Bu proje NPU tarafından desteklenen ben LO1417 (Milli Eğitim Bakanlığı, gençlik ve spor Çek Cumhuriyeti).

1. biyolojik materyal hazırlanması
<ol><li>Biyolojik malzeme fluorescently tagged protein sitoplazmik bir işaretleyici yanı sıra ilgi ifade hazırlamak. Giriş bölümünde bahsedilen yordamları izleyin.</li>
</ol>2. confocal lazer mikroskobu tarama
<ol><li>4-64 boya7Bölüm 1 FM ile hazırlanan malzeme leke.<ol>
<li>Okudu malzeme için uygun olan bir boyama protokole uygulanır. Tütün BY-2 hücreleri için hücre süspansiyon 200 μL 0.2 μL 10 mm FM ile dimethylsulfoxide 4-64 çözümde leke. Not: FM tipik boyama konsantrasyonu 10 mikron dimethylsulfoxide içinde 10 mM hisse senedi çözüm kullanarak hakkında 4-64 boya olduğunu. FM 4-64 olası en düşük konsantrasyon uygun boyama için kullanın ve hücreler buz (FM 4-64 ve plazma zarı özellikleri etkiler düşük sıcaklık olabilir) üzerinde kuluçkaya değil. Hemen confocal mikroskobu kullanarak gözlem ile devam edin. Boyama ve resim alma arasındaki aralığı 10 dakika uzun olmamalıdır; Aksi takdirde, boya endositoz 4-64 boyama FM etkiler.</li>
		<li>Arka arkaya birden fazla örnekleri işlemek ve deney başında tüm örneklerini leke değil.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir hücre başına tek bir Ekvator confocal bölüm yakalamak.<ol>
<li>Tarama protein etiketi (ilk kanal olmalıdır) ve FM 4-64 (İkinci kanalda olması gerekir) olarak kullanılan chromophore için sıralı iki kanallı ayarlayın. Daha yüksek bir optik çözünürlük (10-20 px/mikron) ayarlayın. Bir örnek koymak-yukarıya: 63 X Petrol daldırma amaç, NA 1.3, görüntü boyutu 1024 x 1024 piksel. Plazma zarı uçak alınan görüntüleri confocal bölüm düzlemde dik olduğundan emin olun.</li>
		<li>Yakalama istatistiği değerlendirme için yeterli veriye sahip örnek başına en az 20 hücreleri (işlenmiş malzeme sinyal değişkenlik bağlıdır).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. gerekli yazılımı yükleme
<ol><li>Fiji ImageJ dağıtım8ve gerekli makro çevre yükleyin.<ol>
<li>Download bilgisayar yazılımı--dan site https://fiji.sc/#download ve açma tarafından yükle.</li>
		<li>Fiji açmak "Fiji.app" dizinindeki "ImageJ(.exe)" dosyasını çift tıklatarak başlatın.</li>
		<li>Bir makro "çevresel" aşağıdaki sitesinden yükleyin: http://kfrserver.Natur.cuni.cz/LiDE/vosolsob/Peripheral/Source/Peripheral_.ijm.</li>
		<li>Fiji'de, eklentileri seçin | Makrolar | Yüklemek için... Ana menüde ve belgili tanımlık downloaded eğe "Peripheral_.ijm." yolunu belirtin Not: İki yeni araç yüklü makro "çevresel" Fiji alet-ecek gözükmek: "Al profili aracı" ve "Periferik Protein menü."</li>
	</ol>
</li>
	<li>R-project yazılım9ve gerekli paketleri yükleyin.<ol>
<li>Site https://cloud.r-project.org/ R-project kurulum için yönergeleri izleyin. Not: Genel analiz Fiji'de gerçekleştirilecek. R yazılım yalnızca dahili olarak çağrılır Fiji makro "hesaplaması sırasında periferik" tarafından.</li>
		<li>R GUI çalıştırın, paketleri seçin | Paketler... yüklemek Ana menüde ve en yakın depo ve yükleme paketi "ggplot2" belirtin. Not: Alternatif olarak, R komut satırı yazın: install.packages("ggplot2").</li>
		<li>Hedeften periferik bir R paketini karşıdan yükleyin: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz. Onları paketleri seçerek yüklemek | Yerel dosyalarından paketleri yüklemek. Not: Alternatif olarak, bu komut yalnızca R komut satırı yazın: install.Packages ("http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz", repo = NULL, türü = "kaynak").</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. görüntü analizi Fiji
<ol><li>Sitoplazmik işaretin confocal görüntüleri işlemek.<ol>
<li>Eklentileri kullanarak Fiji'ye görüntüleri içe | Biyo-biçimleri | Biyo-biçimleri ithalatçı varsayılan ayarlarla Fiji menüsünden.</li>
		<li>Bio-biçimleri ithalatçı düzgün görüntü kalibrasyon tanınan kontrol edin. Üst sol bilgi alan görüntü penceresinde gösterilen resim boyut özgün resim boyutlarına eşit olmalıdır.</li>
		<li>Tedavi hatalı ve yanlış görüntülerle kalibre tek tek, Örneğin, iletişim penceresinde analiz doğru parametreleri ayarlayarak Boyutlar | Ölçek küme Fiji menüsünden: resim genişliğini piksel uzaklığını piksel alanını ve mesafe bilinen alana uygun uzunluk birimindeki gerçek genişliği içine doldurun). Not: Leica LCS LEI dosyaları düzgün kalibre, adım 4.2.1 izleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Bir analiz set-up için içe aktarma seçenekleri makro çalıştırın. Makro üç farklı yoldan birini etkinleştirmek: eklentileri seçin | Makrolar | İçe aktarma seçenekleri [f1] Fiji öğesini, aynı madde menü aracı Periferik Protein menütıkladıktan sonra veya klavye tuşuna basın seçin kısa kesilmiş F1. Parametre çağrılan makro iletişim penceresinde ayarlayın.<ol>
<li>Leica LCS LEI biçimi durumunda yanlış kalibrasyon Leica.lei görüntüleri onay kutusunu etkinleştirerek çözmek. Bu seçenek düzgün görüntü boyutları "lei" uzantılı dosyadan içe aktarır.</li>
		<li>Uygun değeri Gaussian blur RADIUS (px)alanında tanımlayın. Bu resim yumuşatma ve gürültü azaltma etkiler. Düşük bir değer (1 px) yeterli ve herhangi bir resmi bilgi kaybına neden olmaz.</li>
		<li>Profil çizgi genişliği (piksel)alanında bir değer ayarlayın. Daha kalın bir çizgi daha yüksek profil eğrileri düzgünleştirme neden olur. Varsayılan değer 10 px önerilir.</li>
		<li>"Örnek sınırlayıcıları" ve "Exported öğeler." tanımına göre ayrıştırma bir görüntü başlık ayarla Not: Bir görüntü başlığı (dosya adı uzantısı, Örneğinolmadan: "Deney-1_line-02_cell-11") "Örnek sınırlayıcıları" alanında listelenen tüm karakterler etrafında bölünmüş olacaktır (Örneğin: "-_") öğelerinin bir kümesini içine ("Deney", "1"," çizgi","02","hücre"ve"11") faktörler gruplandırma (örnek, hücre, satır ya da tedavi kimlik) aşağıdaki analizi olarak kullanılabilir. Dosyalanmış "öğeleri dışa." içine onların sıra numarası (ilk öğe için "0") yazarak kullanılacak hangi maddeleri tanımlamak Örneğin, "3 5." alanı ayrılmış biçimde kullanın Örneğin, öğeleri "02" ve "11" için "Fac_0" ve "Fac_1." adlı faktörler gruplandırma olarak başvurulabilir. Ayrıca, "Ben" faktör gibi kimlik her ölçüm için anılacaktır.</li>
		<li>Alternatif olarak, örnek sınırlayıcıları boş tutmak ve tam görüntü başlık tutulabilir, 0 Exported öğeleri girin.</li>
		<li>Windows işletim sistemi üzerinde doğru otomatik tespit R yazılımı için yol alan R.exe yolunuolacak eğer kontrol edin. Aksi durumda, R.exe dosyasının tam yolunu (Örneğin, "C:\Program Files\R\bin\R.exe") içinde belgili tanımlık sistem belirtin.</li>
		<li>Tamam' ı tıklatın. Sonraki iletişim penceresinde ayrıştırma başlığı denetleyin ve Tamam'ı veya geri sıfırlamak için tıklatın. Not: Tüm resimler otomatik olarak düzeltti ve sonunda yeniden. A liste-in tüm verilen gruplandırma faktörler sonuçları penceresinde görüntülenir.</li>
	</ol></li>
	<li>Plazma zarı bölge işlenmiş görüntüler arasında doğrusal bir seçim yapmak ve floresan profilleri ölçün.<ol>
<li>Fiji aracı düz çizgi Fiji araç çubuğundan seçin. Resmi tıklayın ve plazma zarı bölgede bir çizgiyi sürükleyin. Yolun ekstrasellüler alanda başlamalı ve plazma zarı dik olmalıdır. Kortikal sitoplazma daha kalın ve daha homojen tabakası ile bölgeleri seçin. En uygun doğrusal seçimi 5-10 mikron uzunluğudur.</li>
		<li>Profil makro almak adım 4.2 (kısayol "x") olduğu gibi analog yöntemi veya profil aracı almak Fiji araç çubuğu tıklatarak çalıştırın. Her iki kanal floresans profilleri otomatik ölçüm gerçekleştirilecek ve veri sonuçları penceresinde görüntülenir.</li>
		<li>"X" tuşunu kullanarak user-unfriendly olduğu düşünülürse, makro kaynak dosyasını Peripheral_.ijm metin editöründe açın, satırında "x" simgesini değiştirme ' makro "Take profili [x]" {' daha olumlu bir sembol ile (değil Fiji ortamında kullanılan bir etkin klavye kısa) ve dosyayı kaydedin. Makro (adım 3.1.4) eski mevkiini geri vermek ve analiz görüntü alma başlatın.</li>
		<li>Bireysel sinyal değişkenliğine göre her hücre için profilleri temsilcisi sayılar mesela.</li>
		<li>Dosya üzerinden veri kaydetmek | Farklı Kaydet.... Her zaman "csv" uzantısı kullanın; uygun veri biçimi için gereklidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Profil veri makrosu Arsa (kısa F5) ölçülen profilleri grafik görüntüleme için çalıştırın. Parametre çağrılan makro iletişim penceresinde ayarlayın.<ol>
<li>Onay kutusunun devam kullanım için filtre uygulama veri giriş? seçilmemiş.</li>
		<li>Arsa son veri sonuç penceresinde, bir tek CSV dosyası veya belirtilen bir dizinde uygun radyo düğmesini tıklatarak Tüm CSV dosyaları oluşturulacağını belirtin. Not: Arsa son sonuçlarından oluşturduysanız, veri önce otomatik olarak kaydedilir (Farklı Kaydet... iletişim-ecek otomatik olarak harekete geçirmek).</li>
		<li>Hangi Gruplandırma faktörler uygun onay kutularını işaretleyerek çizmek için kullanılan belirtin. Tüm profilleri içinde benzersiz araziler görüntülenmesi gereken faktör "Ben" seçin. Eğer tüm verileri tarafından seçilmemiş, onay kutularını tek bir arsa çizilen tutun. Dikkat: işlenmiş sonuçları nedenler hata komplo oluşturma sırasında yok bir gruplandırma faktör seçme.</li>
		<li>Bir çizim alanına Çıkış dosya öneki kaydederken dosya adı belirtin ve eğe içinde Arsa yüksek ve Arsa genişliğiArsa görüntü boyutlarını tanımlayın. Not: Elde edilen arsa bir kaynak veri dizininde bir PNG dosyası olarak kaydedilir.</li>
		<li>Seçin Pdf çıktı onay kutusunu üretilen bir ek PDF çıktısını alırsanız.</li>
		<li>Tamam' ı tıklatın. Sonuçları kaydetmek için yol belirtin veya sonunda veri için sonraki iletişim penceresinde. Analiz Tamam gerçekleştirilen R kod gösterilen iletişim windows'tıklayarak onaylayın. Not: Arsa yeni bir görüntü penceresinde açılır ve R analiz çıktı metin penceresinde listelenir.</li>
	</ol></li>
	<li>Çizilen bazı profiller (tagged protein için) ekstrasellüler alanda veya (için FM 4-64 sinyal) hücre içi uzayda aşırı sinyalleri varsa Kurulum makro profili süzme (kısa F2) çalıştırın. Çağrılan makro iletişim penceresinde parametreleri ayarlayarak izleyin. Not: Filtre uygulama en fazla izin verilen yoğunluğu eşik belirtilen x-koordinatları göre yoksul profilleri kaldırılmasını sağlar.<ol>
<li>Her kanal için uygun yoğunluk eşik ölçümler bir aşırı ekstraselüler (hücre içi) sinyali ile kaldırmakayarlanmaya. Nerede yoğunluğu eşik uygulanacak bölge alanını x-koordinatlarda (büyüktür) daha düşükolarak belirtin.</li>
		<li>Profil veri makrosu Arsa (adım 4.4) yeniden onay kutusunun çalıştırın kullanım için filtre uygulama veri giriş? seçilmiş; tüm anormal profilleri başarılı bir şekilde kaldırıldı emin olun. Aksi takdirde, filtre parametreleri (adım 4.5.1) geliştirmek.</li>
	</ol></li>
	<li>Plazma zarı ve sitoplazma floresans dağıtım kalibrasyon verileri temel alan bir model oluşturmak için Create modeli makro (kısa F3) çalıştırın. Çağrılan makro iletişim penceresinde parametreleri ayarlayarak izleyin.<ol>
<li>Seçerek verilerin filtre uygulanmış (adım 4.5) olmalıdır eğer belirtmek kullanım için filtre uygulama veri giriş? onay kutusu.</li>
		<li>Pratiği olduğu gibi adım 4.4.2 kaynak verileri belirtin.</li>
		<li>Hangi modeli "Başlat"son"," tanımına göre öngörülen ve "adım" değerleri bir aralığı mikron belirtin. Not: Tüm profil ölçüleri belirtilen aralığından daha uzun olmalıdır.</li>
		<li>Kullanılmış, uygun alanlara kromofor floresans dalgaboyu uyarma ve emisyon maxima belirtin. 4-64 birleşimi GFP ve FM için Varsayılanları belirler. Not: "GFP" etiketleme (GFP, CFP, YFP, vb) protein için kullanılan chromophore ve "FM4" bir plazma zarı (genellikle FM 4-64) boyama için kullanılan chromophore gösterir.</li>
		<li>Çıkış dosya öneki alanı belirtin. Önek elde edilen modeli kaynak veri dizinine RData dosya olarak kaydetmek için kullanılır.</li>
		<li>Onay kutusunu işaretleyin Arsa modeli? Grafik çıkış gerekiyorsa. Arsa PNG ve ayrıca PDF dosyası olarak kaydedilir Pdf çıktı? onay kutusu seçilidir.</li>
		<li>Tamam' ı tıklatın. Girdi belirtin veya bir sonraki iletişim Windows'daki çıkış ve Analizi gerçekleştirilen R kod gösterilen iletişim penceresinde OK tıklayarak onaylayın. Not: Arsa modellenmiş sitoplazmik ve periferik ilişkili protein floresans membran bileşik yeni görüntü penceresinde gösterilecek ve R analiz çıktı metin penceresinde listelenir.</li>
	</ol></li>
	<li>Protein ilgi ifade hücreleri görüntülerini işlemek.<ol>
<li>Adım 4.1 olduğu gibi pratiği görüntüleri içe.</li>
		<li>Pratiği olduğu gibi adım 4.2 çözümleme ayarlayın. Yumuşatma ve çizgi genişliği aynı olması gerekir.</li>
		<li>Profilleri pratiği olduğu gibi adım 4.3 ölçmek.</li>
		<li>(Adım 4.4) komplo tarafından profilleri doğruluğunu kontrol ve (adım 4.5) isterseniz filtre ayarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Calculate dağıtım makro (kısa F4) bir protein plazma zarı arasında ve sitoplazmada bölümleme hesaplaması için çalıştırın. Parametre ayarı çağrılan makro iletişim penceresinde izleyin.<ol>
<li>Pratiği önceki adıma (adım 4.4), veri kaynağı, filtreleme ve dosya adı önekini belirtin.</li>
		<li>Protein dağıtım hesaplaması için modeli "Çevresel" makro Fiji (Seç onay kutusunu son sonuç) üzerinde son örneğini son model hesaplama veya RData dosyası (dolu olmadığını belirtin onay kutusunu "dosya"işaretleyin).</li>
		<li>Kutuyu bir sonuç filtreleme isteniyorsa aktif kalan değişkenliği daha büyük sonuçlar çıkarmak tutun. Bireysel profil ölçüm sinyal ayrıştırma tarafından açıklanamayan maksimum izin verilen kalan değişkenlik eşiği belirtin. Örneğin: floresan yoğunluğu profil toplam değişkenliği açıklanamayan değişkenlik 20 daha yüksek ile tüm ölçüm atılacak 0.200 değeri gösterir.</li>
		<li>Kutu-arsa oluşturma (adım için 4.4) kullanılabilir örnek gruplandırma faktörler, seçin.</li>
		<li>Onay kutusunu etkinleştirmek Pdf çıktı? kutu arsa PDF dosyası olarak kaydetmek için.</li>
		<li>Tamam' ı tıklatın, giriş belirtin veya çıkış yolları ve Analizi gerçekleştirilen R kod gösterilen iletişim penceresinde OK tıklayarak onaylayın. Not: Plazma zarı ve sitoplazma arasında periferik ilişkili protein bölümleme kutu arsa yeni bir görüntü penceresinde gösterilecek ve R analiz çıktı metin penceresinde listelenir.</li>
		<li>Dış işlem için dosya üzerinden sonuçları penceresinde görüntülenen sonuçları kaydetmek | Farklı Kaydet... Pencere menüsünde.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+composition+and+a+polybasic+motif+determine+D6+PROTEIN+KINASE+polar+association+with+the+plasma+membrane+and+tropic+responses.">Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses.</a> Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).</li><li>Kato, M., Aoyama, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ca2+-binding+protein+PCaP2+located+on+the+plasma+membrane+is+involved+in+root+hair+development+as+a+possible+signal+transducer.">The Ca2+-binding protein PCaP2 located on the plasma membrane is involved in root hair development as a possible signal transducer.</a> Plant J. 74 (4), 690-700 (2013).</li><li>Kubitscheck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence Microscopy: From Principles to Biological Applications. , (2013).</li><li>Janecki, A. J., Janecki, M., Akhter, S., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+plasma+membrane+expression+of+a+fusion+protein+of+Na/H+exchanger+NHE3+and+green+fluorescence+protein+(GFP)+in+living+PS120+fibroblasts.">Quantitation of plasma membrane expression of a fusion protein of Na/H exchanger NHE3 and green fluorescence protein (GFP) in living PS120 fibroblasts.</a> J Histochem Cytochem. 48 (11), 1479-1492 (2000).</li><li>Peitzsch, R. M., McLaughlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+acylated+peptides+and+fatty+acids+to+phospholipid+vesicles:+pertinence+to+myristoylated+proteins.">Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins.</a> Biochemistry. 32 (39), 10436-10443 (1993).</li><li>Vosolsob&#283;, S., Petr&#225;&#353;ek, J., Schwarzerov&#225;, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+plasticity+of+plasma+membrane+interaction+in+DREPP+family+proteins.">Evolutionary plasticity of plasma membrane interaction in DREPP family proteins.</a> Biochim Biophys Acta - Biomembr. 1859 (5), 686-697 (2017).</li><li>Bolte, S., Talbot, C., Boutte, Y., Catrice, O., Read, N. D., Satiat-Jeunemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM-dyes+as+experimental+probes+for+dissecting+vesicle+trafficking+in+living+plant+cells.">FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells.</a> J Microsc. 214 (2), 159-173 (2004).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A language and environment for statistical computing. , (2008).</li><li>Logan, D. C., Domergue, O., Teyssendier de la Serve, B., Rossignol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+family+of+plasma+membrane+polypeptides+differentially+regulated+during+plant+development.">A new family of plasma membrane polypeptides differentially regulated during plant development.</a> Biochem Mol Biol Int. 43 (5), 1051-1062 (1997).</li><li>Ide, Y., Nagasaki, N., Tomioka, R., Suito, M., Kamiya, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+properties+of+a+novel,+hydrophilic+cation-binding+protein+associated+with+the+plasma+membrane.">Molecular properties of a novel, hydrophilic cation-binding protein associated with the plasma membrane.</a> J Exp Bot. 58 (5), 1173-1183 (2007).</li><li>Nagasaki-Takeuchi, N., Miyano, M., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasma+membrane-associated+protein+of+Arabidopsis+thaliana+AtPCaP1+binds+copper+ions+and+changes+its+higher+order+structure.">A plasma membrane-associated protein of Arabidopsis thaliana AtPCaP1 binds copper ions and changes its higher order structure.</a> J Biochem. 144 (4), 487-497 (2008).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDP25,+A+Novel+Calcium+Regulatory+Protein,+Mediates+Hypocotyl+Cell+Elongation+by+Destabilizing+Cortical+Microtubules+in+Arabidopsis.">MDP25, A Novel Calcium Regulatory Protein, Mediates Hypocotyl Cell Elongation by Destabilizing Cortical Microtubules in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23 (12), 4411-4427 (2011).</li><li>Qin, T., Liu, X., Li, J., Sun, J., Song, L., Mao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+microtubule-destabilizing+protein+25+functions+in+pollen+tube+growth+by+severing+actin+filaments.">Arabidopsis microtubule-destabilizing protein 25 functions in pollen tube growth by severing actin filaments.</a> Plant Cell. 26 (1), 325-339 (2014).</li><li>Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+BY-2+Cell+Line+as+the+&amp;#34;HeLa&amp;#34;+Cell+in+the+Cell+Biology+of+Higher+Plants.">Tobacco BY-2 Cell Line as the &amp;#34;HeLa&amp;#34; Cell in the Cell Biology of Higher Plants.</a> Int Rev Cytol. 132, 1-30 (1992).</li><li>Hellens, R. P., Anne Edwards, E., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGreen:+A+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">pGreen: A versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol Biol. 42 (6), 819-832 (2000).</li><li>Vermeer, J. E. M., Thole, J. M., Goedhart, J., Nielsen, E., Munnik, T., Gadella, T. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+phosphatidylinositol+4-phosphate+dynamics+in+living+plant+cells.">Imaging phosphatidylinositol 4-phosphate dynamics in living plant cells.</a> Plant J. 57 (2), 356-372 (2009).</li><li>La&#328;kov&#225;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Dynamics+of+Plant+Plasma+Membrane+Proteins+with+Fluorescence+Recovery+and+Raster+Image+Correlation+Spectroscopy.">Determination of Dynamics of Plant Plasma Membrane Proteins with Fluorescence Recovery and Raster Image Correlation Spectroscopy.</a> Microsc Microanal. 22 (2), 290-299 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada anlatılan yöntem floresans yoğunluklarda5ölçme üzerinde dayalı diğer yaklaşımlar göre periferik ilişkili proteinler için plazma zarı bölümleme daha doğru bir tahmin oluşturur. Bu yöntemin önemli gelişme bu ışık kırınım ve süperpozisyon plazma zarı ve sitoplazmik sinyalleri dikkate alır olduğunu. Bu yöntem sonuçlar floresan yoğunluğu ile ortalama sitoplazmik membran konumundaki karşılaştırılması temel alan bir basit yöntemi sonuçları ile ilişki i?...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57837/determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally">Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins</a>. The Affiliations section was updated.
One of the affiliations was updated from:
Department of Experimental Plant Biology, University of Science, Charles University
to:
Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57837/determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally">Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins</a>. The Affiliations section was updated.

Erratum: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Periferik ilişkili plazma-membran proteinlerinin yolları sinyal cep anahtar bileşenleri vardır. Temel rollerini onların geçici plazma zarı Derneği ve plazma zarı ve sitoplazma arasında sinyal iletimi için önemlidir ayrılma biridir. Plazma zarı periferik ilişkili proteinler plazma membran üzerinde lipid çapa (N-miristoillenme, S-asilasyonu veya prenilasyon) veya (etkileşim phosphatidylinositol fosfat, phosphatidic asit, ile lipid bağlayıcı etki alanları eklenebilir vb).
Plazma zarı bağlama özellikleri bu proteinlerin olabilir vivo içinde Örneğin, bir fluorescently öğesini protein temel amino asitler bir site yönettiği mutagenesis tarafından değiştirildiğinde, etkileyen çeşitli inhibitörleri ile tedavi ederken incelendi lipid işaret. Protein yeniden dağıtılması açık olduğunda özellikle durumlarda, periferik plazma membran proteinlerinin dağılımları çoğunlukla nitelik, değerlendirilen. Sunulan protein yeniden dağıtımı yalnızca kısmi ve kantitatif değerlendirilmesi gerekli olduğunda durumlar için en iyi yöntemdir. Sık kullanılan bir yaklaşım ne zaman plazma zarı Derneği confocal üzerinden tahmin edilmektedir, lazer tarama mikroskobu görüntüleri bir oranı floresans yoğunluklarını plazma zarı ve sitoplazma1,2, ama basit değil gibi doğru. Plazma zarı koyulukları floresan ışık kırınım özelliği nedeniyle plazma zarı ve sitoplazma sinyal belirli floresans mikroskobu tekniği ve optik öğeleri kullanılan3için süperpozisyon yansıtır. Sonuç olarak, sitoplazmik sinyal aynı membran bölgede yer alır. Bu nedenle, FM 4-64 boyama desen bir membran sinyal seçimi4için bir maske olarak kullanılamaz. Ayrıca, gerçek plazma zarı sinyal periferik ilişkili plazma-membran protein süperpozisyon nedeniyle membran sinyal FM 4-64 sistematik olarak her zaman maksimum boyama tarafından tanımlanan konumundaki basit ölçümleri abartma membran ve sitoplazmik bileşik. Gözlenen sinyaller fluorescently öğesini periferik ilişkili proteinler için maksimum da plazma zarı marker (yani, FM 4-64 styryl boya) maksimum ile birlikte yerelleştirmek değil ama sitoplazma doğru kaymıştır. FM 4-64 emisyon en yüksek ışık kırınım3dalga boyu bağımlılığı nedeniyle GFP gibi yeşil flüoresan proteinler için emisyon zirveleri ile karşılaştırıldığında daha geniş gerçeğine dayalı başka bir kısıtlamadır.
Burada açıklanan yöntemde tagged protein sinyal varsayımsal dağılımı plazma zarı ve sitoplazma sinyal, sırasıyla açıklayan iki ampirik işlevleri tarafından takılmıştır. Bu sinyal ayrışma hücre yüzeyine dik plazma membran protein fluorescently öğesini ifade düzenli, iki kanallı confocal bölümleri kaynak görüntüler için uygulanan lineer floresan profilleri uygulanır FM 4-64 boya ile etiketli hücreleri.
Montaj için kullanılan ilk işlev hücre kenarında bir kırınım bir sitoplazma sinyal açıklar. Plazma zarı periferik ilişkili protein ilgi olarak aynı chromophore tarafından öğesini bir sitoplazma protein marker ifade hücrelerdeki ölçüldü daha önce alınan floresans profilleri elde edilir. Bir plazma zarı sinyal bir kırınım açıklayan ikinci işlev FM 4-64 floresans türetilmiştir. Bu sinyal öncelikle bir nokta kaynak ışık kırınım yaklaşık bir modelleme için kullanılmakta olan bir Gauss işlev tarafından yaklaşık. İkinci olarak, bu model, kırmızı FM 4-64 emisyon için geçerli matematiksel bir emisyon dalga boyu periferik ilişkili proteinler plazma zarı, ilgi etiketleme için kullanılan chromophore ilgilidir forma dönüşür. Her iki işlevleri sırasıyla maksimum yoğunluk ve en yüksek değerleri FM 4-64 sinyal ve sitoplazmik protein sinyal, yüzde 10'u ortalamasından normalleştirilmiş. Bu sinyal ayrıştırma tarafından (doğrusal olmayan en azından kare uygun yöntemi), plazma zarı oranını ve muayene protein sitoplazma kısmını kolayca ve doğru bir şekilde tahmin edilebilir. Hesaplanan bölümleme katsayısı gerçek fiziksel boyut mikrometre, aralıkta çünkü sitoplazmik birim konsantrasyon plazma membran yüzey konsantrasyon ile karşılaştırılır. Plazma zarı mesafe içinde plazma zarı bitişik alan olduğu gibi proteinler aynı miktarda yerelleştirilmiştir sitoplazma tanımlar. Bu değer bölümleme için eşdeğerdir katsayısı K2 tanıttı daha önce5. Çok hızlı, mikroskop, tarama rutin confocal lazer kullanılarak kazanılması sadece tek confocal bölümleri gerektiren yöntemdir ve değil hesaplama açısından talep ediyor. Analiz çekirdek bir taşınabilir R pakette uygulamaya konmuştur ve ek bir ImageJ makro analiz sezgisel iletişim kutuları çalıştırmak için grafik kullanıcı arabirim sağlamak için yazıldı. Yazılım ve daha ayrıntılı bir açıklama yöntemi (daha önce yayınlanmamış6) http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/ bulunabilir.
Yöntem izole hücreler, önceki ve dokular, uygun olan bireysel hücrelerin plazma zarı açıkça ayırt olduğu yerde bir fluorescently öğesini yapı ifade periferik ilişkili protein inceledi. 4-64 boyama kullanılmalıdır FM ile uyumlu bir chromophore. FM 4-64 kırmızı floresans yayar; Bu nedenle, muayene protein-ebilmek var olmak tagged floresans protein ile mavi, yeşil ya da sarı emisyon (Örneğin, GFP, CFP, YFP) tarafından. Protein dağıtım daha az yapay ve daha tekrarlanabilir gözlemleri sağladığından biyolojik malzemenin istikrarlı dönüştürme önerilir. Muayene protein nispeten homojen bir sitoplazmik dağılımı gösterir gereklidir. Endoplazmik retikulum veya başka bir hücre içi membran yuvası bir proteinin yerelleştirme yapay sonuçlar verebilir.
Ayrıca, sitoplazmik bir işaretleyici ifade aynı biyolojik malzeme karşılaştırma için kullanılması gerekir. Hücre membran kaldırıldı bağlama kapasitesi ile ücretsiz chomophore (aynı etiketleme, Örneğin, ücretsiz GFP periferik protein için kullanılan) veya ilgi tagged protein dönüştürülebilir. Membran bağlama kapasitesi, örneğin, kırpma membran bağlayıcı etki alanının veya site yönettiği mutagenesis anahtar amino asit residua (Örneğin, N-miristoillenme, S-asilasyonu, ya da prenilasyon, vbsiteleri), kaldırılmış.
Confocal tarama Mikroskopi için hücre membran marker FM 4-64 boya gibi tarafından etiketlenmesi gerekir. 4-64 boyama FM (nedeniyle sokan autofluorescence, zavallı Boya Penetrasyon, vb) okudu malzeme için uygun değilse, plazma zarı, örneğin, etiketli bir uygun chomophore (ayrılmaz plazma membran protein tarafından etiketli mCherry, RFP, vb). İşaretçiyi hücre içi membran bölmeleri (endomembranes) ihmal edilebilir yerelleştirme olması zorunludur.
Eğer sabit örnekleri ve antikorlar ile çalışma, düzeltilebilir analog FM 4-64FX veya uygun bir hedef karşı antikor tarafından plazma zarı etiketleme kullanılabilir. Bu durumda, fiksasyon yordamlar sitoplazma ve plazma zarı proteinler seçici kaybına yol açabilir çünkü sonuçları çok dikkatli bir şekilde değerlendirmek için esastır.

<table><tbody><tr><td>FM 4-64</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T13320</td><td>Plasma membrane dye</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540 Sigma</td><td>Dye solvent</td></tr><tr><td>Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes)</td><td></td><td></td><td>Equipment for cell labelling and microscopy</td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ordinary computer</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determination of plasma membrane partitioning for peripherally-associated proteins

Bu yöntem plazma zarı arasında floresan yoğunluğu profilleri kullanarak herhangi bir fluorescently öğesini periferik ilişkili protein plazma zarı bölümleme belirlenmesi için hızlı bir yaklaşım sağlar. Ölçülen floresans profilleri dik hücre çevre için uygulanan bir çizgi boyunca membran ve sitoplazma floresans dağıtım için bir model ile donatılmıştır. Bu model fluorescently öğesini işaret sitoplazma ve FM 4 64 etiketli plazma zarı ile ifade başvuru hücrelerdeki floresan yoğunluğu değerleri üzerinden inşa edilmiştir. Yöntemi çeşitli hücre tipleri ve organizmalar için uygulanabilir; Ancak, sadece plazma zarı olmayan komşu hücre değerlendirilebilir. Bu hızlı mikroskobu tabanlı yöntem deneyler, nerede plazma zarı ilişkili işaretçileri ince ve dinamik değişiklikler bekleniyor ve sayısal gerek, Örneğin, proteinler, önleyici tedaviler mutant sürümleri analiz için uygundur, ve sinyal iletim gözlemler. Kullanıcı dostu bir arabirim olarak hizmet veren bir ImageJ makro ile birleştiğinde bir çoklu platform R paket içinde uygulanan yöntemi.

DREPP10 ' dur bir N-miristoillenme ve phosphatidylinositol fosfat11, ile elektrostatik bir etkileşim yoluyla plazma zarı ile ilişkili bir bitki özgü periferik ilişkili plazma-membran proteini 12. DREPP kalsiyum sinyalli makine bitki hücresinde bir bileşeni olarak tanımlanmıştır ve ayrıca sitoiskeleti13,14ile etkileşime girer. Sunulan d...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins at JoVE.com

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Burada, plazma zarı Derneği düzeyinin kantitatif analiz için periferik ilişkili protein fluorescently öğesini gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yöntemi membran Hesaplamalı ayrışma ve plazma zarı floresan marker ile etiketli hücrelerdeki gözlenen sinyal sitoplazmik bileşeni dayanmaktadır.

Plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally

Research

JoVE Journal

Biology

8.3K Görüntüleme.  Faculty of Science, Charles University. Burada, plazma zarı Derneği düzeyinin kantitatif analiz için periferik ilişkili protein fluorescently öğesini gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yöntemi membran Hesaplamalı ayrışma ve plazma zarı floresan marker ile etiketli hücrelerdeki gözlenen sinyal sitoplazmik bileşeni dayanmaktadır.

Video: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Biyokimya

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate neurotransmission that occurs within synapses because it is highly regulated by dynamic protein-protein interactions and phosphorylation events. Accordingly, when any method is used to study synaptic transmission, a major goal is to preserve these transient physiological modifications. Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments. In other words, the protocol describes a biochemical methodology to carry out protein enrichment from presynaptic, postsynaptic, and extrasynaptic compartments. First, synaptosomes, or synaptic terminals, are obtained from neurons that contain all synaptic compartments by means of a discontinuous sucrose gradient. Of note, the quality of this initial synaptic membrane preparation is critical. Subsequently, the isolation of the different subsynaptic compartments is achieved with light solubilization using mild detergents at differential pH conditions. This allows for separation by gradient and isopycnic centrifugations. Finally, protein enrichment at the different subsynaptic compartments (i.e., pre-, post- and extrasynaptic membrane fractions) is validated by means of immunoblot analysis using well-characterized synaptic protein markers (i.e., SNAP-25, PSD-95, and synaptophysin, respectively), thus enabling a direct assessment of the synaptic distribution of any particular neuronal protein.

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments.

Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir<emEx Vivo</em&gt; Subsınaptik Protein Lokalizasyonunu Değerlendirmede Yaklaşım

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently tagged proteins have revolutionized the study of subcellular protein distribution. However, it is difficult to quantify the distribution with fluorescent microscopy, especially when proteins are partially cytosolic. Moreover, it is often important to study endogenous proteins. Biochemical assays such as immunoblots remain the gold standard for quantification of protein distribution after subcellular fractionation. Although there are commercial kits that aim to isolate cytosolic or certain membrane fractions, most of these kits are based on extraction with detergents, which may be unsuitable for studying peripheral membrane proteins that are easily extracted from membranes. Here we present a detergent-free protocol for cellular homogenization by nitrogen cavitation and subsequent separation of cytosolic and membrane-bound proteins by ultracentrifugation. We confirm the separation of subcellular organelles in soluble and pellet fractions across different cell types, and compare protein extraction among several common non-detergent-based mechanical homogenization methods. Among several advantages of nitrogen cavitation is the superior efficiency of cellular disruption with minimal physical and chemical damage to delicate organelles. Combined with ultracentrifugation, nitrogen cavitation is an excellent method to examine the shift of peripheral membrane proteins between cytosolic and membrane fractions.

Here we present protocols for detergent-free homogenization of cultured mammalian cells based on nitrogen cavitation and subsequent separation of cytosolic and membrane-bound proteins by ultracentrifugation. This method is ideal for monitoring the partitioning of peripheral membrane proteins between soluble and membrane fractions.

Azot kavitasyon ve diferansiyel Santrifüjü sağlar periferik membran proteinlerinin kültürlü hücrelerdeki dağılımını izlemek için

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ranging from nanometers to micrometers and microseconds to minutes, respectively. Such a broad range of biological processes challenges conventional microscopy approaches. Here, we detail the procedure for implementing spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) measurements using a classical fluorescence microscope that has been customized. The protocol includes a specific performance check of the svFCS setup and the guidelines for molecular diffusion measurements by svFCS on the plasma membrane of living cells under physiological conditions. Additionally, we provide a procedure for disrupting plasma membrane raft nanodomains by cholesterol oxidase treatment and demonstrate how these changes in the lateral organization of the plasma membrane might be revealed by svFCS analysis. In conclusion, this fluorescence-based method can provide unprecedented details on the lateral organization of the plasma membrane with the appropriate spatial and temporal resolution.

This article aims to present a protocol on how to build a spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) microscope to measure molecular diffusion at the plasma membrane of living cells.

Canlı Hücrelerin Plazma Membranında Moleküler Difüzyonun Analizi için Spot Varyasyon Floresan Korelasyon Spektroskopisi

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Tersinir biyotinilasyon Plazma Membran Protein endositik Oranları Ölçüm

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Biyoloji

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimlerinin Etiketsiz Bir Çalışması

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Biyomühendislik

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. Lipid rafts are membrane microdomains enriched in cholesterol and sphingolipids. They play a role in cellular physiological processes such as signalling, and trafficking1,2 but are also thought to be key players in several diseases including viral or bacterial infections and neurodegenerative diseases3.
Yet their existence is still a matter of controversy4,5. Indeed, lipid raft size has been estimated to be around 20 nm6, far under the resolution limit of conventional microscopy (around 200 nm), thus precluding their direct imaging. Up to now, the main techniques used to assess the partition of proteins of interest inside lipid rafts were Detergent Resistant Membranes (DRMs) isolation and co-patching with antibodies. Though widely used because of their rather easy implementation, these techniques were prone to artefacts and thus criticized7,8. Technical improvements were therefore necessary to overcome these artefacts and to be able to probe lipid rafts partition in living cells.
Here we present a method for the sensitive analysis of lipid rafts partition of fluorescently-tagged proteins or lipids in the plasma membrane of living cells. This method, termed Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), relies on the disparity in diffusion times of fluorescent probes located inside or outside of lipid rafts. In fact, as evidenced in both artificial membranes and cell cultures, probes would diffuse much faster outside than inside dense lipid rafts9,10. To determine diffusion times, minute fluorescence fluctuations are measured as a function of time in a focal volume (approximately 1 femtoliter), located at the plasma membrane of cells with a confocal microscope (Fig. 1). The auto-correlation curves can then be drawn from these fluctuations and fitted with appropriate mathematical diffusion models11.
FCS can be used to determine the lipid raft partitioning of various probes, as long as they are fluorescently tagged. Fluorescent tagging can be achieved by expression of fluorescent fusion proteins or by binding of fluorescent ligands. Moreover, FCS can be used not only in artificial membranes and cell lines but also in primary cultures, as described recently12. It can also be used to follow the dynamics of lipid raft partitioning after drug addition or membrane lipid composition change12.

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

A technique to probe the lipid raft partitioning of fluorescent proteins at the plasma membrane of living cells is described. It takes advantage of the disparity in diffusion times of proteins located inside or outside of lipid rafts. Acquisition can be performed dynamically in control conditions or after drug addition.

Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Süspansiyon Hücre Kültürleri

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler