resistant Membranes (DRMs) isolation and co-patching with antibodies. Though widely used because of their rather easy implementation, these techniques were prone to artefacts and thus criticized7,8. Technical improvements were therefore necessary to overcome these artefacts and to be able to probe lipid rafts partition in living cells.
Here we present a method for the sensitive analysis of lipid rafts partition of fluorescently-tagged proteins or lipids in the plasma membrane of living cells. This method, termed Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), relies on the disparity in diffusion times of fluorescent probes located inside or outside of lipid rafts. In fact, as evidenced in both artificial membranes and cell cultures, probes would diffuse much faster outside than inside dense lipid rafts9,10. To determine diffusion times, minute fluorescence fluctuations are measured as a function of time in a focal volume (approximately 1 femtoliter), located at the plasma membrane of cells with a confocal microscope (Fig. 1). The auto-correlation curves can then be drawn from these fluctuations and fitted with appropriate mathematical diffusion models11.
FCS can be used to determine the lipid raft partitioning of various probes, as long as they are fluorescently tagged. Fluorescent tagging can be achieved by expression of fluorescent fusion proteins or by binding of fluorescent ligands. Moreover, FCS can be used not only in artificial membranes and cell lines but also in primary cultures, as described recently12. It can also be used to follow the dynamics of lipid raft partitioning after drug addition or membrane lipid composition change12.

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

A technique to probe the lipid raft partitioning of fluorescent proteins at the plasma membrane of living cells is described. It takes advantage of the disparity in diffusion times of proteins located inside or outside of lipid rafts. Acquisition can be performed dynamically in control conditions or after drug addition.

קביעת רפסודה ליפידים חלוקת בדיקות fluorescently-מתוייגים בתאים חיים באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Immunology and Infection

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא תרבויות השעיה

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

קביעת חלוקה למחיצות של קרום פלזמה חלבונים הקשורים באופן עקיף

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video